全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 2期
口蹄疫病毒 VP1基因转化马铃薯及其块茎专一性表达
宋东光
张辉松
聂呈荣
黄林旋
王惠珍
张英慧
何丽烂
邓日烈
(佛山科学技术学院园艺系,佛山 528231)


摘
要:
报道了 FMDV VP1基因与马铃薯块茎专一性表达 class I pa tatin基因 5
区融合, 经农杆菌介导导入马铃薯植株,
PCR、RT
PCR证实了其整合及转录表达。 ELISA结果进一步表明, VP1在转基因马铃薯块茎中具有免疫活性。为探讨在马铃
薯块茎中高表达 VP1蛋白及进一步开发其作为 FMDV口服疫苗生物反应器奠定基础。
关键词:
FMDV VP1基因
转基因马铃薯
块茎专一表达
Specific Expression of VP1 Gene from Foot
and
mouth
Disease V irus in Potato Tuber
Song Dongguang
Zhang Huisong
N ieChengrong
Huang L inxuan
W angH uizhen
Zhang Y inghui
H e L ican
Deng R ilie
(D epartm ent of H orticulture, Foshan University, Foshan 528231)


Abstrac:t
FMDV VP1 genew as fused w ith 5
flank ing reg ion of po tato tuber
spec ific class I patatin gene and transferred into po

tato v iaAgrobacterium
m ediated transform ation. PCR and RT
PCR detec tions confirm ed VP1 integration and transcr iption. EL ISA ana ly

sis show ed VP1 imm unogen ic activ ity in transgenic pota to tubers, the resu lt o f wh ich could lay the foundation for deve loping edib le b io

reacto r using po tato tuber expressing h igh leve lVP1 pro tein.
Key words:
FMDV VP1 gene
T ransgen ic potato
Tuber
spec ific expression
收稿日期: 2010
07
09
基金项目:广东省科技计划资助项目 ( 2006B20101006 )
作者简介:宋东光,博士,副教授,研究方向:植物分子生物学和植物基因工程,生物信息学; E
m ai:l d song@ fosu
edu
cn
转基因植物作为生物反应器生产疫苗的研究近
年来得到了广泛的开展, 并取得了许多重要的进
展 [ 1]。转基因植物表达外源基因产物, 其表达量稳
定性、免疫原性、口服可行性等是开发植物可饲喂疫
苗的关键因素 [ 2 ]。马铃薯作为第四大农作物并易
于进行遗传转化,成为了植物生物反应器的首选材
料 [ 3] ,块茎中高水平表达 class I patatin基因启动子
用于表达外源基因为马铃薯中生产转基因疫苗奠定
了坚实的基础 [ 4]。
口蹄疫 ( foot
and
mou th disease, FMD)是由口蹄
疫病毒 ( foot
and
mouth d iseaseV irus, FMDV)引起的
一种急性、热性、高度接触性传染病, 主要感染偶蹄
兽,如牛、羊等 30多种家畜及野生动物 [ 5]。探讨利
用转基因植物如马铃薯、烟草、番茄、苜蓿、百脉根、
玉米、水稻和胡萝卜植株或叶绿体中表达 O型 FM

DV病毒 VP1衣壳蛋白已进行了许多尝试并取得了
一些重要进展 [ 6]。转基因植物中高水平表达外源
VP1蛋白是开发其作为有效的生物反应器的前提,
为此,本研究利用国内自主克隆的马铃薯块茎专一
性高表达 c lass I patat in的启动子与 VP1基因融合,
通过农杆菌介导获得转 VP1的马铃薯植株,进一步
检测其表达,及其免疫原性, 为开发 FMDV口服疫
苗打下了基础。
1
材料与方法
1
1
菌株、质粒及植物材料
大肠杆菌 E
coli K12菌株 TG1,本实验室保存。
根癌农杆菌 ( Agrobacterium tumefaciens ) LBA4404
( E lectromax
TM
, BRL公司 )。 FMDV VP1载体由西北
农林科技大学农学院提供, 本实验室对其进行测序
后并通过 PCR在其 5
端加上 ATG起始密码子, 长
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 2期
度 830 bp。马铃薯 class I patatin基因 1
4 kb 5
侧翼
区即块茎专一性启动子 ( pPIDG8)由上海复旦大学
遗传所馈赠。本实验室构建了块茎专一性表达启动
子与 VP1融合的表达载体 pPI
VP1。分子克隆方法
参考文献 [ 7 ]。 pGEM 7Zf ( + ) ( Prom ega公司 )、
pMD18
T( TaKaRa公司 )为本实验室保存。马铃薯
(So lanum tuberosum L
cv Desiree) ,由本实验室继代
保存。
1
2
农杆菌介导马铃薯转化
马铃薯植株茎段培养于 MS培养基, 每天光照
16 h,光强约 1 000 lx, 温度 22- 26
。表达载体导
入农杆菌采用的冻溶法及马铃薯转化方法参考文献
[ 8]。转化植株各个株系用塑料盆培养于温室大
棚,块茎置于室内保存。
1
3
PCR、RT
PCR
DNA、RNA 提取, PCR、RT
PCR按照宋东光
等 [ 8]。PCR、RT
PCR扩增 VP1片段的引物, Vp
1F:
5

ATGCTGGCTAGTGCTGGT
3
, Vp
1R: 5

TTACAT

GTCCTCCTGCATCT
3
。
1
4
ELISA
转基因马铃薯室内保存的块茎切块 0
5 g用磷
酸缓冲液 ( PBS, pH7
2, 添加 10 mmol /L EDTA,
0
1% Triton X
100, 10mmo l/L

巯基乙醇, 1 mmol /L
PM SF)提取可溶性蛋白。将 O型口蹄疫抗体液相
阻断 EL ISA检测试剂盒 (购于中国科学院兰州兽医
研究所 )中的液相阻断法改为双抗夹心法用以检测
VP1抗原。 ( 1)包被 ELISA板: 用包被缓冲液稀释
口蹄疫 O型兔抗血清至工作浓度 ( 1
1 000) , 每孔
加 50
L。混匀封板,室温过夜。 ( 2) PBST ( 1
)洗
板 5次,吸水纸甩干,每孔加入稀释的口蹄疫病毒抗
原和待测马铃薯可溶性蛋白提取液各 50
L, 封板,
37
温育 1 h。 ( 3) PBST洗板 5次, 甩干, 用豚鼠抗
血清稀释液稀释豚鼠抗 O型口蹄疫病毒血清至工
作浓度 ( 1
1 000) ,每孔加 50
L, 封板, 37
温育 1
h。 ( 4) PBST洗板 5次,甩干, 用 PBST稀释兔抗豚
鼠酶结合物至工作浓度 ( 1
500) ,每孔加 50
L, 封
板, 37
温育 1 h。 ( 5) PBST洗板 5次, 甩干, 每孔
加 50
L底物溶液, 37
温育 15 m in,每孔加 50
L
1
25 mol /L H 2SO4终止液终止反应, 立即在酶标仪
492 nm波长下读取光吸收值 ( OD492值 )。
2
结果与分析
2
1
FMDV VP1马铃薯块茎专一表达载体 pPI
VP1
的构建
将 FMDV
VP1的 PCR片段直接克隆于 pMD18

T载体后再亚克隆于含有 c lass I patat in基因 5
区
( 1
4 kb)的双元表达载体 pPIDG8(置换其中的 GUS
基因 )中获得了 pPI
VP1表达载体 (图 1)。
E. EcoR I; P. P st I; S. Sa l I; Sp. Sph I; S s. S st I; X. X ba I; Nos
Pro, Nos
ter.胭脂碱合成酶基因转录启动子和终止子; NPT II:新霉素磷酸
转移基因; PAT
I.马铃薯 class I patat in 1. 4 kb启动子; VP1. FMDV VP1 gen e( 830 bp)
图 1
马铃薯块茎专一表达载体 pPI
VP1限制酶图谱
2
2
农杆菌介导 VP1转基因马铃薯的获得
农杆菌感染马铃薯外植体后, 在 RB培养基上
共培养 2- 4 d, 当茎段周围出现明显的白色菌落时
转至选择培养基上, 2周后茎段两端开始膨胀, 绿色
颗粒的抗性愈伤组织出现于茎段切口 (图 2
A ),约
2个月后愈伤上抗性再生植株苗 (图 2
B)。
提取转化及未转化马铃薯植株总 DNA, 对抗性
再生植株进行 VP1的 PCR扩增,抗性植株中获得了
VP1基因的特异性扩增 (图 3)。其中,对 42株抗性
图 2
农杆菌介导 pPI
VP1表达载体转化
马铃薯茎段 ( A)及抗性愈伤再生植株 (B )
108
2011年第 2期

宋东光等:口蹄疫病毒 VP1基因转化马铃薯及其块茎专一性表达
植株进行 PCR扩增, 共有 28株能扩增出约 830 bp
的目的条带, 证实 VP1基因已整合到马铃薯基因
组中。
M. DNA分子量标准; CK. 未转化苗对照; Pm. 含 VP1质
粒; 1- 3.不同抗性再生株系
图 3
抗性植株 VP1片段的 PCR扩增
2
3
转基因马铃薯植株 VP1基因表达的 RT
PCR
检测
利用 VP1特异引物对 PCR阳性的转基因植株
块茎总 RNA进行 RT
PCR检测, 共有 17株转化苗
扩增到了 830 bp阳性条带 (图 4) ,证实了 VP1基因
在转基因植株中得到了正确转录。而以 RNA为模
板直接进行 PCR没有扩增出 VP1阳性条带 (图 4
中 4- 6泳道 ) ,与总 RNA预先进行了 DN ase I处理
有关, 说明总 RNA已没有 DNA模板的污染。
M.分子量标准 DL2000; CK.未转化植株; Pm. VP1质粒;
1- 3. 3株 VP1转基因植株; 4- 6.转基因植株 RNA直接
PCR
图 4
转基因马铃薯植株总 RNA的 RT
PCR检测
2
4
转基因马铃薯表达 VP1的 ELISA检测
提取马铃薯块茎可溶蛋白进行双抗夹心 ELISA
法检测转基因植株块茎中 O型口蹄疫病毒 VP1抗
原,对 17株 RT
PCR阳性植株进行了 ELISA, 两次
重复。 7株表现阳性, OD492最高值为 1
570, 最低值
为 0
719,其他 10株无明显颜色变化,为阴性结果,
图 5为 7株阳性植株的测定 OD492值,结果显示不同
转基因马铃薯株系 VP1抗原蛋白表达量有明显
差异。
CK.未转化植株对照; 1 - 7. EL ISA阳性株系
图 5
转基因马铃薯块茎 VP1抗原表达的 ELISA检测
3
讨论
3
1
FMDV VP1在转基因马铃薯块茎中的表达
转基因马铃薯块茎中能否高水平表达外源目的
蛋白是开发其作为生物反应器的关键,本研究选用
块茎专一性高表达 c lass I patatin基因 5
区表达
FMDV VP1基因,对获得的转 VP1马铃薯块茎中检
测了 VP1的表达。ELISA检测结果 (图 5)显示, 部
分转基因株系能够得到较高水平的表达,块茎中表
达水平的差异可能与外源 VP1基因的插入位点有
关。试验通过在块茎中高表达 VP1蛋白, 为进一步
开发转 VP1基因马铃薯作为口服疫苗奠定了基础,
这也是应用国内自主克隆马铃薯块茎专一性启动子
表达外源基因的又一成功尝试 [ 4]。
3
2
VP1可饲喂疫苗开发的前景
转基因植物生物反应器的应用目前仍处在研发
阶段,可饲喂疫苗的主要瓶颈在于能否诱导口服免
疫作用 [ 1]。本研究虽然获得了高水平表达的 VP1
转基因马铃薯植株,如何进行口服饲喂试验是下一
步的研究重点 [ 6] ,本研究仍将继续进行相关动物口
服免疫试验以观察其效果, 为开发高效转基因马铃
薯生物反应器打下良好的工作基础。
参 考 文 献
[ 1] T acket CO. P lan t
based oral vaccines: resu lts of hum an trials. Curr
T opM icrob iol Imm uno,l 2009, 332 ( 103
117) : 103
17.
[ 2] S ala F, Manu ela R igan oM, B arbante A, et a.l Vaccine an tigen p ro

duction in tran sgen ic p lants: strateg ies, gene constru cts and persp ec

tives. V accine, 2003, 21 ( 7
8 ): 803
8.
(下转第 173页 )
109
2011年第 2期




孔庆胜等: Q scR基因的调控对菌株M. sp. SDM11产 L
丝氨酸的影响
1993 ( 75) : 405
408.
[ 8] KalyuzhnayaMG, L idstrom ME. QscR, a LysR
typ e transcrip tional
regu lator and CbbR
h omo log is involved in regulation of the serine
cycle gen es inM ethylobacterium extorquens AM 1. JB acterio,l 2003,
185( 4 ): 1229
1235.
[ 9] Marx CJ, O
B rien BN, B reezee J, et a.l Novelm ethylotroph genes
ofM e thylobac terium ex torqu en s AM 1 ident ified by us ing transposon
mu tagenes is includ ing a putative dihydrom ethanop terin reductase. J
Bacterio,l 2003, 185 ( 2) : 669
673.
[ 10 ] C h istoserdova LV. Genet ics of the serine cycle inM ethy lobacterium
extorquens AM1: clon ing, sequence, m utation, and phys iological
effect ofg lyA, th e gene for serin e hyd roxym ethyltran sferase. J Bac

terio,l 1994, 176( 21 ): 6759
6762.
[ 11] Tang JL, Gough CL, Barber CE, et a.l M olecu lar clon ing of p rote

ase gene( s) from X an thom onas camp estris pv. campe stris: exp res

sion inE scherich ia coli and role in pathogen icity. M olGen Gen et,
1987, 210 ( 3) : 443
448.
[ 12] Ch istoserdova LV, Lidstrom ME. Pu rif icat ion and characterization
of hydroxypyruvate reductase from th e facu ltat ive m ethylotroph
M ethylobac terium extorquens AM 1. Jou rn al of B acteriology, 1991,
173( 22 ) : 7228
7232.
[ 13] Izum iY, Yosh ida T, Kanzak iH, et a.l Purif icat ion and ch aracter

izat ion of hydroxypyruvate reductase from a serin e produ cing m eth

y lotroph hyphornicrobium m thylovorum GM2. E urop ean Journal of
B iochem isst ry, 1990, 190( 2) : 279
284.
(责任编辑
马鑫 )
(上接第 109页 )
[ 3] Thanavala Y, Lugad e AA. Oral transgen ic p lan t
based vaccin e for
hepatit is B. Imm unolR es, 2010, 46( 1
3) : 4
11.
[ 4 ] 宋东光,陈小英,张辉松,等.转基因马铃薯中人乳铁蛋白的块茎
专一性表达.热带亚热带植物学报, 2008, 16 ( 5) : 430
434.
[ 5] 张永光. 口蹄疫世界流行的特点与防控体系. 中国兽医科技,
2005, 36( 2 ) : 447
452.
[ 6] 吴国华,张强.口蹄疫转基因植物可饲疫苗研究进展.动物医学


进展, 2008, 29( 4) : 65
69.
[ 7] Samb rook J, Ru ssellDW. Molecu lar clon ing: A laboratorym anual( 3 rd
ed. ) [M ] . New York: C old Spring H arbor Laboratory Press, 2001.
[ 8 ] 宋东光,张英慧,杨泉女,等.人降钙素基因相关肽转基因马铃薯
的 RT
PCR分析.中国生物工程杂志, 2003, 23( 9 ) : 96
99.
(责任编辑
李楠 )
173