全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-04-07
基金项目:国家973计划项目(重要农作物品质性状功能基因组学与分子改良的研究,2002CB111302)
作者简介:陈鹏(1975-),男,讲师,博士研究生,从事植物分子生物学研究;E-mail:chenpeng100@yahoo.com.cn
通讯作者:何光源(1958-),男,教授,博导,E-mail:hegy@hust.edu.cn
小麦加工品质很大程度上取决于面团流变学特性,与小麦储藏蛋白的组分紧密相关。一直认为小麦储
藏蛋白包括麦谷蛋白(Glutenin),和麦醇溶蛋白(Gliadin)2大类[1]。麦谷蛋白包括高分子量麦谷蛋白(HMW-
GS)和低分子量蛋白(LMW-GS),而麦醇溶蛋白包括 α,γ,以及 ω等类型。麦谷蛋白通常构成聚合体,而麦
醇溶蛋白通常以单体形式存在[2]。它们通过形成分子内或者分子间二硫键以及肽链内氢键而影响面团的粘
弹性[3,4]。
近几年,随着基因组学和蛋白质组学的发展,在小麦中发现了一类新型的蛋白质。2005年,Wiliam[5]等
人运用双向电泳和质谱技术,在小麦未成熟胚乳中发现了 5个新型蛋白,同年,Dupont[6]等人利用反向高效
液相色谱结合质谱的方法,从小麦胚乳中分离出一个新型蛋白。这些蛋白序列与燕麦储藏蛋白(Avenin)有
较高的同源性。2006年,Kan[7]等人从小麦及其它 3种山羊草中分离出 4个类似 Avenin蛋白的基因。这些基
拟斯卑尔脱山羊草基因的克隆与表达研究
陈鹏 汪长东 黄阜峰 汪越胜 杨广笑 何光源
(华中科技大学生命科学与技术学院中英联合实验室 教育部分子生物物理重点实验室,武汉 430074)
摘 要: Avenin-like基因是近年来发现的一类新基因。根据小麦avenin-like基因的保守序列,设计合成了一对特
异性引物,对拟斯卑尔脱山羊草(Aegilopsspeltoides,SS)的基因组DNA进行avenin-like基因扩增、克隆、序列测定和表达
分析,发现了一个新型avenin-like基因。基因长855bp,编码284个氨基酸残基,分子量约为33kD。Southernblot结果表明
其属于多基因家族。RT-PCR 证实了avenin-like基因在籽粒胚乳中特异性表达。其对应的氨基酸序列含有18个半胱氨
酸残基,可以形成7对分子内二硫键。研究表明Avenin-like蛋白是一类新型的储藏蛋白。这为小麦加工品质的改良提供
了理论依据和遗传资源。
关键词: 拟斯卑尔脱山羊草 Avenin-like 储藏蛋白 基因克隆
CloningandExpressionAnalysisofAvenin-likeGene
inAegilopsspeltoides
ChenPeng WangChangdong HuangFufeng WangYuesheng YangGuangxiao HeGuangyuan
(China-UKHUST-RResGeneticEngineeringandGenomicsJointLaboratoryHuazhongUniversityofScienceand
Technology,Wuhan430074)
Abstract: Avenin-likegeneswerereportedasanew typegeneinrecentyears.Inpresentstudy,onenovel
avenin-likegenewasclonedfrom Aegilopsspeltoides(SS)byanhomologousmethod.Thisgeneis855bpinlength,
encodingaproteinof284aminoacidswithmolecularweightabout33kD.Southernblotresultsshowedthatitbelongs
toamultigenefamily.Theexpresionofavenin-likegenewasrevealedbyRT-PCR.Theresultsshowedtheavenin-like
genewasexpresedspecificalyintheendospermofAegilopsspeltoides.Thecorespondingproteincomprised18cysteine
residueswhichcanbeabletoform 7intramoleculardisulfidebonds.Theseprovideabasisforqualityimprovementof
wheatandanextensivereservoirofgeneticresources.
Keywords: Aegilopsspeltoides Avenin-like Seedstorageprotein Genecloning
2008年第5期
因被称为 avenin-like基因。其对应的蛋白质均与 Avenin蛋白类似,这类蛋白的最大特点是它们都含有较多
的半胱氨酸残基,可能对面粉的加工品有着重要的影响。
山羊草属是与小麦属遗传关系最近的近缘物种,包含着重要的种质遗传资源,其中包含许多抗病、优
质及其它有用基因,这些优良基因在改良小麦时容易利用[8]。Avenin-like蛋白是否在山羊草中都普遍存在,
到目前为止,还没有从 S基因组中分离 avenin-like基因的报道。因此,本研究以二倍体拟斯卑尔脱山羊草
(SS)为材料,进行 avenin-like基因的克隆、序列测定、胚乳中基因表达分析、Southernblot分析。这为揭示
avenin-like基因对小麦加工品质的影响机制,探索小麦品质改良的新途径奠定了理论基础,同时,发掘新的
avenin-like基因,对于丰富小麦品质改良的基因资源有着重要的现实意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 拟斯卑尔脱山羊草(Aegilopsspeltoides)种子由本实验室提供。盆栽于人工气候室。
1.1.2 主要试剂 异硫氰酸胍、CTAB等生化试剂购自 Sigma公司;PfuDNA聚合酶、HincI、dNTP、DNase、
DNAmarker购自 Takara公司;SuperscriptRT
I逆转录试剂盒购自 Promega公司;Southern
Blot相关试剂购自 Roche公司;引物合成、基
因序列测定由北京三博公司完成。引物序列
如表 1所示。
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA和发育中胚乳总 RNA的
提取 基因组 DNA从新鲜植物叶片中用
CTAB方法提取。根、茎、叶、花以及发育中胚
乳总 RNA的提取采用异硫氰酸胍法提取。并
用 DNase去除 DNA得到高质量的总 RNA。DNA与 RNA的浓度和纯度的测定用紫外分光光度计与琼脂糖
凝胶电泳法。
1.2.2 基因克隆与序列测定 cDNA的制备采用 SuperscriptRTI逆转录试剂盒(Promega),将 oligo(dT)引
物、dNTP、总 RNA(DNA-free)和 RNase-freeH2O混合后,于 65℃温育 5min,冰浴 1min,然后加入 5×First
strandbufer、DTT和 SuperscriptRTI,混匀后于 50℃温育 1h。逆转录反应一结束立即将样品加热至 70℃,
保温 15min使逆转录酶失活,置于冰上迅速冷却。所得的 cDNA即可用于基因扩增。
以基因组 DNA或者 RNA逆转录产物 cDNA为模板,用特异性引物(Ave-F和 Ave-R)扩增 avenin-like
基因,PCR扩增采用 50μl反应体系,高保真 PfuDNA聚合酶。反应液首先加热至 95℃预变性 5min,开始循
环反应:95℃45s;54℃60s;72℃90s;35个循环后,于 72℃继续延伸反应 10min。PCR扩增反应时同时设立
阴性对照,以蒸馏水为模板。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离纯化、回收得到纯化基因产物。将基因与 pMD18-T载体连接,再经过
转化感受态细胞、质粒抽提、质粒鉴定,获得的阳性质粒即可进行序列测定。
1.2.3 avenin-like基因表达模式研究 采用 RT-PCR的方法研究 avenin-like基因表达模式。分别以来源于
不同组织(根、茎、叶、花、未成熟胚乳)cDNA为模板,50μl反应体系中同时加入两对引物,用 RT-F和 RT-R
为引物扩增 avenin-like基因片段;β-actin基因作为内参基因,扩增引物为 Actin-F和 Actin-R。优化 PCR循
环数以确保反应停止在对数增长期,取等量反应产物点样。
1.2.4 Southernblot分析 基因组 DNA分别经 HincI或者 HhaI(酶切位点位于 avenin-like基因内)彻底
酶解后,先进行琼脂糖凝胶电泳和 Southern印迹转至尼龙膜上,再经过预杂交、地高辛探针杂交、洗膜、化
表 1 avenin-like和 β-actin基因扩增的引物序列
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
学荧光检测,进行基因组 DNA中 avenin-like基因拷贝数的分析。地高辛探针采用 PCR扩增的方法合成,以
Southern-F和 Southern-R为引物,PCR扩增得到 228bp的地高辛标记 DNA片段用作探针。
2 结果
2.1 拟斯卑尔脱山羊草中新型的 avenin-like基因
以基因组 DNA为模板,用特异性引物(Ave-F和 Ave-R)扩增 avenin-like基因,得到一特异性的条带
(图 1)。对该基因片段进行凝胶回收、克隆后测序。基因提交到 GenBank,基因序列号:EU096539。基因 CDS
区长 855bp,编码 284个氨基酸残基,推测分子量约为 33kD。序列分析表明,N-末端前 18个氨基酸残基为
信号肽序列[9](图 2)。Avenin-like蛋白最大的特点是其中含有 18个半胱氨酸残基,比以前报道的都要多。
具有典型的“Cys-Cys”结构域预[10],测形成 7对分子内二硫键,另外,4个半胱氨酸残基则可能和其它蛋白
质分子形成分子间二硫键。
图 1 拟斯卑尔脱山羊草基因组 DNA
中 avenin-like基因扩增
M.DNAmarker1.阴性对照 2.拟斯卑尔脱
山羊草基因组 DNA的 avenin-like基因扩增
图 2 拟斯卑尔脱山羊草中新型 avenin-like基因核苷酸序列和推
导的氨基酸序列
2.2 avenin-like基因表达模式分析
关于 avenin-like基因的表达模式,目前还未见相关的报道,故有必要弄清其表达的特点。提取不同组
织的总 RNA,通过 RT-PCR研究拟斯卑尔脱山羊草中 avenin-like基因的表达模式。用 RT-F和 RT-R为引
物扩增 avenin-like基因片段,用 Actin-F和 Actin-R引物扩增内参 β-actin基因片段。产物大小分别为
187bp和 582bp(图 3)。可见 avenin-like基因只在胚乳中特异性表达。
2.3 avenin-like基因属于多基因家族
为了研究拟斯卑尔脱山羊草中 avenin-like基因是属于单拷贝基因还是属于多基因家族。拟斯卑尔脱
山羊草基因组 DNA分别经 HincI或者 HhaI彻底酶解之后,进行 SouthernBlot分析。用 Southern-F和
Southern-R为引物 PCR扩增地高辛探针,检测转移至尼龙膜上的基因组 DNA中 avenin-like基因(图 4)。表
明 avenin-like基因属于多基因家族。
图 3 RT-PCR分析拟斯卑尔脱山羊草中
avenin-like基因的表达模式
M.DNAmarker1.未成熟幼胚 2.根 3.茎
4.叶片 5.花 6.阴性对照
图 4 拟斯卑尔脱山羊草 avenin-like
基因 SouthernBlot分析
1.阴性对照 2.HincI酶解基因组 DNA
3.HhaI酶解基因组 DNA
箭头表示推测的成熟肽链的起始位置。半胱氨酸残基用下划线标出
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3 讨论
在小麦品质改良方面,除了以栽培小麦为研究材料之外,以近缘野生物种为研究材料,开发新的种质
资源,已经引起了研究者们的极大兴趣[11]。作为小麦的野生物种,山羊草属除了拥有小麦 D基因组的供体-
粗山羊草之外,还包括 C、M、S、U等基因组,是一个丰富的品质改良基因资源库。可以通过基因工程手段
对这些野生物种进行相关品质基因加以利用以改善小麦品质。
avenin-like基因是近年来在小麦中发现的类似于燕麦储藏蛋白 Avenin的一类新型的蛋白,其高含量
的半胱氨酸残基可能形成分子内二硫键,同时还可能会同其它储藏蛋白分子如高分子量麦谷蛋白亚基
(HMW-GS)、低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)以及醇溶蛋白(Gliadin)形成分子间二硫键。从而影响面粉
的加工品质。故 avenin-like基因可以作为改良小麦加工品质的重要候选基因。通过构建胚乳特异性表达载
体,实现 Avenin-like蛋白的过量表达。这将有助于改良小麦的加工品质。
目前还未见在 S基因组中克隆 avenin-like基因的报道。本研究以拟斯卑尔脱山羊草为研究对象,克隆
得到一个新型 avenin-like基因。序列分析表明可能属于一类新的储藏蛋白,因为和其它的储藏蛋白有如下
类似点:首先,它们都含有 N末端信号肽序列,而且序列一致性很高。其次,它们的脯氨酸(P)和谷氨酰氨
(Q)残基的含量都非常高,同时含有保守的“Cys-Cys”结构。第三,avenin-like基因只在发育的胚乳中特异性
表达。第四,avenin-like基因也属于多基因家族。
Southernblot结果显示 avenin-like基因属于多基因家族,这与以前报道的其它储藏蛋白基因很相似[12]。
说明可以通过构建基因文库或者其它手段克隆得到更多的 avenin-like基因家族的其它成员。而且,avenin-
like基因也有可能在其它的小麦近源物种基因组中存在,这些都有待更加深入的研究。
参考 文献
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