全 文 ：核 农 学 报　 ２０１３，２７（１１）：１６１０ ～ １６１６
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０３⁃１９　 接受日期：２０１３⁃０５⁃１７
基金项目：河北省应用基础研究计划重点基础研究项目（１１９６０１４５Ｄ），河北省人力资源和社会保障厅博士后科研资助项目（２００９），中巴政府间
科技合作项目（１６⁃４０８）
作者简介：苏集华，女，主要从事植物资源评价、利用与创新研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｓｕｊｉｈｕａ． ｏｋ＠ １６３． ｃｏｍ
通讯作者：姚占军，男，教授，主要从事小麦遗传育种研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｙｚｈｊ２０１＠ １６３． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１３）１１⁃１６１０⁃０７
小麦和拟斯卑尔脱山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ Ｔａｕｓｃｈ． ）
异源融合体形成的技术体系建立
苏集华１ 　 王　 莉１，２ 　 秦金燕１ 　 姚占军１
（ １河北农业大学农学院 ／河北省种质资源重点实验室，河北 保定　 ０７１００１； ２ 石家庄以岭药业股份有限公司，河北 石家庄　 ０５００３５）
摘　 要：通过 ＰＥＧ诱导小麦和山羊草属间原生质体融合试验，建立高效的异源融合体形成技术体系，为
小麦抗病育种提供中间材料。 利用中性红、ＦＤＡ、罗丹明 Ｂ三种染色剂分别对小麦成熟胚及叶片和拟斯
卑尔脱山羊草叶片的原生质体进行染色，通过观察比较不同染剂和材料的组合对原生质体的分辨效果，
确定各个材料的最佳染剂，根据酶解时间对原生质体质量以及原生质体密度对融合率的影响，确定最佳
酶解时间和融合密度。 结果表明：ＦＤＡ适于染色小麦成熟胚，紫外光下，有活力原生质体（不含叶绿体）
发出绿色荧光；罗丹明 Ｂ适于染色小麦和拟斯卑尔脱山羊草的叶片，紫外光下，原生质体发出红色荧
光；中性红染色效果相对较差，故选用小麦成熟胚和拟斯卑尔脱山羊草叶片进行原生质体融合。 原生质
体解离时间以 ４ｈ为宜，此时原生质体的活力高达 ８６􀆰 ２％ ；原生质体融合的最佳密度为 １０ × １０６ 个·
ｍＬ － １，此时异源融合率高达 １６􀆰 １％ 。 利用筛选得到的 ＦＤＡ 和罗丹明 Ｂ 分别对小麦成熟胚和拟斯卑尔
脱山羊草叶片的原生质体进行染色，可有效辨别异源融合体；酶解时间 ４ｈ、融合密度 １０ × １０６ 个·ｍＬ － １
时，可获得较高活力的原生质体，利于异源融合体的形成。
关键词：小麦；拟斯卑尔脱山羊草；原生质体；异源融合体
　 　 小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ． ）是重要粮食作物，小麦
遗传资源多样性是小麦生产持续发展的命脉。 由于小
麦育种上大量使用少数骨干亲本，导致小麦抗性遗传
基础狭窄。 面对突发性病虫害，小麦自身的缓冲能力
不强，提高小麦抗性成为当今小麦育种中亟待解决的
问题。 山羊草属（Ａｅｇｉｌｏｐｓ Ｌ． ）均为一年生野生杂草，
是小麦近缘植物中与小麦亲缘关系最为密切的属，蕴
含许多抗病、抗虫、抗寒等抗性基因，将其有益基因导
入小麦中，可拓宽小麦抗性谱。 山羊草和小麦属间虽
然有一定的可交配性，但仍然有杂交不实、杂种夭亡与
不孕的障碍［１ － ３］。
２０ 世纪 ６０ 年代原生质体融合技术的出现打破了
物种间的生殖隔离，在一定程度上克服远缘杂交的不
亲和性，可以获得体细胞杂种，不仅可以转移细胞核遗
传物质，还可转移细胞质中 ＤＮＡ，改良品种和创制新
的杂交种。 目前，通过该技术已获得小麦族属间体细
胞杂种或再生植株。 Ｓｚａｒｋａ 等［４］通过 ＰＥＧ 诱导融合
法获得小麦和玉米再生植株。 刘广华［５］、Ｇｅ等［６］利用
原生质体杂交技术分别获得了小麦与鹅观草的体细胞
杂种细胞系、小麦和多花黑麦草的杂种再生植株，为小
麦育种提供了基础材料。 山东大学夏光敏课题
组［７ － １０］历经十多年系统研究，将普通小麦“济南 １７７”
原生质体分别与经紫外线照射的簇毛麦、长穗偃麦草
（高冰草）、多花黑麦草等的原生质体融合获得外形偏
向于小麦的杂种植株，为小麦育种提供中间材料，同时
育成高产、耐盐、抗旱小麦品种山融 ３ 号及两个小麦新
品系，已达到国际领先水平。 赵镝［１１］曾利用原生质体
融合技术获得了小麦和粗山羊草杂种愈伤组织，同时
实现了粗山羊草部分染色体转入小麦中。 迄今为止，
有关小麦与山羊草属间原生质体融合及其影响因素，
杂种细胞及其再生植株的报道仅限于此。
目前，小麦种属间原生质体融合存在的融合率低、
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　 １１ 期 小麦和拟斯卑尔脱山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ Ｔａｕｓｃｈ． ）异源融合体形成的技术体系建立
耗费大，有效融合少等问题，是限制其杂种细胞和再生
植株获得的主要瓶颈。 实现原生质体高效融合的前提
是获得高产量和高活力的原生质体，而原生质体产量
和活力在很大程度上取决于材料来源、酶解时间、融合
液配比等因素。 只有将这些因素搞清楚，获得较高活
力和得率的异源融合体，后续植株再生，抗性材料的筛
选工作才能顺利开展。 本试验以小麦铭贤 １６９ 的成熟
胚及叶片和拟斯卑尔脱山羊草 （ Ａｅ． ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ
Ｔａｕｓｃｈ． ） Ｙ２１５５ａ的叶片为材料，采用中性红（ｎｅｕｔｒａｌ
ｒｅｄ）、二乙酸荧光素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ，ＦＤＡ）和罗丹
明 Ｂ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）三种不同性质的染色剂对其原生
质体染色效果进行分析和比较，筛选出最优染剂和融
合材料；通过对异源融合体形成因素的摸索，为小麦属
间原生质体的高效融合提供基础数据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 植物材料
供试材料为小麦铭贤 １６９ 和拟斯卑尔脱山羊草
Ｙ２１５５ａ。 拟斯卑尔脱山羊草具有高抗条锈、抗叶锈、
抗白粉、耐瘠薄、耐盐碱等优良性状。 将铭贤 １６９ 种子
浸泡于培养皿中 ２ｄ，露白后，切取小麦成熟胚备用。
将 Ｙ２１５５ａ和铭贤 １６９ 的种子播在盆钵中，８ ｄ左右，剪
取完全展开的第二片叶用作原生质体的分离材料。
１􀆰 ２　 原生质体的分离和融合
将备用材料切碎后放入含有酶解液的离心管中进
行原生质体的解离。 酶液组成为 ＣＰＷ１３Ｍ 溶液（含
１３％甘露醇的 ＣＰＷ盐溶液） ［１２］附加 １０ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ＭＥＳ
［２，（Ｎ － 玛琳） － 乙烷磺酸］、１％ （ ｗ ／ ｖ）纤维素酶
Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｒ － １０ （日本）、０􀆰 １％ （ｗ ／ ｖ）果胶酶 Ｐｅｃｔｉｎａｓｅ
（日本），ｐＨ值 ６􀆰 ０。 酶解过程在 ２５℃恒温箱中黑暗条
件下进行。 原生质体的融合采用 ＰＥＧ６０００ 结合高
Ｃａ２ ＋ －高 ｐＨ 法［１３］。 取等体积稀释后的原生质体溶
液，混合均匀。 吸取 １００μＬ 混合悬浮液至载玻片上，
静置 ２０ｍｉｎ，使原生质体沉降，贴近载玻片。 沿原生质
体混合液薄层边缘滴加 １００μＬ ２５％ （ｗ ／ ｖ）ＰＥＧ６０００ 融
合溶液，静置 １５ｍｉｎ，使双亲原生质体相互靠近，然后
沿薄层边缘滴加 ５ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ＣａＣｌ２ 洗涤液 ２００μＬ，洗涤
１０ｍｉｎ，促使原生质体融合，最后再重复一次 ＣａＣｌ２ 洗
涤步骤。
１􀆰 ３　 不同原生质体密度的测定及制备
吸取小麦和拟斯卑尔脱山羊草游离的原生质体，
置于离心管中，滴加少量提取液在血球计数板上，在光
学显微镜下观察计数，依照式（１）计算原生质体密度，
重复测定 ４ 次取平均值。 根据测得的原生质体密度
值，用 ＣＰＷ１３Ｍ稀释，制备 １ × １０６、５ × １０６、１０ × １０６ 和
５０ × １０６ 个·ｍＬ － １等四种不同密度原生质体。
原生质体密度（个·ｍＬ － １） ＝ （８０ 小格内原生质体
总数 ／ ８０） × ４ × １０６ （１）
１􀆰 ４　 原生质体的染色观察
１􀆰 ４􀆰 １　 ０􀆰 １％ （ｗ ／ ｖ）中性红染色　 取 １ｍＬ酶解得到的
原生质体悬浮液置于离心管，加入 ５０μＬ 的中性红染
剂（蒸馏水配制），混合均匀，静置染色 ２ｍｉｎ。 ５００ｒ·
ｍｉｎ － １ 离 心 ３ｍｉｎ， 弃 去 上 清 液， 再 向 管 中 加 入
ＣＰＷ１３Ｍ，混合均匀，５００ｒ·ｍｉｎ － １离心 ３ｍｉｎ，如此重复
２ 次。 最后弃上清，加入 ＣＰＷ１３Ｍ混匀，备用。
１􀆰 ４􀆰 ２　 ＦＤＡ和罗丹明 Ｂ染色　 取制备好的原生质体
悬浮液 １ｍＬ置于离心管，加入 ５ｍｇ·ｍＬ － １ ＦＤＡ（丙酮配
制）和 ５ｍｇ·ｍＬ － １罗丹明 Ｂ（蒸馏水配制）母液至工作
浓度 ０􀆰 ０１％ ，２５℃避光静置 ３０ｍｉｎ。 ５００ｒ·ｍｉｎ － １离心
３ｍｉｎ，弃去上清， 用 ＣＰＷ１３Ｍ 洗涤 ２ 次后， 再用
ＣＰＷ１３Ｍ补齐至原体积，备用。
经过染色处理的原生质体分别在普通光和荧光下
进行显微观察，照相。
１􀆰 ５　 原生质体活力及异源融合率的测定
取不同处理制备的原生质体液，置于 １􀆰 ５ｍＬ 离心
管，染色后在 Ｏｌｙｍｐｕｓ⁃ＢＸ５１ 型显微镜（日本）下观察、
计数。 按式（２）计算原生质体活力［１４］。 根据测定的原
生质体密度稀释双亲的原生质体液，按 １∶ １的比例，进
行原生质体融合，ＣａＣｌ２ 洗涤液洗涤两次，１０ｍｉｎ 后在
显微镜下观察计数，重复测定 ３ 次，依式（３）计算异源
融合率。
原生质体活力 ＝有活力的的原生质体数 ／原生质
体总数 × １００％ （２）
异源融合率 ＝异源融合的原生质体数 ／原生质体
总观察数 × １００％ （３）
２　 结果与分析
２􀆰 １　 中性红、ＦＤＡ和罗丹明 Ｂ对原生质体的染色
在普通光下，ＦＤＡ 不能使原生质体染色；荧光下
有活力的原生质体发出绿色荧光，染色清晰，无活力原
生质体不能分解 ＦＤＡ，不能发出荧光。 由于叶片的原
生质体含有叶绿体，若用 ＦＤＡ 染色，则叶绿体会对观
察结果产生影响（有活力的叶肉原生质体呈现红色荧
光）。 故用 ＦＤＡ作为小麦成熟胚的染剂，以减少叶绿
体对结果的影响（图 １ － ａ、ｂ）。 经罗丹明 Ｂ染色，在普
通光下观察，原生质体内的细胞核被染上深红色，也有
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核　 农　 学　 报 ２７ 卷
个别颗粒状内含物被染上淡红色；在荧光下观察，整个
原生质体都发出红色荧光，其中细胞核发出强烈的桔
红色荧光（图 １ － ｃ）。 在普通光下对中性红（非荧光染
料）染色的原生质体观察发现，中性红的染色时间极
难掌握，短时间染色无法使原生质体完全着色，而染色
时间稍长会将破碎的原生质体一并染成红色，对染色
结果的观察有严重影响（图 １ － ｄ、ｅ）。
试验结果表明，选用 ＦＤＡ和罗丹明 Ｂ组合分别对
小麦成熟胚和山羊草叶片原生质体进行染色，观察异
源融合体。
２􀆰 ２　 不同酶解时间下原生质体的解离效果
用 １％纤维素酶，０􀆰 １％果胶酶的混合酶液游离小
麦成熟胚和拟斯卑尔脱山羊草叶片的原生质体。 结果
表明，酶解时间过短，原生质体得率低，时间过长则导
致较早游离出来的原生质体变形，活力下降，甚至破
裂，得率也不高。 酶解 １ ｈ 仅有少量原生质体游离出
来，随着时间的延长，原生质体的产量逐渐增加，原生
质体活力逐渐降低，同时细胞碎片逐渐增多，易发生自
体融合。 酶解 ４ ｈ 后有活力的原生质体密度为 ５􀆰 ３２
× １０７个·ｍＬ － １，５ ｈ和 ６ ｈ 原生质体产量增加不明显，
原生质体活力降为 ６１􀆰 ４％ ，并且细胞碎片急剧增多，
因此酶解时间以 ４ ｈ 为宜，此时原生质体活力高达
８６􀆰 ２％ （表 １）。
表 １　 酶解时间对原生质体解离的影响
Ｔａｂｌｅ １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
酶解时间
Ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ／ ｈ
原生质体密度
Ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ／ （ × １０７ ｃｅｌｌ·ｍＬ － １）
活力
Ｌｉｖａｂｉｌｉｔｙ ／ ％
细胞碎片
Ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ
１ ０． ４４ ９０． ６ 很少 ｌｉｔｔｌｅ
２ １． ９２ ８８． ５ 很少 ｌｉｔｔｌｅ
３ ２． ９０ ８６． ７ 很少 ｌｉｔｔｌｅ
４ ５． ３２ ８６． ２ 少 ｆｅｗ
５ ５． ４６ ７０． ３ 少 ｆｅｗ
６ ５． ７２ ６１． ４ 多 ｍａｎｙ
２􀆰 ３　 不同原生质体密度下异源融合率的变化
原生质体密度在 １ × １０６ ～ ５０ × １０６ 个·ｍＬ － １范围
内的试验结果见图 ２。 从图 ２ 可知，随着原生质体密
度增大，总的融合率呈上升趋势，特别是在 １０ × １０６ 个
·ｍＬ － １以下时上升显著，在 ５０ × １０６ 个·ｍＬ － １时融合效
果有所下降，原生质体密度为 １０ × １０６ 个·ｍＬ － １时融
合效果最好，异源融合率高达 １６􀆰 １％ 。 可见异源融合
率并非随原生质体密度的增大而增加，调至合适的原
生质体密度是提高融合率的一个重要步骤，但是密度
已不是限制融合率的主要因子。
２􀆰 ４　 异源融合体的观察
在紫外光下观察发现，小麦成熟胚原生质体经
ＦＤＡ染色后，发出绿色荧光；拟斯卑尔脱山羊草叶片
原生质体经罗丹明 Ｂ 染色后，发出红色荧光，而形成
的异源融合体在紫外光下则发出黄色或橙红色的荧
光。 同时可以观察到异源融合体体积较双亲原生质体
体积明显增大（图 １ － ｆ）。
３　 讨论
３􀆰 １　 试验材料的选取
目前植物上用于分离原生质体的材料很多，最常
用的是叶片、愈伤组织及悬浮细胞系。 其中胚性愈伤
组织或胚性悬浮细胞系是最理想的分离材料，但其培
养周期长，培养条件要求严格，前期耗费较大。 本试验
中选取小麦成熟胚及叶片和拟斯卑尔脱山羊草的叶片
用作原生质体的分离材料，其中由于拟斯卑尔脱山羊
草成熟胚较小，取材不方便，故未选用。 试验所用材料
培养条件简单，只要种子量供应充足，便可短时间内获
得大量的分离材料，耗费相对较小。
３􀆰 ２　 染色对异源融合体观察的影响
对原生质体进行染色观察不仅是检测原生质体活
力的重要方法，也是观察异源融合体的重要手段。 试
验所用的三种染色剂在染色效果上存在差异，本研究
最终选用筛选得到的 ＦＤＡ 和罗丹明 Ｂ 分别对小麦成
熟胚和拟斯卑尔脱山羊草叶片的原生质体进行染色标
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　 １１ 期 小麦和拟斯卑尔脱山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ Ｔａｕｓｃｈ． ）异源融合体形成的技术体系建立
注： ａ． ＦＤＡ对小麦叶片染色（１００ × ）； ｂ． ＦＤＡ对小麦成熟胚染色（１００ × ）； ｃ． 罗丹明 Ｂ对拟斯卑尔脱山羊草叶片染色（４００ × ）；
ｄ． 中性红对小麦叶片短时间染色（２００ × ）； ｅ． 中性红对小麦叶片长时间染色（２００ × ）； ｆ． 融合后发黄光的异源融合体（箭头 Ａ），
发绿光的小麦成熟胚原生质体（箭头 Ｂ）， 发红光的拟斯卑尔脱山羊草叶片原生质体（箭头 Ｃ）（４００ × ）。
Ｎｏｔｅ：ａ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｌｅａｆ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ＦＤＡ（１００ × ）． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｉｎ ｇｒｅｅｎ； ｂ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ
ＦＤＡ（１００ × ）． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｉｎ ｇｒｅｅｎ； ｃ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ Ａｅ． ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ． ｌｅａｆ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（４００ × ）． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｉｎ ｒｅｄ； ｄ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｌｅａｆ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ ｉｎ ａ ｓｈｏｒｔ ｔｉｍｅ（２００ × ）； ｅ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｌｅａｆ ｌａｂｅｌｅｄ ｂｙ ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ ｉｎ ａ
ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ（２００ × ）； ｆ． Ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎｓ ｆｒｏｍ ａ Ｍｉｎｇｘｉａｎ１６９ ＋ Ｙ２１５５ａ ｆｕｓｉｏｎ． Ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｉｎ ｙｅｌｌｏｗ （ ａｒｒｏｗ Ａ），ｗｈｅａｔ ｍａｔｕｒｅ
ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｉｎ ｇｒｅｅｎ（ａｒｒｏｗ Ｂ）， Ａｅ． ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ． ｌｅａｖｅｓ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｉｎ ｒｅｄ（ａｒｒｏｗ Ｃ） （４００ × ）．
图 １　 各染色剂的染色效果
Ｆｉｇ． １　 Ｄｙｅｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄｙｅｓ
记，可有效辨别异源融合体。 试验所用中性红是一种
弱阳离子活体染料，活体组织或细胞染色时常用，可以
把带有一定负电荷的原生质及细胞核染成红色。 在用
中性红进行染色时，染色时间很难掌握，短时间不易着
色，长时间原生质体易破裂，使得破碎的原生质体也带
上颜色，因此中性红不适用。 而马新业等［１５］在进行荔
枝种内原生质体电融合参数研究时，利用中性红染色
单方融合亲本原生质体可有效分辨异源融合体。 这可
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图 ２　 原生质体密度对融合率的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｎ ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ
能与选用材料的特性（对于染料的敏感程度不同）有
关。 在利用 ＦＤＡ和罗丹明 Ｂ染色时，二者染色效果均
较好，原生质体轮廓清晰，区分度高。 由于拟斯卑尔脱
山羊草叶片含有叶绿体，故选用罗丹明 Ｂ 染色（发出
红色荧光），而用 ＦＤＡ染色小麦成熟胚原生质体（发出
绿色荧光），紫外光下根据不同荧光可有效辨别双亲
原生质体。 向太和等［１６］分别用罗丹明 Ｂ 和 ＦＤＡ对粳
稻 ０２４２８ 和籼稻 ９０ＡＬ４ 原生质体进行染色，观察到不
同来源原生质体的融合情况，可有效辨别出不同的融
合体类型。 李玉珠等［１７］在利用 ５ 种荧光染料对苜蓿
原生质体染色效果的研究中报道 ＦＤＡ 和罗丹明 Ｂ 可
使紫花苜蓿原生质体清晰染色，在荧光下发出不同的
荧光，可用于原生质体融合时亲本原生质体的标识。
本研究中同样使用 ＦＤＡ －罗丹明 Ｂ 双染料染色系统
进行有活力异源融合体的观察。
３􀆰 ３　 酶解时间和融合密度对原生质体融合效果的影
响
原生质体融合主要受原生质体的质量、融合方法
和融合条件影响。 材料来源、酶解时间、融合密度及融
合液配比等都会不同程度地影响融合效果。 本实验室
曾对融合液配比进行正交设计优化，当融合液配比为
２５％ （ ｗ ／ ｖ） ＰＥＧ， ０􀆰 ５ｍｏｌ·Ｌ － １ 蔗糖， ｐＨ 值 ６􀆰 ０、 ０􀆰 ５
ｍｍｏｌ·Ｌ － １ＣａＣｌ２ 时，异源融合体得率最高，相关研究结
果已发表［１３］，本研究是在其基础上进行补充与完善。
研究结果表明采用 ＰＥＧ６０００ 结合高 Ｃａ２ ＋ －高 ｐＨ 法
对小麦成熟胚和拟斯卑尔脱山羊草叶片原生质体进行
融合，当酶解时间为 ４ｈ、融合密度为 １０ × １０６ 个·ｍＬ － １
时，可获得较高活力的原生质体，同时利于异源融合体
的形成。
酶解时间决定游离出的原生质体的产量和活力。
酶解是利用纤维素酶、果胶酶等消化细胞壁，使得原生
质体游离出来。 酶解时间过短，细胞壁酶解不充分，原
生质体形成不完全，影响原生质体的制备与纯化；酶解
时间过长，质膜受到损伤［１８ － １９］，原生质体的活力降低，
影响原生质体的融合效果。 本研究结果也表明，经过
４ｈ 黑暗酶解，可游离出较高产量和活力的原生质体，
细胞碎片等杂质也较少。 而夏光敏等［２０］利用小麦悬
浮细胞系分离原生质体，酶解时间多在 ２ ～ ４ｈ 之间。
张小红等［２１］研究发现小麦胚性愈伤组织在 ４ ～ ６ｈ 酶
解效果较好，可获得较高产量和活力的原生质体。 可
见，同种植物在不同生理状态下的酶解时间略有差异，
但是差别不大。 Ｈｕａｎｇ 等［２２］在对黄瓜高效瞬时转化
系统影响因素研究中综合考虑原生质体产量和活力及
细胞碎片情况得出黄瓜的最佳酶解时间为 ８ ～ １０ｈ，可
以提高原生质体的转化效率。 赵小强等［２３］利用草地
早熟禾橄榄球 ２ 号形成的胚性愈伤组织分离原生质体
时发现酶解时间为 １４ ～ １７ｈ，原生质体的产量和活力
达到最大值，分别为 ３􀆰 ２３ × １０６ 个·ｇ － １和 ７９􀆰 ３％ 。 李
玉珠等［２４］通过用百脉根里奥无菌苗子叶及由下胚轴
和子叶形成的胚性愈伤组织为供体材料，进行原生质
体游离，发现最佳酶解时间分别为 ６ｈ 和 １２ｈ。 说明不
同植物原生质体分离所需酶解时间不尽相同，应根据
试验材料进行摸索，才能获得较高的原生质体产量和
活力，为原生质体的高效融合提供良好的材料。
原生质体密度也是影响染色观察和融合效果的主
要因素之一。 在本试验中，小麦成熟胚与山羊草叶片
原生质体在 １∶ １情况下，双亲原生质体密度为 １０ × １０６
个·ｍＬ － １时，融合效果最好，异源融合率高达 １６􀆰 １％ 。
这是由于低密度使得原生质体间空间距离远，融合率
降低；高密度使得原生质体间空间距离变小，融合率增
加，但是易引起原生质体相互粘连［２５］，自体融合和多
核融合体产生机率也随之增加，影响融合效果。 本研
究与 Ｎａｖｒáｔｉｌｏｖá［２６］，Ｂａｔｅｓ［２７］的报道结果一致，随着融
合亲本原生质体密度增加，异源融合率也逐渐增大。
虽然较低密度融合率低，但多为有效融合；高密度，融
合率虽高，但多为无效融合。
本试验最终选取小麦成熟胚和拟斯卑尔脱山羊草
叶片原生质体进行融合，不仅取材简单方便，而且耗费
少；利用 ＦＤＡ －罗丹明 Ｂ进行双染料染色观察异源融
合体简便快捷；通过对酶解时间、融合密度的优化，获
得了较高活力的原生质体（８６􀆰 ２％ ）和较高的异源融
合率（１６􀆰 １％ ）。 本技术体系获得的相关数据对拟斯
卑尔脱山羊草及山羊草属其他野生植物有益抗性基因
（抗旱、抗病、抗虫基因等）导入小麦，培育抗旱、抗病、
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　 １１ 期 小麦和拟斯卑尔脱山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ Ｔａｕｓｃｈ． ）异源融合体形成的技术体系建立
抗虫小麦新种质具有一定的指导意义。
４　 结论
本试验以小麦成熟胚和叶片及拟斯卑尔脱山羊草
的叶片为研究材料，选用三种染料：中性红，ＦＤＡ 和罗
丹明 Ｂ，分别对酶解获得的原生质体进行染色，测定不
同酶解时间下原生质体产量和活力，同时观察测定 １
× １０６、５ × １０６、１０ × １０６ 和 ５０ × １０６ 个·ｍＬ － １四种密度
下原生质体染色后的异源融合率，最终确定最佳的处
理组合、酶解时间及融合密度。 结果表明：中性红不适
合本试验，ＦＤＡ 染色小麦的胚，罗丹明 Ｂ 染色拟斯卑
尔脱山羊草的叶片，最适酶解时间为 ４ ｈ，最适融合密
度为 １０ × １０６ 个·ｍＬ － １，可获得较高活力和得率的异
源融合体。
参考文献：
［ １ ］　 叶兴国． 普通小麦与外源种属可交配性研究综述［ Ｊ］ ． 宁夏农
林业科技， １９９１， （２）： １６ － ２０
［ ２ ］　 陈天佑， 刘大钧． 山羊草（Ａｅｇｉｌｏｐｓ）与普通小麦间杂交及减数分
裂的观察［Ｊ］ ． 南京农业大学学报， １９８５， （２）： ８ － １６
［ ３ ］　 吕爱枝，赵和，王天宇，王海波． 基因从普通小麦向山羊草属植
物漂移可能性研究［Ｊ］ ． 植物遗传资源学报， ２０１１， １２（２）： ２５５
－ ２５８， ２７０
［ ４ ］　 Ｓｚａｒｋａ Ｂ， Ｇöｎｔéｒ Ｉ， Ｍｏｌｎáｒ － Ｌáｎｇ Ｍ， Ｍóｒｏｃｚ Ｓ， Ｄｕｄｉｔｓ Ｄ． Ｍｉｘｉｎｇ
ｏｆ ｍａｉｚｅ ａｎｄ ｗｈｅａｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｂｙ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｔｅｒｉｌｅ ｍａｉｚｅ ｐｌａｎｔｓ ［ Ｊ ］ ． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００２， １０５（１）： １ － ７
［ ５ ］　 刘广华． 拟南芥与川西獐牙菜及小麦与鹅观草体细胞杂种的遗
传研究［Ｄ］． 济南： 山东大学， ２００６
［ ６ ］ 　 Ｇｅ Ｔ Ｍ， Ｌｉｎ Ｘ Ｈ， Ｑｉｎ Ｆ Ｌ， ＹＵ Ｓ Ｗ， ＹＵ Ｙ Ｊ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｅｌｅｃｔｏｆｕｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｍｍｏｎ ｗｈｅａｔ （ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍｌ Ｌ． ） ａｎｄ
Ｉｔａｌｉｎｅ ｒｅｙｅｇｒａｓｓ （ Ｌｏｌｉｕｍ ｍｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍＬａｍ． ） ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｍａｔｕｒｅ ｃｙｂｒｉｄｓ［ Ｊ］ ． Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌｕｌａｒ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ －
Ｐｌａｎｔ， ２００６， ４２（２）： １７９ － １８７
［ ７ ］　 Ｚｈｏｕ Ａ Ｆ， Ｘｉａ Ｇ Ｍ． Ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈａｙｎａｌｄｉａ ｖｉｌｌｏｓａ ｇｅｎｏｍｅ
ｉｎｔｏ γ － ｒａｙ － ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｓ ｏｆ ｗｈｅａｔ ［ Ｊ］ ．
Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２００５， ２４（５）： ２８９ － ２９６
［ ８ ］　 Ｃｈｅｎｇ Ａ Ｘ， Ｘｉａ Ｇ Ｍ． Ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｍｍｏｎ ｗｈｅａｔ
ａｎｄ Ｉｔａｌｉａｎ ｒｙｅｇｒａｓｓ［ Ｊ］ ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００４， １６６ （５）： １２１９ －
１２２６
［ ９ ］　 Ｘｉａ Ｇ Ｍ， Ｘｉａｎｇ Ｆ Ｎ， Ｚｈｏｕ Ａ Ｆ， Ｗａｎｇ Ｈ， Ｃｈｅｎ Ｈ Ｍ． Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ
ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｈｅａｔ （ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ． ） ａｎｄ
Ａｇｒｏｐｙｒｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｕｍ （ Ｈｏｓｔ ） Ｎｅｖｉｓｈｉ ［ Ｊ ］ ． Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ２００３， １０７（２）： ２９９ － ３０５
［１０］　 Ｘｉａ Ｇ Ｍ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ
ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｓｏｍａｔｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ［ Ｊ ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２００９， ３６（９）： ５４７ － ５５６
［１１］　 赵镝． 利用体细胞杂交技术向小麦培养细胞转入粗山羊草部分
染色体的研究［Ｄ］． 济南： 山东大学， ２００３
［１２］ 　 Ｆｒｅａｒｓｏｎ Ｅ Ｍ， Ｐｏｗｅｒ Ｊ Ｂ， Ｃｏｃｋｉｎｇ Ｅ Ｃ． Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｔｕｎｉａ ｌｅａｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］ ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
１９７３， ３３（１）： １３０ － １３７
［１３］　 Ｗａｎｇ Ｌ， Ｙａｏ Ｚ Ｊ， Ｚｈａｏ Ｆ， Ｓｕ Ｊ Ｈ， Ｇａｏ Ｙ． Ｕｓｉｎｇ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ
ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｕｓｉｏｎ
ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｉｎｇｘｉａｎ１６９ ａｎｄ Ｙ２１５５ａ ［ Ｊ ］ ． Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２０１１， １０（６２）： １３６１７ － １３６２２
［１４］ 　 李玉珠， 师尚礼， 陶茸． 代谢互补抑制剂碘乙酰胺和罗丹明对 ３
种豆科牧草原生质体活力和再长的影响［ Ｊ］ ． 核农学报， ２０１２，
２６（３）： ６１５ － ６２２， ６０１
［１５］ 　 马新业， 曾继吾， 易干军． 荔枝种内原生质体电融合参数研究
［Ｊ］ ． 热带作物学报， ２０１２， ３３（６）： １０３０ － １０３３
［１６］ 　 向太和， 王利琳． 水稻原生质体细胞核及原生质体融合体的简
易染色观察法［Ｊ］ ． 细胞生物学杂志， ２００４， ２６（３）： ３２１ － ３２３
［１７］　 李玉珠， 师尚礼， 贺延玉． 不同荧光染料对苜蓿原生质体染色
效果的研究［Ｊ］ ． 草地学报， ２０１２， ２０（２）： ３４８ － ３５１
［１８］　 陈名红， 李天飞， 陈学军， 吴渝生， 李大春． ４ 种基因型烟草叶
肉原生质体培养的研究［Ｊ］ ． 江西农业大学学报， ２００６， ２８（２）：
１７５ － １７９
［１９］ 　 Ｆｉｒｏｏｚａｂａｄｙ Ｅ． Ｒａｐｉｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｍｅｓｏｐｈｙｌｌ
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］ ． Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８６， ４６（２）： １２７ － １３１
［２０］　 夏光敏， 李忠谊， 周爱芬， 郭光沁， 陈惠民． 小麦胚性悬浮系与
原生质体植株再生［Ｊ］ ． 生物工程学报， １９９５， １１（１）： ６３ － ６６
［２１］　 张小红， 闵东红， 邵景侠． 小麦愈伤组织诱导及原生质体的分
离与纯化［Ｊ］ ． 中国农学通报， ２０１０， ２６（２１）： ４９ － ５３
［２２］　 Ｈｕａｎｇ Ｈ Ｙ， Ｗａｎｇ Ｚ Ｙ， Ｃｈｅｎｇ Ｊ Ｔ， Ｚｈａｏ Ｗ Ｃ， Ｌｉ Ｘ， Ｗａｎｇ Ｈ Ｙ，
Ｚｈａｎｇ Ｚ Ｘ， Ｓｕｉ Ｘ Ｌ． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｕｃｕｍｂｅｒ （Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ Ｌ． ）
ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ［ Ｊ］ ． Ｓｃｉｅｎｔｉａ
Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ， ２０１３， １５０： ２０６ － ２１２
［２３］　 赵小强， 马晖玲，周万海，林栋． 草地早熟禾原生质体培养与融
合［Ｊ］ ． 核农学报， ２０１０， ２４（４）： ７３７ － ７４３
［２４］　 李玉珠， 陶茸， 王娟， 师尚礼， 马辉玲， 赵小强． 百脉根原生质
体的分离和酶解条件的研究［Ｊ］ ． 草地学报， ２０１０， １８（６）： ７９８
－ ８０４
［２５］　 Ｋａｏ Ｋ Ｎ， Ｍｉｅｈａｙｌｕｋ Ｍ Ｒ． Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ － ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ
ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ［Ｊ］ ． Ｐｌａｎｔａ， １９７４， １１５（４）：
３５５ － ３６７
［２６］ 　 Ｎａｖｒáｔｉｌｏｖá Ｂ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｆｏｃｕｓｅｄ ｏｎ
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ － ａ ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］ ． Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｐｒａｇｕｅ）， ２００４，
３１（４）： １４０ － １５７．
［２７］ 　 Ｂａｔｅｓ Ｇ Ｗ． Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎｓ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ［Ｊ］ ． Ｐｌａｎｔａ， １９８５， １６５（２）： ２１７ － ２２４
５１６１
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
２０１３，２７（１１）：１６１０ ～ １６１６
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ． ａｎｄ Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ Ｔａｕｓｃｈ．
ＳＵ Ｊｉ⁃ｈｕａ１ 　 ＷＡＮＧ Ｌｉ１，２ 　 ＱＩＮ Ｊｉｎ⁃ｙａｎ１ 　 ＹＡＯ Ｚｈａｎ⁃ｊｕｎ１
（ １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ ／ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｈｅｉｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，
Ｂａｏｄｉｎｇ， Ｈｅｂｅｉ　 ０７１００１；２ Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ Ｙｉｌｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ． ， Ｌｔｄ． ， Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ， Ｈｅｂｅｉ　 ０５００３５）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎｔｅｒｇｅｎｅｒｉｃ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ． ａｎｄ Ａｅｇｉｌｏｐｓ Ｌ． ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＰＥＧ， ｔｈｉｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｉｎｔｅｎｄｅｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ， ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｎ ｗｈｅａｔ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ
Ｍｉｎｇｘｉａｎ １６９ （Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ． ） ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｙ２１５５ａ （Ａｅ． ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ Ｔａｕｓｃｈ． ） ｗｅｒｅ ｄｙｅｄ ｗｉｔｈ ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ， ＦＤＡ
（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ） ａｎｄ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ， ｉｔ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｄｙｅｓ， ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｂｙ ｏｂｓｅｒｖｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｒｅｌａｔｅｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ａｂｏｕｔ ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ， ｌｉｖａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｗｈｅａｔ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ
（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ） ｓｔａｉｎｅｄ ｂｙ ＦＤＡ ｅｍｉｔｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｕｎｄｅｒ ＵＶ ｌｉｇｈｔ， ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｏｆ
Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ ａｎｄ Ａｅ． ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ ｌｅａｖｅｓ ｇｌｏｗｅｄ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌｉｇｈｔ ｂｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ， ｗｈｉｌｅ ｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ
ｗａｓ ｕｎｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｐｏｏｒ ｓｔａｉｎｉｎｇ． Ｓｏ ｗｈｅａｔ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ａｅ． ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ ｌｅａｖｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ
ｆｕｓｉｏｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｔｉｍｅ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ４ｈ， ａｎｄ ｔｈｅ ｌｉｖａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ８６􀆰 ２％ ．
Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｗａｓ １０ × １０６ｃｅｌｌｓ·ｍＬ － １， ａｎｄ ｔｈｅ ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈｅｄ
ｕｐ ｔｏ １６􀆰 １％ ． Ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ＦＤＡ ａｎｄ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ ｗｅｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｄｙｉｎｇ ｗｈｅａｔ ｍａｔｕｒｅ ｅｍｂｒｙｏ ａｎｄ Ａｅ．
ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ ｌｅａｖｅｓ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｔ， ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ． Ｗｈｅｎ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ ｗａｓ ４ｈ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ ｆｕｓｉｏｎ ｄｅｎｓｉｔｙ ｗａｓ １０ × １０６ｃｅｌｌｓ·ｍＬ － １， ｈｉｇｈ ｌｉｖａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｎｄ
ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎｓ ｗｅｒｅ ｆｏｒｍｅｄ ｍｏｒｅ ｅａｓｉｌｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ； Ａｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓ； Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ； Ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ
６１６１