全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(7): 1334−1338 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究计划(973计划)前期项目(2011CB111505), 黑龙江省青年科学基金项目(QC2011C108), 国际科技合作项目
(2009DFA32470), 黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12521149)和哈尔滨师范大学科技创新团队(KJTD201102)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 束永俊, E-mail: syjun2003@126.com; 郭长虹, E-mail: kaku3008@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: wulei_hnu2011@126.com
Received(收稿日期): 2012-02-14; Accepted(接受日期): 2012-04-20; Published online(网络出版日期): 2012-05-11.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120511.1824.035.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.01334
利用比较基因组学开发山羊草属 InDel分子标记
吴 磊 王 丹 苏文悦 郭长虹* 束永俊*
哈尔滨师范大学生命科学与技术学院 / 黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150025
摘 要: 为开发和利用小麦野生近缘种的优异基因, 采用比较基因组学方法, 通过拟斯卑尔脱山羊草 EST (expressed
sequence tag)与小麦 UniGene序列的比对分析, 发现山羊草插入/缺失(InDel)位点 137个, 在这些位点两端序列设计引
物 24对, 通过在 15个小麦野生近缘属种基因组 DNA的扩增分析, 发现 11对引物具多态性, 可以作为 InDel标记。
这些包含突变位点的基因涉及亚细胞定位、蛋白质结合与催化以及代谢等过程。
关键词: 比较基因组学; 插入/缺失突变; 小麦; 拟斯卑尔脱山羊草; 功能分子标记
Developing InDel Markers from Aegilops Genus Based on Comparative
Genomics
WU Lei, WANG Dan, SU Wen-Yue, GUO Chang-Hong*, and SHU Yong-Jun*
Key Laboratory of Molecular Cytogenetics and Genetic Breeding of Heilongjiang Province / College of Life Science and Technology, Harbin Normal
University, Harbin 150025, China
Abstract: The expressed sequence tags (ESTs) of Aegilops speltoides were aligned with UniGene sequences of wheat to develop
molecular markers for favorable genes that can be used in wheat breeding. A total of 137 insertion/deletion (InDel) sites were
identified in Ae. speltoides, and 24 pairs of primers flanking these InDel sites were designed. Of the 24 pairs of primer, 11 had
polymorphic amplification in 15 species of wheat relatives, suggesting that they can be used as InDel markers. These InDel mark-
ers were functional markers involved in subcellular localization, protein binding or catalyzing, metabolic process and cell rescue,
defense, and disease resistance.
Keywords: Comparative genomics; Insertion/deletion mutation (InDel); Wheat; Aegilops speltoides; Functional molecular marker
小麦野生近缘种作为优异基因的供体, 在普通小麦
的遗传改良和育种中发挥了重要作用。拟斯卑尔脱山羊草
(Aegilops speltoides, 2n=2x=14, SS)起源于地中海东部和
中东地区, 其基因组与小麦的 B基因组同源性高, 通常被
认为是普通小麦 B 基因组的供体种, 并将其用作小麦遗
传改良的重要材料[1]。山羊草属除了拟斯卑尔脱山羊草外
还包括其他 22 种。通过杂交等方法, 可将其携带的丰富
优异基因导入普通小麦 , 并且已成功培育了一些农艺性
状优良的小麦品种[2-8]。但是, 对山羊草属相关的遗传学
却相对落后 , 缺乏鉴定小麦基因组中山羊草属外源基因
的有效分子标记 , 从而影响了山羊草属基因资源的开发
和利用效率。
近年来, DNA 测序技术快速发展, 成本大幅度降低,
同时国际公共数据库中积累了海量可利用的序列信息。很
多研究人员通过序列比较分析, 开发了大量 SSR 和 SNP
标记[9-11]。这一工作不仅丰富了重要作物的分子标记, 促
进了分子标记在作物遗传育种领域的研究 , 而且大大降
低了分子标记的开发成本。目前, 已在水稻、小麦等作物
上取得了成功 , 并将基于比较基因组学开发的分子标记
用于遗传育种中[12-19]。
本研究从公共数据库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
中下载拟斯卑尔脱山羊草的 EST 序列, 将其联配到小麦
的 UniGene上, 筛选其中的突变位点, 并对突变位点所在
基因的功能进行注释分析。在突变位点两端设计引物, 通
过鉴定其在多物种中的扩增多态性 , 开发山羊草属特异
的分子标记 , 为小麦野生近缘种优异基因的开发和利用
第 7期 吴 磊等: 利用比较基因组学开发山羊草属 InDel分子标记 1335


提供便利。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其 DNA提取
小麦近缘种拟斯卑尔脱山羊草、长穗偃麦草、粗山
羊草、一粒小麦、二粒小麦、提莫菲维小麦、尾状山羊草、
顶芒山羊草、二角山羊草、离果山羊草、黏果山羊草、偏
凸山羊草、三芒山羊草和粗厚山羊草由中国作物种质资源
信息网 (Chinese Crop Germplasm Resources Information
System, CCGRIS)惠赠, 栽培小麦品种“中国春”由本实
验室保存。
取各材料幼叶 300 mg, 用 CTAB 法[20]提取总 DNA,
保存于 50 μL去离子水中, 稀释至 50 ng μL−1。
1.2 InDel突变位点识别
从 NCBI 的 EST 和 UniGene 数据库 (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/)中分别下载(2010-8-26)拟斯卑尔脱山羊
草的 4 316条 EST数据和小麦的 21 938条 UniGene序列。
利用 BLAST将拟斯卑尔脱山羊草的 EST序列比对到小麦
的 UniGene 上, 确定拟斯卑尔脱山羊草 EST 序列在小麦
中的同源基因序列(E-value = 1E−10)。利用 EMBOSS程序
包[21]的 Diffseq程序分析 EST和同源基因之间的序列差异,
筛选其中突变长度超过 3 个碱基(包含 3 个)的插入/缺失
(InDel)位点作为候选突变位点。利用软件 Primer3[22]在候
选 InDel 位点两侧设计 PCR 引物, 引物设计的标准是 Tm
值为 58 , ℃ 引物长度为 20~26 bp。
1.3 InDel突变位点基因功能注释
从 TAIR数据库(http://www.arabidopsis.org/, TAIR)下
载拟南芥的基因组数据和注释信息 [23], 提取拟斯卑尔脱
山羊草突变位点的基因序列, 用 BLASTN[24]比对拟南芥
基因转录序列, 提取相似性最高的序列注释信息, 作为挖
掘的突变位点的功能注释, 并对突变位点的注释信息分类。
1.4 InDel突变位点的 PCR扩增和多态性检测
以 15个植物基因组 DNA为模板。PCR反应体系 25
µL, 含 2.5 mmol L−1 MgCl2、1 U Taq酶、800 μmol L−1
dNTP、0.2 μmol L−1引物、模板 DNA 50 ng。采用降落 PCR
(touchdown PCR, TD-PCR)进行扩增, 程序为 94℃预变性
7 min; 94℃变性 20 s, 60℃退火 20 s, 每循环降 0.5 , 72℃ ℃
延伸 30 s, 30个循环; 94℃变性 20 s, 45℃退火 20 s, 72℃延
伸 30 s, 10个循环; 72℃延伸 7 min。用变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳分离扩增产物, 银染显影, 筛选具有多态性引物标记。
2=1
n
i
i
PIC p−∑
式中, PIC为多态性信息量, Pi为等位基因 i的频率。
2 结果与分析
2.1 InDel突变位点
通过 BLAST比对, 筛选出的 1 053条拟斯卑尔脱山
羊草 EST 序列与小麦 UniGene 序列高度相似(E-value=
1E−10)。利用 EMBOSS 将相似的 EST 序列与小麦的
UniGene 序列比较, 筛选得到 11 625 个 InDel 突变位点,
突变长度为 3个或 3个以上碱基、重复出现 2次或 2次以
上的位点 137个(图 1)。其中, SSR位点突变的 InDel有 60
个(44%), 非 SSR突变的 InDel有 77个(56%)。在这些 InDel
位点中, 3碱基或者 3碱基整数倍突变的比例较高, 为 69%
(94/137), 而非 3碱基突变的比例仅为 31% (43/137)。
2.2 InDel突变位点靶向基因的功能注释
137个 EST-InDel 被定位于 113个基因, 主要参与亚
细胞定位过程(42/216, 19%)、蛋白质的结合与催化活性



图 1 拟斯卑尔脱山羊草基因 InDel突变位点的筛选
Fig. 1 Identification of mutation sites from Ae. speltoides gene sequences
A: 插入/缺失型突变的筛选; B: SSR型突变的筛选。
A: InDel-type mutation; B: SSR-type mutation.
1336 作 物 学 报 第 38卷

(33/216, 15%)和代谢过程(24/216, 11%), 还参与一些特异
的细胞过程, 如细胞内物质合成、蛋白质折叠修饰、基因
转录、与外界环境互作等(图 2), 表明这些插入缺失突变所
在基因广泛地参与拟斯卑尔脱山羊草的各种代谢反应过
程, 可能影响着山羊草一些重要农艺性状的形成。



图 2 InDel突变所在基因的功能分析
Fig. 2 Putative functions of genes containing InDel
mutation sites

2.3 InDel分子标记的 PCR鉴定
在 77个候选非 SSR插入缺失引起的 InDel突变位点
两端共设计 62 对 PCR 引物, 选择其中的 24 对在拟斯卑
尔脱山羊草等 15 种材料中进行扩增分析, 19 对引物获得
稳定的扩增产物, 其中 11 对引物(引物序列见表 1)在 15
份植物材料中具有扩增多态性(图 3), 标记多态性比例为
58%。每对引物可扩增 2~5 条带, 平均 3.3 条, 高于二价
型的 SNP 标记, 但低于 SSR 标记; 11 对引物的多态性信
息量为 0.42~0.74, 高于 SNP 标记, 低于 SSR 标记, 表明
这些引物适用于小麦及其近缘种资源的鉴定和分类。
3 讨论
山羊草属是栽培小麦的近缘属, 含有大量可用于小
麦遗传改良的优异基因, 特别是拟斯卑尔脱山羊草, 它是
栽培小麦的祖先种, 是小麦 B基因组的供体, 与小麦亲缘
关系较近, 其优异基因也容易导入栽培小麦, 已培育了一
批含有山羊草属优异基因的优质小麦品种。但是, 由于山
羊草属分子标记匮乏 , 在利用山羊草属的遗传资源时难
以快速、准确地鉴定遗传改良后代。虽然公共数据库中贮
存了海量基因组和 EST 序列信息, 可供开发分子标记(如
EST-SSR、EST-SNP和 InDel等), 但由于山羊草属公布的
序列较少, 而且少有编码区的 SSR突变, 因此山羊草属特
异分子标记数目有限。目前, 应用于山羊草属的分子标记
主要由小麦中的 SSR类分子标记转化, 数目较少, 而且类
型单一, 主要集中在非编码区。



图 3 InDel标记 HNU-AE285的多态性检测
Fig. 3 Polymorphism analysis of InDel markers HNU-AE285
1: 拟斯卑尔脱山羊草; 2: 长穗偃麦草; 3: 粗山羊草; 4: 一粒小麦; 5: 二粒小麦; 6: 提摩菲维小麦; 7: 尾状山羊草; 8: 顶芒山羊草;
9: 二角山羊草; 10: 离果山羊草; 11: 黏果山羊草; 12: 偏凸山羊草; 13: 三芒山羊草; 14: 粗厚山羊草; 15: 中国春。
1: Aegilops speltoides; 2: Thinopyrum elongatum; 3: Ae. tauschii; 4: Triticum monococcum; 5: T. dicoccon; 6: T. timopheevii; 7: Ae. caudata; 8: Ae.
comosa; 9: Ae. bicornis; 10: Ae. triuncialis; 11: Ae. kotschyi; 12: Ae. ventricosa; 13: Ae. neglecta; 14: Ae. crassa; 15: T. aestivum Chinese Spring.

表 1 本研究开发的 InDel标记引物信息
Table 1 Primer information of InDel markers developed in this study
InDel标记
InDel marker
上游引物
Forward primer (5′–3′)
下游引物
Reserve primer (5′–3′)
多态性信息量
Polymorphic information
content
扩增片段
Product size (bp)
HNU-AE285 CCTCAAGTTCTCACAGATGTTCC TAATACCTGGACGGTTTCCATC 0.68 350
HNU-AE309 GAAAGCTGGCATGGATTTCTAC AAGTGTGGGGATGTTTCTGTCT 0.60 250
HNU-AE326 CTTCTACGCAGCCATAGGTTTC TCGAGAGGTATGTGGCTGTCT 0.56 250
HNU-AE381 GACTGACTGAGCATCAAGCG AGACAGAGACCAAGGAGGTGGT 0.49 300
HNU-AE422 TATGCCGTAGAAATGCACTCAC ACTACCAGCAGCAGAACATTCA 0.58 250
HNU-AE437 CCAACCAGTCACATTTCTATCC TGACTCGGATGACCTAATCTCC 0.51 250
HNU-AE510 CAATTCATGTCCTCGTGCTAGT GCCAGAAGCTGATCAAGGAG 0.60 400
HNU-AE572 AGAAGAAGAAGCTGAGGAGCTG TCTGGCTAGGTGACCTCTTCAT 0.54 300
HNU-AE806 GAGTTCGTCATCAAGATCCTCC ATCTATCCGTTTTTCCCGAGTC 0.74 300
HNU-AE829 TCTGCTGTCTCTGATGGAGGAC TGATCTTGTCCATCTTGTACGC 0.58 300
HNU-AE837 GCACCAACTTTCACAGAAACAG ATTTTCTCGGCTTAAGCGATCC 0.42 350

第 7期 吴 磊等: 利用比较基因组学开发山羊草属 InDel分子标记 1337


本研究通过比较拟斯卑尔脱山羊草和小麦基因间的
序列差异, 扩大了分子标记的来源。我们发掘的突变主要
有单碱基突变(SNP)和 InDel 突变, 本文仅报道了 SSR 型
和非 SSR型 InDel突变, 其中 SSR长度突变只占一小部分,
大多数都是非 SSR的 InDel突变。常规单物种的 EST-SSR
只能发掘 SSR位点, 无法挖掘非 SSR的 InDel突变, 因此,
能够开发获得的分子标记极为有限。而本研究利用比较基
因组学, 能够拓宽遗传突变识别的种类和数量, 提高分子
标记的开发效率。同时, 与传统的分子标记发掘相比, 通
过比较山羊草和栽培小麦的基因序列 , 对潜在的突变位
点信息进行筛选, 具有很强的选择性, 能显著提高分子标
记的开发效率。传统的 EST-SSR 标记开发成功率为
10%~36% [25], 而本研究的 InDel标记开发成功率为 58%。
InDel分子标记特性介于 SSR标记和 SNP标记之间, 其扩
增条带明显少于传统的 SSR 标记, 但多态性信息量高于
SNP标记, 说明 InDel标记具有较好的适用性。
本研究开发的 InDel标记都是位于功能基因上, 其功
能主要与亚细胞定位、蛋白质的结合和催化活性以及代谢
过程相关。这些基因是植物体内重要性状形成的基础, 因
此其 InDel突变可能会影响基因功能的发挥。特别是 InDel
长度不是 3碱基的整数倍时, 容易造成蛋白质读码框的移
位等问题, 直接导致编码蛋白质功能的改变, 可以将这些
标记直接用于山羊草农艺性状的重要等位基因的筛选 ,
有利于山羊草属优异基因的开发和利用。
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