全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·技术与方法· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-15
作者简介:夏亮(1983-),男,四川自贡人,在读硕士,从事玉米遗传多样性研究;E-mail:xlbright@gmail.com
通讯作者:赵琦,教授,Tel:010-68901494;E-mail:zhaoqi@cnu.edu.cn
由于耕地面积逐年缩小,全球气候变暖,玉米
生产受到严重影响,加之我国玉米育种的种质基础
狭窄,难于选育出适应气候变化和高产的优良品
种。当前解决问题的关键是种质扩增、改良与创新。
玉米群体是育种的重要基础,明确群体间和群
体内的遗传变异,才能有的放矢地进行优良组配,
优选自交系和种质创新。玉米群体的深入研究对种
质创新、优良自交系选育、组配优良杂交组合都有
重要的意义。
遗传多样性(Geneticdiversity)是种内不同群体
之间和一个群体内不同个体之间的遗传变异总和。
是生物多样性的基本组成,是生态多样性和物种多
样性的基础。遗传多样性的产生主要是由于遗传信
息在外界或内在因素作用下,在复制过程中有时会
出现差错(如 DNA片段的倒位、易位、缺失或转座
等),从而导致不同程度的遗传变异。通常生物以极
低的频率不断发生点突变和多种由 DNA更新机制
(DNAturnovermechanism)引起的更为复杂的突变,
这些突变在漫长的进化过程中逐渐稳定和消失,形
成种间和种内丰富的遗传多样性基础。物种的遗传
多样性可以从形态特征、细胞学特征、生理特征、基
因位点及 DNA序列等方面来进行判定。
国内外的学者利用不同方法,从形态特征、亲
缘关系到生化指标,对玉米的遗传多样性进行了细
致深入的研究。近年来,分子生物学的发展为植物
遗传多样性的研究提供了有利的工具,带来了新的
变革。分子标记能直接反映反映生物个体或种群间
基因组内 DNA的差异。分子标记的检测,为玉米的
遗传多样性分析提供了丰富精细的分析技术。
SSR(简单序列重复 Simplesequencerepeat),是
近年来玉米遗传多样性研究中经常使用的方法,由
Moore等于 1991年创立。SSR又称作微卫星 DNA,
是一类由几个(多为 1~5个)碱基组成的基序(motif)
串联重复而成的 DNA序列,其长度一般较短,如
(CA)n、(AT)n、(GGC)n等重复。不同遗传材料重
复次数的可变性,导致了 SSR长度的高度变异性,
微卫星标记在玉米群体遗传多样性研究中的应用
夏亮 1 赵琦 1 焦雨歆 1 谢传晓 2
(1首都师范大学生命科学学院,北京 100037;2中国农业科学院作物科学研究所,北京 100081)
摘 要: 简要综述了近几年利用微卫星(SSR)分子标记技术分析玉米群体遗传多样性过程中的研究进展对研究
中混合取样,荧光标记技术,共享数据库等新方法的使用作了阐述。
关键词: 玉米群体 遗传多样性 SSR 混合取样 荧光标记
ApplicationofMicrosateliteMarkersinStudyofGenetic
DiversityinMaizePopulation
XiaLiang1 ZhaoQi1 JiaoYuxin1 XieChuanxiao1
(1ColegeofLifescience,CapitalNormalUniversity,Beijing100037;2InstituteofCropSciences,ChineseAcademyof
AgriculturalSciences,Beijing100081)
Abstract: Thispapersummarizedtheapplicationofmicrosatelitemarkersinstudyofgeneticdiversityinmaize
populationinresentyears.Newmethodssuchasfluorescentmarking,bulksamplingandmutualdatabasewereexpounded.
Keywords: Maizepopulation Geneticdiversity SSR Pooled-sampling Fluorsescentmarking
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
这一变异性是 SSR标记产生的基础。微卫星 DNA
分布于整个基因组的不同位置,可以存在于内含
子、外显子及染色体的其他任何区域。虽然在不同
植物中,SSR重复单位的碱基组成及拷贝数随物种
的不同而有所差异,但其两端序列多是保守的单拷
贝序列,因此可以根据这两端的序列设计一对特异
引物,通过 PCR技术将其间的核心微卫星 DNA序
列扩增出来,利用电泳分析技术就可获得其长度多
态性,即 SSR标记。
SSR标记的主要特点有:1)数量丰富,广泛分
布于整个基因组;2)具有较多的等位性变异;3)共
显性标记,可鉴别出杂合子和纯合子;4)实验重复
性好,结果可靠;5)只需少量 DNA样品,且质量要
求不高,即使是部分降解的样品也可进行分析。
1 混合取样
长期以来,研究人员利用群体内随机单株 DNA
的样品,来研究植物群体的遗传多样性。根据单株
样本分析群体的遗传多样性,可确定群体的等位基
因数、等位基因频率及遗传结构,检测群体中的稀
有基因,因此能全面地反映群体的遗传变异。
玉米群体内个体间是高度异质的杂合基因,必
须要用一定数量的样本才能代表一个群体,如果研
究的群体数目很多,采用单株提取 DNA的方法将
耗费大量的人力和物力。Marilyn等曾用 48个单株
样品代表一个群体,研究了 7个 CIMMYT玉米群体
的遗传多样性,这相当于 336个玉米自交系的工作
量[15]。
利用分子标记研究群体遗传多样性涉及到取
样问题,适当的样本大小决定了该项研究的质量和
效率。在用混合取样的方法,通过需要 PCR过程的
分子标记技术研究遗传多样性时,还要注意一般在
DNA扩增过程中引物会竞争靶位点,进而引起扩
增反应。如果混合样本中有一个单株的 DNA量少,
那么在扩增过程中该摸板 DNA可能无法与引物结
合,不能被扩增。如何才既减少工作量,又提高检测
群体遗传变异的准确性,是实验过程中需要考虑的
问题。因此,需要在分子标记原有技术的基础上,根
据其本身的特性灵活运用于混合取样的研究。
Michelmore等[5]最早使用 RFLP的方法分析混
合 DNA样本。Dubreuil[1]等利用 RFLP标记,在每个
群体中随机取 10个叶面积相等的单株叶片,构成
的 3个独立的混合样本作为模板,对 10个玉米群
体进行群体遗传多样性分析,检测出基因频率大于
0.05的等位基因,从理论上确定了混合取样的可行
性。初步建立了通过检测 RFLP的条带亮度估算种
群内等位基因频率的方法。
随着分子标记技术的发展,SSR标记逐渐被用
于混合 DNA样品的玉米群体遗传多样性研究。相
对于 RFLP分子标记,SSR标记能提供更丰富的多
态性,而且操作简单、重复性高,更适合大规模的遗
传多样性研究。
刘雪等[15]采用 SSR技术,以两个 CIMMYT群体
(Pob69和 Pob70)为试验对象,参照单株取样的结
果,对不同的混合取样方法进行比较,结果表明从
每个群体抽取 4个分别由 10个单株叶片混合而成
的样本,可以有效地分析群体间的遗传多样性,而
且没有明显损失群体的信息量。王铁固等[16]用不同
的混合取样方法研究一个群体,比较分析后,又以
6个玉米群体为材料,利用 SSR标记和总结出的混
合取样方法分析其遗传多样性并进行聚类分析。分
子标记的聚类分析结果与系谱分析结果相吻合,进
一步证明了混合取样研究玉米群体 SSR遗传多样
性,并进行聚类分析的可行性。段运平等[9]分析 27
个 CIMMYT玉米群体和中国玉米群体的遗传多样
性及其之间的遗传关系,中国玉米群体和 CIMMYT
种质分别聚类到两大类群中,该结果与系谱分析基
本吻合。
JochenC.Reif[4]等用 55个 SSR标记研究了 5个
欧洲群体的 30个随即单株样本和它们的混合样
本。并通过荧光检测的波峰面积估算混合样本分析
结果中等位基因的频率,初步解决了混合取样不能
计算样本等位基因频率的问题。但是在混合样本中
大部分基因频率小于 0.2的等位基因都不能被检
测到,和 Dubreuil[1]使用 RFLP研究的结果有较大出
入。他提出了两点可能的原因:首先,SSR研究的
PCR的过程中,低频率的等位基因在竞争聚合酶和
其他反应试剂时处于劣势;其次,采用 30个单株的
混合样本的方法不如采用 3组 10个单株样本的精
确性高。
Dubreuil[2]用 24个 SSR标记大规模分析了 275
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个欧洲和美洲的群体,在比较同一个群体内 2个由
15个个体组成的随机混合样本间的遗传距离后发
现两组间遗传距离差别很小,提出可以用一组 15
个个体的混合样本来代表一个群体。并提出了 SSR
混合取样的方法可能会出现的问题:1)聚合酶可能
出现滑动的情况,很难区别出真正的等位基因;2)
缺失值的出现会降低等位基因频率估算的准确性;
3)等位基因间不同的扩增效率使其频率的估算出
现偏差。但实验中用 SSR标记同以前 RFLP的结果
比较后,证明这些 PCR过程中的不足不会对最后
的分析结果有明显的影响。
还有一个值得注意的问题,就是样本的混合是
在 DNA提取前还是提取后。如果提取前混合可以
节约实验的时间和成本,特别是在大规模分析群体
时。但也会由于各个单株的贡献的 DNA样本不均
一,造成一定的误差[4]。
但在种群分析中,往往需要进一步分析种群间
遗传多样性的差异,它受样本容量,即总位点数的
影响较大,分析位点越多越能真实反映种群间遗传
本质差异,因而此时引用 Jaccard指数比较合理[18]。
许多研究者也使用 Jaccard指数对群体间遗传关系
进行分析[9,11,15,16]。候本军[11]在用混合样本估算的
GD,GD(J),GD(N)比较研究后认为混合单株数的变
化对于不同的计算方法有不同的影响,提出可先计
算出群体间的 Nei遗传距离 GD(N)和 Jaccard遗传
距离 GD(J),在用(GD(N)+GD(J) /2来估算群体间的
遗传距离较合理。
2 荧光标记
由于用多株混合叶片的 DNA样本,进行普通
SSR标记分析不能计算等位基因频率,故不能分析
群体内的遗传变异,而仅能计算群体间的遗传距
离。有分析表明,用多株混合叶片的 DNA样本检测
不出一些频率很低的等位基因,这会使检测到的群
体遗传信息有所降低。混合取样虽然会使群体的遗
传信息有所降低,但可以用来分析群体间的遗传关
系。
SSR荧光标记技术应用解决的传统混合取样
方法不能计算群体间遗传距离的问题,由于该技术
使毛细管电泳产生的条带转化为分析软件中波峰
的形式,可以精确定量扩增产物,而且充分发挥了
毛细管电泳高分辨率,快速,灵敏,成本低等优点,
克服了传统方法的不足。利用自动化的仪器 (如
ABI3130,ABI3700), 和 数 据 采 集 和 分 析 软 件
(Genescan317、Genotyper317)进行图像收集和分
析,精确计算出微卫星等位变异扩增片段的大小,
实现了 SSR标记与高效、自动化技术的结合[10]。
微卫星荧光标记-全自动基因分析技术采用
FAM、VIC和 NED等不同颜色的荧光染料标记 SSR
引物的 5′端,将不同荧光标记、扩增片段长度差异
较大的 PCR产物和标准分子量样品(内标)在同一
泳道毛细管中电泳,之后通过数据处理软件,采集
不同的荧光信息分别进行分析。
易红梅等[19]对毛细管电泳荧光检测和常规的
变性 PAGE银染检测 2种 SSR标记检测方法进行
比较分析,采用毛细管电泳结合荧光标记检测法对
15份国内骨干自交系进行类群划分。实验表明毛
细管电泳结合荧光标记检测法大大提高了玉米品
种的检测效率。该技术有以下优点:(1)可以准确地
读出每个等位基因片段的大小,有利于不同批次样
品等位基因分析的数据统一;(2)高度自动化与程
序化,操作简便,省时省力。利用 ABI3100、ABI3700
或 ABI3730型测序仪和与之匹配的电脑软件直接
进行程序化、数据化和图像化处理;(3)可以精确定
量扩增产物,依据定量 PCR原理,对 PCR产物乃至
模板 DNA中某一基因型进行定量分析。在等位基
因频率、EST-SSR定量分析方面有广阔的应用前
景。这些是 PAGE-银染无法实现的,通过多重 PCR,
还可进一步提高效率;(4)根据郝晨阳等[10]作的实
验费用计算,不仅效率高,当分析样品达到一定量
时,也更为经济。更重要的是,荧光 SSR分析技术
还具有读带准确,数据一致,不存在整合障碍的优
点。该技术实现 SSR标记与高效、自动化分析技术
结合,弥补传统银染技术的不足;有效地解决了实
验室之间的数据整合问题。
后来又出现了新的 SSR荧光标记技术——TP-
M13(Tailedprimer-M13)自动荧光检测系统,与上述
传统的方法不同的是 TP-M13采用 3条引物来进行
PCR扩增[13]。第 1条引物是把初选的 SSR引物的反
向引物分别和 M13的正向引物相连合成带有 M13
尾巴的引物——TP-M13引物,第 2个引物为正常
夏亮等:微卫星标记在玉米群体遗传多样性研究中的应用 87
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的 SSR正向引物。第 3个引物是 5′端带有 FAM标
记的 M13的正向引物。合成引物时,在 SSR引物序
列正链的 5′端增加 M13接头序列,同时用荧光单
独标记 M13链,进行 PCR扩增反应,通过 M13链
的退火,实现 SSR引物的荧光标记。
TP-M13自动荧光检测系统只需标记 1条引
物,既经济,又廉价。李会勇等[13]利用 TP-M13自动
荧光检测法对 48份高粱材料进行了 SSR标记的基
因型鉴定。不过,在利用普通的自动荧光检测系统
时,往往可以在同一个 PCR反应中同时进行 4～5
个 SSR标记的基因型鉴定,利用不同的荧光标记来
进行检测和读取数据。但 TP-M13不能利用不同的
颜色的荧光标记来进行检测和读取多重的数据,有
一定的局限性。
3 数据库
如前所述,SSR等位变异结果分析主要包括银
染和荧光标记,荧光标记法兼有高通量和高准确
性,适用于大批量的样品分析,但成本很高。银染法
更为经济,但准确性较低。利用银染法分析不同样
品 DNA片段大小,主要是通过银染的谱带与标准
DNA分子量比较而判断的。因而,同一胶板上所有
样品谱带间相对位置的识别以及不同胶板所得到
的数据的比对,给数据的收集和分析带来很大困
难。当分析的材料和位点较多时,数据准确性成为
主要限制因素。然而,荧光标记法需要昂贵的 DNA
自动测序仪,高价的 SSR荧光标记引物和标准样,
因此实验成本很高。针对这一问题,“挑战计划项目
(GenerationChalengeProgram,GCP)”已尝试开展全
球玉米遗传资源多样性协作,并建立玉米 SSR指
纹图谱数据库,利用数据库所提供的信息,进行
SSR标准试剂盒的研究和开发。
目前,SSR指纹图谱数据库 的建立以 GCP
(GenerationChalengeProgram)项目的技术平台为
基础的。GCP下设 5个分项目(SP1～SP5),即全球
遗传资源多样性研究(SP1),比较基因组学(SP2),
用于作物改良的特异性状基因的发掘(SP3),遗传
资源、基因组学及作物信息系统的构建(SP4),以及
信息共享平台(SP5)。GCP的主旨是促进研究成果
从实验室进入到育种实践。国际玉米小麦改良中心
(CIMMYT)应用全球遗传资源多样性研究(SP1)的
结果,建立了玉米和小麦 SSR指纹图谱数据库[12]。
数据库信息和下载见:(htp:/www.cimmyt.org/english/
docs/manual/dbases/fingerprint_Instructions_manual.
htm.)
4 结语
综上所述,分子标记在作物育种研究中发挥着
重要的作用,特别是基于毛细管电泳的 SSR荧光标
记和混合取样技术,提高了精确度和效率,使其在
大规模遗传多样性研究和杂种优势群划分中具有
更广阔的应用前景。而共享数据库的建立提供了实
用交流的平台,基本实现了数据贡献和标准化,极
大的促进了作物遗传多样性的研究。
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