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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
白腐菌混合菌降解木质素最佳条件的优化
段传人 贾秋云
(重庆大学生物工程学院 ,重庆 400030)
　　摘 　要 : 　通过正交试验对 3种白腐菌混合菌降解竹材木质素的条件进行优化 ,结果表明 ,在温度为 32℃、pH310、固体发
酵时间 20 d、培养液与竹材基质质量百分比 110%时降解木质素的效率最高。在此基础上 ,研究了两种诱导剂对白腐菌混合
菌降解木质素的影响。结果表明 ,两种诱导剂均能促进木质素的降解 ,其中 H2O2在浓度 1%时 ,木质素降解率高达 6219% ,苯
甲酸在浓度 011%时 ,木质素降解率最高 ,为 6718%。
关键词 : 　白腐菌 固体发酵 木质素降解率 诱导剂
Optim ization of the Conditions for W hite2rot FungusM ixed
Bacter ia Degrading L ign in
Duan Chuanren J ia Q iuyun
(B ioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400030)
　　Abs trac t: 　 In this paper, the conditions forW hite2rot fungus m ixed bacteria degrading lignin were op tim ized through the orthogo2
nalexperiments. The results showed that when the temperature was 32℃, pH310, the solid2state fermentation time was 20 d, the cul2
ture medium and the substrate quality bamboo was 110% , and the efficiency of lignin degradation was up to a maximum1 On this ba2
sis, the impact of two kinds of inducing agents acting on m ixed white rot fungi degrade lignin was studied1 The results showed that two
kinds of inducing agents can p romote the degradation of lignin, in which the concentration of H2O2 at 1% , lignin degradation rate as
high as 6219% , benzoic acid in the concentration of 011% , and the highest rate of lignin degradation, to 6718% 1
Key wo rds: 　W hite2rot fungus Solid2state fermentation L ignin degradation rate Inducer
收稿日期 : 2009209210
基金项目 :教育部“春晖计划”合作科研项目 ( 0221002411015) ,重庆大学人才引进基金 ( 0903005104212) ,重庆市自然科学基金项目 ( CSTC,
2009BB7366)
作者简介 :段传人 (19702) ,男 ,副教授 ,主要研究方向 :微生物学 (发酵工程、微生物资源开发与利用 ) ;植物学 (分子生物学与基因工程、植物发
育调控及生物技术 ) ; E2mail: chrduan@ cqu1edu1cn
通讯作者 :贾秋云 , E2mail: jiaqiuyun@1631com　　我国竹林面积居世界第一 [ 1 ] ,竹资源丰富 ,丰富的竹类资源为竹类加工利用及产业化开发提供了良好的资源条件。竹纤维素制备、生物制浆及竹子综合利用都需要对竹子进行选择性的去除木质素 ,因此如何提高木质素的降解选择性很值得深入研究。竹木质素是自然界可再生的含量丰富的天然高分子聚合物 ,也是化学制浆工业中重要的废弃物和污染物 [ 2 ]。Chandra等 [ 3 ]研究了竹木质素的含量与储藏之间的关系 ,认为竹木质素含量的减少主要是白腐菌的降解作用引起的 ,研究木质素的生物降解对促进资源的高效利用、减轻环境污染有 极其重要的意义。利用白腐菌选择性脱除木质素是目前生物技术应用研究中的热点课题 ,国内外近年来就如何提高白腐菌木质素降解酶的产量做了大量工作 [ 4 ] ,但过去的研究主要集中于白腐菌的液体培养、产酶条件的优化选择及该菌去除废液中木质素的工艺控制 [ 5～7 ] ,对于白腐菌固态发酵情况下降解固态木质素的研究较少。所以 ,科学合理地探寻白腐菌固态发酵的最佳条件并利用其处理固态木质素是竹材和木材类资源开发利用的关键。通过前期研究表明 ,朱红栓菌 (T1Cinnabarinam )、
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
平菇 (P1Ostreatus) 、黄孢原毛平革菌 (P1Chrysosporium ) 3
种组合菌种降解木质素效率较单一菌种高 ,在此基
础上研究了培养温度、pH值、固体发酵时间、培养液
与竹材基质质量百分比对该混合菌降解木质素的影
响 ,以期获得最佳条件的优化 ,并研究了两种诱导剂
对最佳条件下培养的白腐菌混合菌降解木质素的
影响。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
黄孢原毛平革菌 ( P. Chrysosporium )购于中国科
学院微生物所 ;朱红栓菌 ( T. C innabarinam )购于中
国科学院微生物所 ;平菇 ( P. O strea tus)购于重庆市
农科所 ;慈竹 (N eosinoca lam us affin is)产于重庆。
1. 2 仪器设备
恒温振荡器 (北京东联哈尔仪器制造有限公
司 ) ;智能型人工气候箱 (上海一恒科学仪器有限公
司 ) ;不锈钢立式自控压力蒸汽灭菌器 (上海申安医
疗器械厂 ) ; UV2762型紫外可见光分光光度计 (上
海精密科学仪器有限公司 ) ; MD20023电子天平 (上
海天平仪器厂 ) ; SWCJ1FD型净化工作台 (苏州安泰
空气技术有限公司 )。
1. 3 菌种培养方法
1. 3. 1 培养基　液态发酵培养基 :酵母膏 210 g,葡萄
糖 1010 g,胰蛋白胨 210 g,天冬酰胺 110 g,磷酸氢二钾
210 g,硫酸镁 (MgSO4 ·7H2O) 110 g,VB1 1 mg,蒸馏水
1 000 m l。人工气候箱中静置培养 24 h后 ,转移到恒
温振荡器 (温度为 32℃,转速为 160 r/m in)中培养 5
d,再等量转接入已灭菌的固态发酵培养基。
固态发酵培养基 :由竹粉和固态发酵培养液按
不同比例构成。
固态发酵培养液 :葡萄糖 1010g,酒石酸钾钠
(C4 H4 O6 KNa·4H2 O ) 2 mmol,吐温 20 210 g,醋酸
缓冲液 10 mmol ( pH510) ,磷酸二氢钾 310 g, VB1
1 mg,苯甲醇 6 mmol; 微量元素组合液 : 硫酸镁
(MgSO4 ·7H2O) 115 g,硫酸亚铁 (FeSO4 ·7H2O) 012 g,
硫酸锰 (MnSO4 ·H2O) 012 g,硫酸铜 (CuSO4 ·5H2 O )
15 mg,无水氯化钙 014 g,愈创木酚 1 g,自来水 1 000
ml,备用。
1. 3. 2 培养液 pH值的调节 取上述 4份已经配
好的固体发酵培养液 100 m l,用 011 mol/L的 NaOH
和 011 mol/L的 HCl来调节 pH值 ,调节 4组不同
pH值 : pH值 215、pH值 310、pH值 315、pH值 410
的培养液备用。
1. 3. 3　培养液与竹材质量百分比的调节 　培养液
质量用 m 1表示 ,竹材质量用 m 2表示 ,培养液与竹材
基质质量百分比用 m 1 /m 2 ×100%表示 ,本试验配置
4组不同培养液与竹材质量百分比 : 50%、80%、
110%、140% ,备用。
1. 3. 4　培养基中 H2 O2浓度的调节 在优化后的
条件下 ,由于 H2 O2不稳定 ,在高温下容易分解 ,但
H2 O2本身具有杀菌作用 ,所以本试验在培养液灭
菌后 ,调节 4组不同浓度的 H2 O2 ( H2 O2与培养液
的体积比 , V /V ) : 01001%、0101%、011%、1% ,每
个浓度梯度设 3个平行样 , H2 O2现配现用 ,同时设
定零浓度空白对照。
1. 3. 5　培养基中苯甲醇浓度的调节 在优化后
的条件下 ,取 4份已配好的固态发酵培养液 100
m l,配置四组不同浓度苯甲醇 (苯甲醇与培养液的
体积比 , V /V ) : 01001%、0101%、011%、1%的培养
液备用 ,每个浓度梯度设 3个平行样 ,同时设定零
浓度空白对照。
1. 4 试验设计
本试验所采用的 4因素为 A培养温度、B初
始 pH、C固体发酵时间、D 培养液与竹材基质质
量百分比 ,采用 4因素 3水平正交试验设计 ,见
表 1。
1. 5 木质素的测定方法
1. 5. 1　木质素含量测定 木质素总量 =酸溶木质
素含量 +酸不溶木质素含量。酸溶木质素含量 :用
紫外分光光度计以 3%的硫酸溶液作参比溶液 ,于
波长 205 nm测量其吸收值。如果试验样品溶液
的吸收值大于 017,则用 3%的硫酸溶液在容量瓶
中稀释滤液 ,以便得到 012～017吸收值 ,并用此
稀释后的滤液作为试验样品溶液进行吸收值
测定。
计算滤液中的酸溶木素含量 (B )以每 1 000 m l
中的质量 ( g)表示 :
B = A100·D
861
2009年第 12期 段传人等 :白腐菌混合菌降解木质素最佳条件的优化
表 1　正交试验设计图
因子
水平
1 2 3 4
A 温度 (℃) 24 28 32 36
B pH值 215 310 315 410
C 固体发酵时间 ( d) 20 25 30 35
D 培养液与竹材基质质量百分比 / ( % ) 50 80 110 140
式中 A为吸收值 ; D为滤液的稀释倍数 ,以 VD /V0表
示 ,此处 VD为稀释后滤液的体积 (m l) , V0为原滤液
的体积 (m l) ,未稀释溶液 D = 1, 110为吸光系数 (L /
g1cm) ,该数值是由不同原料和纸浆的平均值求
得的。
原料与纸浆试样中酸溶木素含量 X ,以质量百
分数表示 ,按下式计算 :
X = B ·V·1001 000·W 0
×100%
式中 B 为滤液中酸溶木素的含量 ( g /1 000
m l) ; V为滤液的总体积 ,如原料为 575 m l,纸浆为 1
540 m l;W 0为绝干试样重 ( g)。用 3次测定的算术平
均值 ,准确至第 2位小数报告结果。
1. 5. 2　酸不溶木质素含量 GB /T 2677. 821994
1. 5. 3　木质素的降解率 :
木质素降解率 = 木质素的降解总量原料中木质素的总量 ×100%
2　结果与分析
2. 1 正交试验结果与分析
表 2～3的分析结果表明 ,因素 A和因素 D极
显著 ,因素 B显著 ,因素 C不显著。4因素的主次
顺序为 A > D > B > C。结合图 1的因素与指标趋
势图 ,可以知 ,在温度为 32℃时木质素的降解条件
最佳 ,降解木质素的指标为 38% ,在其他个温度条
件下 ,降解指标均低于 30% , 4个水平的关系为 A3
>A4 >A2 >A1;该组合菌对 pH的最佳要求为 3,
4个水平的关系为 B2 > B4 > B3 > B1;对于因素 C
发酵时间从图上可以看出 ,在 20 d时已经较高 ,而
在 25 d时有所下降 ,其后的 30 d和 35 d降解率与
20 d时的降解率相当 ,分析原因 25 d较底 ,可能是
由测量误差造成的 ;对于因素 D来说 ,在培养液与
竹材基质质量百分比为 110%时 ,木质素降解指标
最高 ,接近 3114% ,其次为培养液与竹材基质质量
百分比为 14%时的 2614%。由方差分析得因素 C
的影响不显著 ,所以为了节约时间 ,选择了 C1。最
终确定了本试验的最优组合为 A3 B2 C1 D3。也就是
说白腐菌混合菌在温度 32℃、pH310、固体发酵时
间为 20 d、培养液与竹材基质质量百分比为 110%
时降解木质素的效率最高。
表 2 L16 ( 45 )正交试验结果
试验号 A B C D 空 l列 木质素降解率 ( % )
1 1 (24℃) 1 (215) 1 (50% ) 1 (20d) 1 416
2 1 2 (310) 2 (80% ) 2 (25d) 2 1814
3 1 3 (315) 3 (110% ) 3 (30d) 3 2811
4 1 4 (410) 4 (140% ) 4 (35d) 4 2212
5 2 (28℃) 1 2 3 4 1514
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
续表
试验号 A B C D 空 l列 木质素降解率 ( % )
6 2 2 1 4 3 2817
7 2 3 4 1 2 1418
8 2 4 3 2 1 2513
9 3 (32℃) 1 3 4 2 3314
10 3 2 4 3 1 5016
11 3 3 1 2 4 3917
12 3 4 2 1 3 2813
13 4 (36℃) 1 4 2 3 1712
14 4 2 3 1 4 1912
15 4 3 2 4 1 1711
16 4 4 1 3 2 3115
表 3 正交实验结果方差分析表
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 显著水平
A 996158 3 33212068164 3 3
B 298195 3 9916520159 3
C 126109 3 42103 8168
D 436143 3 14514830106 3 3
误差 e 4184 3
总和 1862189
　　F0101 (3, 3) = 29146, F0105 (3, 3) = 9128, 3 3 表示极显著差异 , 3 表示有差异
图 1　因素与指标趋势图
2. 2 诱导剂对白腐菌降解木质素的影响
由图 2得 ,添加 H2 O2对白腐菌混合菌降解竹
材中木质素具有促进作用 ,而且随着添加浓度的
增加 ,木质素降解率不断增大 ,在 H2 O2浓度为 1%
时达到最大的 6219%。由图 3得 ,添加四种浓度
的苯甲醇对白腐菌混合菌降解竹材中木质素具有
促进作用 ,当浓度在 0110%时效果最佳 ,为 6718%。
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2009年第 12期 段传人等 :白腐菌混合菌降解木质素最佳条件的优化
3　讨论
通过正交试验 ,得出了在固态发酵条件下白腐
菌混合菌降解木质素的最佳条件 ,即当温度为
32℃、pH310、固体发酵时间为 20 d、培养液与竹材
基质质量百分比为 110%时降解木质素的效率最
高。试验表明该种白腐菌混合菌降解木质素的能力
较强 ,可能与各菌种间的相互协调作用机制有关 ,分
析认为不同种白腐菌混合培养 ,由于彼此间木质素
降解酶系、生活史长短、营养需求、生长因子及各酶
系的同工酶等不同的生物学特性互补 ,在分泌木质
素降解酶系上表现了较好的种属互惠性。研究发
现 ,该白腐菌混合菌对温度和接种时的培养液与竹
材基质质量百分比变化较敏感 ,而对试验中较长的
发酵处理时间作用不明显。
通过试验研究发现 , H2 O2和苯甲醇对白腐菌混
合菌降解木质素有明显的促进作用 ,已有的相关研
究表明 , H2 O2可以使锰过氧化物酶和木质素过氧化
物酶的活性显著提高 ,从而促进木质素的降解。而
苯甲醇是白腐菌产酶的调控因子和诱导剂 ,在对木
质素的降解作用十分显著。但这两种诱导物的具体
作用机制还有待进一步研究。
参 考 文 献
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5　 Hofrichter M1 Enzyme and M icrobial Technology, 2002, 30 ( 4 ) :
454～4661
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7　 Swamy J, Ram say JA1 App l M icrobiol B iotechnol, 1999, 51 ( 3 ) :
391～3961
(上接第 163页 )
数的不到 1% ,而当有石油污染物存在时 ,降解者的
比例增加到 10% [ 7 ]。
本研究从舟山船舶修造业周围的柴油污染土壤
和油污废水区域采样 ,经过富集培养和多次分离筛
选 ,得到 14株柴油降解菌 ,并筛选出 9株高效柴油
降解菌。通过对高效降解菌进行的初步鉴定 ,得到
6种不同的菌属。
进一步考察 2#菌对柴油的降解能力 ,试验结果
表明 , 2#菌株具有较高的柴油降解能力 ,降解率达
6517%。通过对 2#微球菌柴油降解因素的试验 ,表
明菌液接种量、柴油浓度、pH、温度及转速均对降解
效果有一定的影响。2#微球菌的生长期大致需 42
h;当接种量为 110 m l/L, 柴油浓度为 114 g/L, pH710,培养温度为 35℃,转速为 160 r/m in时 , 2#微球菌有较好的柴油降解能力。参 考 文 献1　 A tlas RM. Marine Pollution Bulletin, 1995, 31 (4) : 178～182.2　 Mark AS, James SB, Cheryl AP, et al. Ecological Engineering, 2004,23: 263～277.3　沈薇 ,杨树林 ,陆晓 ,等. 环境科学与技术 , 2006, 29 (1) : 16～19.4　藿尔特 JG,简明第八版伯杰细菌鉴定手册 [M ]. 济南 :山东大学出版社 , 1988.5　周建勇 ,顾跃明. 冶金分析 , 2002, 22 (3) : 51～53.6　钱奕 ,张鹏 ,谭大伟. 过程工程学报 , 2001, 1 (4) : 4.7 　 Marchal RP. O il & Gas Science and Technology, 2003, 58(4) : 414～448.
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