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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
具有抑菌作用的放线菌 GNF1 的分离鉴定和
生物学活性的研究
王磊 孙晗笑 李秀英 莫雪梅 张光
(暨南大学药学院基因组药物研究所，广州 510632)
摘 要: 从几种复合微生物有机肥中分离出一系列不同的菌株，与实验室保存的菌株 GNW(自生固氮菌)和 HP2(解磷
菌)混合接种培养，检测是否因基因杂交、突变等原因而产生具有抑菌作用的菌株。结果分离出一株具有抑菌作用的放线菌
菌株 GNF1，根据其形态学特征、生理生化特征和基于 16S rRNA基因序列的系统发育分析结果，鉴定其属于链霉菌属(Strepto-
myces)的一个菌株，GNF1 菌株的代谢产物中存在具有抑菌作用的活性成分，与植物根际促生菌 GNW、HP2 以及某些原核病原
微生物共培养培养时能明显抑制它们的生长。
收稿日期:2011-02-18
基金项目:广州市重大科技计划资助项目(2005Z1-E4081)
作者简介:王磊，男，硕士研究生，研究方向:微生物与生化药学;E-mail:sdwanglei1987@ 126． com
通讯作者:孙晗笑，女，教授，博士生导师，研究方向:基因组药物学;E-mail:sunhx718@ yahoo． com． cn
关键词: 根际促生菌 原核病原菌 共培养 代谢产物 抑菌作用
Isolation，Identification and Biological Activity of Actinomycete
GNF1 Exhibiting Bacteriostasis Activity
Wang Lei Sun Hanxiao Li Xiuying Mo Xuemei Zhang Guang
(Institute of Genomic Medicine，College of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou 510632)
Abstract: A series of different strains from compound organic fertilizers were isolated，then cultivated with the GNW and HP2
which persevered by our lab，to detect acteriostasis． The isolated bacterial strain was identified by morphological，physiological and bio-
chemical characters，respectively，and 16S rRNA of the strain was sequenced． The antibacterial activity mensuration of fermenting liquor
was to detect bacteriostasis activity． The results of identification demonstrated that an actinomycete GNF1 exhibiting bacteriostasis activi-
ty was Streptomyces，and there was active constitutent in its metabolic products which can strongly inhibit the growth of GNW，HP2 and
some pronucleus pathogenic microorganism．
Key words: Growth-promoting rhizobacteria Prokaryotic pathogenic microorganism Co-cultivate Metabolic products Bacte-
riostasis
植物根际土壤中含有大量的具有固氮、解磷、解
钾及分泌植物激素等功能的微生物，通过不同的方
式达到促进植物生长的作用。植物根际促生菌(plant
growth-promoting rhizobacteria，PGPR)就是其中一类
能定殖于根系并促进植物生长的细菌，可作为生物
有机肥料的良好菌株［1，2］。已有研究表明，多种菌
株混合培养时，各菌株之间存在着复杂的相互作用。
一类微生物可以为另一类的生长提供重要的物质，
或为其创造更有利的条件，有的甚至依赖其他微生
物而存活。各菌株之间可能进行直接或间接的相互
作用，互相提供所需的营养，转移或消除抑制物质，
或通过一些物理或生化机制刺激彼此之间的生理活
动［3］。谢应先［4］报道的土壤习居菌———固氮菌和
解磷解钾菌相互之间没有抑制作用或者只有微弱的
抑制作用。饶正华和常慧萍等［5，6］也都研究过固氮
菌、解磷菌和解钾菌之间的相互作用，显示这几种根
际促生菌确实能共同发挥作用促进植物生长。夏觅
真［7］在其研究中发现，有的解磷菌可能会抑制解钾
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
菌的生长，但当固氮菌、解磷菌解钾菌共同培养时有
助于磷钾的释放。当前的生物有机肥中所含的菌种
数量众多，大都包含有酵母菌、固氮菌、解磷解钾菌、
放线菌和霉菌等。这些菌株之间的互相作用复杂多
变，单纯地研究固氮菌和解磷解钾菌之间的相互作
用显得较为薄弱，更为重要的是，前人的研究较少关
注肥料中的菌种和土壤固有的菌株之间的相互作
用。此外，最初选定的某些菌株为复合微生物肥料的
菌种时并没有抑制作用，但菌株经过长期的发酵、繁
殖，发生了突变，从而表现出抑菌作用。因此，复合微
生物有机肥应对其菌株做定期观测，以减少此类菌株
的存在。因此，了解微生物之间的作用，合理选择菌
剂的最优组合，对于开发相关的微生物有机肥和微生
态制剂意义重大。另外，通过研究菌株之间相互作
用，有助于寻找出具有良好促生功能或抑菌功能的菌
株，可以在相关微生物制剂中进一步开发利用。
本研究旨在通过对复合微生物有机肥中的菌种
与土壤固有微生物之间的相互作用进行探究，检测
是否存在具有抑菌作用的菌株，拟优化此类复合微
生物有机肥的组合，并对其抑菌作用机制进行初步
研究，报道该菌株的分离鉴定和活性检测结果。
1 材料与方法
1． 1 材料
GNF1、GNW和 HP2 由本实验室前期用选择性
培养基分离、编号并保存。
1． 2 方法
1． 2． 1 抑菌作用菌株的初步筛选 将 GNW、HP2 和
GNF1三者混合培养，检测相关指标，初步找到具有抑
菌作用的菌株。培养基:葡萄糖 10 g，NaH2 PO4·
2H2O 2． 0 g，MgSO4·7H2 O 0． 5 g，FeCl3 0． 005 g，
(NH4)2SO4 0． 2 g，CaCO3 0． 1 g，磷矿粉 5． 0 g，蒸馏水
1 000 mL，pH7． 0 － 7． 5。于 200 mL 三角瓶中加入上
述培养基50 mL，高压灭菌备用。试验共设5个处理:
(1)对照(无菌水 3 mL) ;(2)接种 1 mL HP2 菌液 +
无菌水2 mL; (3)接种 1 mL GNW 菌液 + 无菌水 2
mL;(4)1 mL GNF1 菌液 + HP2 菌液 +无菌水 1 mL;
(5)1 mL GNF1菌液 + GNW菌液 +无菌水 1 mL;(6)
3株菌混合培养，同时接种 3 种菌液各 1 mL，每组重
复 3次。各处理以相同的细胞数接种，30℃、120 r /
min，培养 72 h 后，培养液进行消煮测全氮含量。同
时用稀释平板法在无氮培养基和无机磷培养基上测
定 3种菌的数量。其中氮含量采用凯氏定氮仪测定，
磷含量的测定采用钼锑抗比色法，钾含量的测定用离
子火焰分光光度计法［7］。
1． 2． 2 GNF1 抑菌作用的验证
1． 2． 2． 1 GNF1 的发酵培养液，经 10 000 r /min 离
心 5 min，得到上清液经微孔滤膜过滤后，分别加入
HP1 和 GNW已灭菌好的培养基中，28℃培养 48 h，
按照(发酵液 /mL +蒸馏水 /mL)0 + 1 000、10 + 990、
20 + 980、40 + 960、80 + 920，分 5 组培养，重复 3 次。
同时用稀释平板法在无氮培养基和无机磷培养基上
测定 GNW和 HP2 的数量，同时增加考查发酵液对
大肠杆菌(E． coli)的抗菌作用。
1． 2． 2． 2 用营养琼脂培养基培养指示菌 GNW 和
HP2，用管碟法［10］直接测定摇瓶发酵液抗菌活性，
以 30 pg /mL的链霉素作对照，每管加试液 20 μL。
1． 2． 2． 3 除 GNW和HP2之外，另选大肠杆菌(Esche-
richia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、
和变形杆菌(Proteus vulgaris)等原核病原微生物作
为受试菌株。方法同 1． 2． 2． 2。
1． 2． 3 形态学特征和生理生化特性检测 形态特
征、培养特征、生理生化特征和细胞化学特征按陈义
光等［8］所用的方法进行。
1． 2． 4 GNF1 菌株分子分析与鉴定 GNF1 菌株
DNA的 G + C含量测定参照 Marnut等［9］方法进行，
以大肠杆菌 DNA 的 G + C 含量为对照。选用天根
生化科技公司试剂盒提取菌株基因组 DNA 作为
PCR的扩增模板，采用细菌 16S rDNA通用引物 27 f
5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、1492r 5-TACG-
GTTACCTTGTTACGACTT-3 进行 16S rDNA 的扩
增。扩增体系采用上海生物工程公司 PCR 扩增试
剂盒。PCR产物测序后，利用相关软件进行 16S rD-
NA扩增序列分析，获得菌株聚类分析结果。
1． 2． 5 发酵液抗菌活性测定 对菌株 GNF1 的发
酵液分别用氯仿和正丁醇萃取，有机相合并，于
45℃蒸干，用等体积甲醇或二甲基氯化亚砜溶解，测
定其抑菌活性，用水相做对照。按常规方法，通测定
处理后抑菌圈的直径，进行发酵液中有效抑菌物质
的溶解性和紫外线、热和酸碱稳定性试验，受试菌株
为 HP2。
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2011 年第 4 期 王磊等:具有抑菌作用的放线菌 GNF1 的分离鉴定和生物学活性的研究
2 结果
2． 1 抑菌作用菌株的初步筛选
抑菌作用菌株的初步筛选结果(表 1)显示，
GNF1 与 GNW混合培养时，GNW 的数量较单独培
养时下降了 26． 2 %，培养液中的氮含量也明显减
低;同样，HP2 细胞数量混合培养比单独培养的低
38． 3 %。3 株菌混合培养时，抑菌效果相仿。在氮、
磷含量方面，混合培养时培养液中的氮含量和磷含
量较单独培养时也减少。推测这种现象的原因可能
有两种情况:一是由于 3 种菌混合培养时，生长空间
有限所致;另一方面可能由于 GNF1 的抑菌活性物
质的作用。所以下一步试验对推测进行了验证。
表 1 固氮菌 GNW、解磷菌 HP2 和 GNF1 混合培养的相互作用
处理 氮含量(mg /L) 磷含量(mg /L) HP2 数量(108CFU /mL) GNW数量(108CFU /mL)
不接种 37． 24 ± 1． 59 273． 51 ± 3． 68 0 0
HP2 26． 66 ± 2． 43 331． 45 ± 3． 42 14． 72 ± 0． 69 0
GNW 28． 34 ± 3． 57 214． 72 ± 2． 56 0 3． 24 ± 0． 37
GNF1 + GNW 27． 79 ± 2． 83 193． 46 ± 4． 42 0 2． 39 ± 0． 83
GNF1 + HP2 20． 96 ± 1． 21 227． 06 ± 3． 51 9． 07 ± 0． 65 0
GNF1 + GNW + HP2 14． 11 ± 2． 48 231． 47 ± 1． 96 9． 49 ± 0． 68 2． 04 ± 0． 26
2． 2 GNF1 抑菌活性的验证
2． 2． 1 涂板计数结果 经过发酵培养之后分别涂
板计数结果(图 1)显示，HP2、GNW 和大肠杆菌的
细胞数量随着 GNF1 发酵液添加量的增加而下降，
呈现一定的量效关系，推测 GNF1 代谢产物或分泌
物中一定含有某种抑菌活性成分。
1 － 5 组别分别按照(发酵液 /mL +蒸馏水 /mL)0 +
1000、10 + 990、20 + 980、40 + 960、80 + 920 的处理
方式分组培养
图 1 GNF1 发酵上清液对 GNW、HP2 和
E． coli生长的抑制作用
2． 2． 2 管碟法检测菌株的抑菌活性试验结果 利
用管碟法检测菌株的抑菌活性，结果(表 2)显示，发
酵液对 GNW和 HP2 土壤根际促生菌有抑制作用，
并对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和变形杆菌等原核
病原菌也具有较好的抑制作用。提示其抑菌活性成
分可应用到动物或人体皮肤肠道等，开发具有抗菌
作用或者调节菌群的微生态制剂。
表 2 菌株 GNF1 发酵液的抑菌活性
受试菌株
抑菌圈(mm)
发酵液 链霉素(30 μg /mL)
GNW 16 20
HP2 22 18
大肠杆菌 13 28
金黄色葡萄球菌 25 20
变形杆菌 10 25
2． 3 菌株的形态特性
菌株 GNF1 具有典型的链霉菌属(Streptomy-
ces)的特征:基内菌丝多分枝，不断裂，气生菌丝
丰富，孢子链直且长，偶有波曲，孢子呈柱状。菌
株在多数培养基上生长良好，气高氏淀粉琼脂上
气生菌丝体白至杏仁黄色，成熟时粉红发紫。基
内菌丝体玳瑁黄风帆黄色。可溶性色素微染;克
氏合成 1 号琼脂、察氏琼脂、淀粉铵盐琼脂:气丝
粉红色或粉红秸草色，毛状和粉状。基丝好，无
色或略微黄色、秸草色、浅棕色或微黄褐色。无
可溶色素。
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2． 4 生理生化特征
试验菌株 GNF1 的生长温度范围为 10 － 40℃，
最适温度为 28℃。生长 pH 范围为 6． 0 － 8． 5，最适
pH 7． 0 能在含 0 － 1． 5 mol /L NaCl 的 ISP2 和 MBA
琼脂上生长，最适生长盐浓度为 0． 2 － 0． 5 mol /L
NaCl。明胶液化、淀粉水解、硫化氢产生阴性;不能
水解 Tween20 和酪素(Casein) ;黑色素产生、牛奶胨
化、纤维素水解和硝酸盐还原阴性。菌株 GNF1 能
利用多种物质做碳源(表 3)和氮源(表 4)。菌株
GNF1 全细胞水解产物中含甘氨酸、天门冬氨酸等
氨基酸，含葡萄糖、半乳糖、木糖和核糖等糖类。上
述这些结果与链霉菌属特征相符。
表 3 不同碳源条件下 GNF1 的生理生化特性
碳源 结果 碳源 结果
葡萄糖 + 棉子糖 +
果糖 + 鼠李糖 +
淀粉 + 核糖 +
半乳糖 + 醋酸钠 +
乳糖 － 纤维二糖 －
丙三醇 － 蔗糖 +
肌醇 + 山梨醇 l +
阿拉伯糖 + 海藻糖 +
麦芽糖 + 木糖 －
甘露醇 + 木糖醇 +
甘露糖 +
“ +”表示阳性;“ －”表示阴性;下同
表 4 不同氮源条件下 GNF1 的生理生化特性
氮源 结果
丙氨酸 +
甘氨酸 +
苏氨酸 +
谷氨酸 －
酪氨酸 －
甲硫氨酸 +
天冬酰胺 +
天门冬氨酸 －
2． 5 GNF1 菌株的分子分析
GNF1 菌株分子分析结果(图 2)显示，该菌株
G + C 含量为 71． 2%，16S rRNA 扩增序列长度为
1 458 bp，电泳结果在 1 500 bp 附近有明显的条带
出现。进一步的 Blast 与聚类分析(图 3)显示，与
GNF1 菌株 16S rRNA 同源性较高的菌株均为链霉
菌属放线菌。从中选择 12 条同源性较高的 16S
rRNA序列来构建系统发育树发现，GNF1 菌株与细
黄链霉菌(Streptonmyces microflavus)的 16S rRNA 序
列仅相差 6 个碱基，同源性达 99． 6%。结合菌株的
形态和生理生化特征，初步鉴定将 GNF1 菌株暂定
为 Streptonmyces microflavus。
图 2 GNF1 的 16S rDNA电泳图
图 3 GNF1 的系统发育树
2． 6 抗菌活性物质的疏水性和稳定性
抗菌活性物质的疏水性和稳定性检测结果表
明，抑菌物质具有较强的脂溶性，易溶于氯仿、正丁
醇等有机溶剂，也显示出良好的抑菌效果，而萃取后
的水相没有抑菌活性。用紫外线、高温和强酸强碱
对发酵液进行处理，测定其抗菌活性。另外，初步研
究结果表明抑菌活性物质具有良好的光稳定性和热
稳定性。发酵液在紫外灯下照射 30 min 后，抑菌活
性基本没变;在 30 － 45℃之间抑菌活性稳定，在
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2011 年第 4 期 王磊等:具有抑菌作用的放线菌 GNF1 的分离鉴定和生物学活性的研究
45 － 60℃之间有些许下降，大于 60℃后处理 1 h 其
抑菌活性逐渐降低(图 4) ;可是抗菌活性物质的酸
碱稳定性较差，只在 pH5． 0 － 7． 5 的条件下有较强
抑菌活性，在低于 4． 8 或高于 8． 0 的环境下活性大
为降低(图 5)。活性物质的分离、纯化和结构解析
等研究正在进行中。
图 4 抑菌活性物质在不同温度处理的结果
图 5 抑菌活性物质的酸碱稳定性
3 讨论
生态系统中各种生物之间存在着十分复杂的关
系，因此微生物有机肥料在菌种选择和配搭时，需要
进行一系列的根际接种试验，研究植物根际的微生
物即植物与微生物，微生物与微生物以及土壤与微
生物之间的相互作用，为科学合理地选择能够共生、
促生的菌株提供参考，这也正是本试验的最初目的
和意义之所在。在试验过程中发现，放线菌 GNF1
能够抑制一些菌株的生长，说明微生物有机肥中含
有抑菌作用的菌株存在，类似的研究未见有报道。
显然，微生物有机肥中应尽量减少类似的菌株
和抑制作用的存在，这就要求在微生物有机肥的生
产过程中需要严格把控菌株菌种的合理性安全性;
根据对其形态培养特征、生理生化特性和系统发育
分析的研究结果，菌株 GNF1 具有链霉菌菌株典型
的特征，应归于此属。形态学与分子生物学分类鉴
定结果表明，GNF1 菌株虽然同细黄链霉菌的 16S
rRNA 扩增序列同源性达 99． 6%，但仅依据 16S
rRNA确定其种的分类地位存在一定的局限性。其
最终的分类地位仍需与模式种 Streptonmyces mi-
croflavus 进行 DNA分子杂交，并结合两菌株的生理
生化特性才能确定。因此，将菌株暂定为 Strepton-
myces microflavus。该菌广泛分布在土壤中，我国最
早从山西省土壤中分离得到，能产生抗生素，对革兰
氏阳性及阴性细菌、酵母菌和丝状真菌都有抑制作
用，同时能转化土壤中氮磷元素，提高土壤肥力，并
有刺激作物生长作用。这也表明，最初选该菌株作
为微生物有机肥料的菌种是因为该菌的解磷固氮能
力，可能最初选定的该菌株时并没有明显的抑制作
用。但菌株经过长期的发酵、繁殖，发生了突变等效
应，从而表现出较强的抑菌作用。因此，复合微生物
有机肥应对其菌株做定期的观测，以减少此类菌株
的存在。关于该菌株对植物根际促生菌的抑制作用
的报道，国内外尚属首次。
链霉菌属菌株具有丰富的物种多样性和代谢类
型多样性，是极其重要的产生天然活性产物的资源
微生物。自 20 世纪 60 年代至今发现的 12 000 余
种微生物来源的新生理活性物质中，55%以上是由
链霉菌属菌株产生的［11］。目前临床上应用的抗生
素约 2 /3 来源于链霉菌属，该属产生的生物活性物
质还包括抗肿瘤剂、免疫抑制剂和抗虫剂等。链霉
菌菌株仍然是主要的微生物天然活性产物或药物先
导化合物的产生菌［12］。进一步研究发现，GNF1 的
发酵液中具有良好的抑菌作用的活性成分，可考虑
将其开发出微生态制剂等，使其具有更广泛的应用
前景。微生态制剂是根据微生态原理制备的制剂。
其目的是调整微生态失调，保持生态平衡，提高人体
的健康水平，以达到防病、治病的效果［13，14］。微生
态制剂最初兴起时，被认为只有活的微生物才能起
到微生态的平衡作用，因此认定微生态制剂是活菌
制剂。但随着科学研究的深入，微生态制剂的不断
发展，大量资料证明，死菌体、菌体成分及代谢产物
也具有调整微生态失调的功效［15］。另有研究表明，
细菌培养后除去菌体的培养液，内含细菌生长繁殖
过程丰富的代谢产物及一部分菌体碎片(成分) ，细
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菌分泌的酸性物质及细菌素对有害菌有拮抗、杀灭
作用。
通过试验发现，GNF1 菌株的代谢产物中存
在某种具有抑菌作用的活性物质成分。细黄链
霉菌 GNF1 变种菌种在液体发酵条件下所产生抗
菌物质对多种微生物有拮抗作用;而且抗菌谱较
广，对革兰氏阳性菌(如金黄色葡萄球菌)、革兰
氏阴性菌(如大肠杆菌)以及一些植物根际促生
菌均具较强的抑制作用。该活性物质成分可能
是 GNF1 分泌的，也可能是其代谢产物的某种成
分与培养液中的诸多成分之间的复杂作用，转变
成了具有抑菌作用的物质。其明确的活性物质
是否与已知的抗生素是同一生物活性组分，需经
分离纯化和结构解析等相关研究;毒理特性及其
抑菌机制等有待进一步研究。
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(责任编辑 李楠)
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