全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
糖微阵列技术在糖组学研究中的进展
陈礼刚　陈晓艺　郭继强　刘志文　李宪臻
(大连工业大学生物与食品工程学院 ,大连 116034)
　　摘 　要 : 　聚糖多以蛋白质和脂配基形式存在 ,在生物体内的信息传递、细胞识别和蛋白质折叠等生物过程中具有十分
重要作用 ,是继核酸和蛋白质之后被发现的第三类生物信息分子。但聚糖结构复杂 ,并存在大量异构体 ,无法象 DNA一样进
行合成和测序。根据聚糖分子能够与凝集素或糖结合蛋白特异性结合 ,提出并发展了糖微阵列技术。此技术在聚糖结构与
功能研究中已显示出优越性。通过对糖微阵列构建方式及检测方法的探讨 ,对近些年来糖微阵列技术的发展进行了综述。
关键词 : 　糖微阵列 　聚糖 　糖生物学 　荧光检测 　凝集素
Advance in Technology of Glyco2m icroarray for Glycom ics
Chen L igang　Chen Xiaoyi　Guo J iqiang　L iu Zhiwen　L i Xianzhen
(Departm ent of B io & Food Engineering, Dalian College of L ight Industry, Dalian 116034)
　　Abs trac t: 　Most of glycan are linked in p rotein and lip id molecules as ligand1 Glycan which has been assigned as bioinformatic
molecule following DNA and p rotein, is significant in the p rocess of information transm ission, cellular recognition and p rotein fold2
ing1The comp licated structure and isomers of glycan can not be synthesized and sequenced easily like DNA1 However, it has been
p roved that glycan can interact specially with lectin or carbohydrate2binding p rotein, which can be assessed by high2through detection of
glyco2m icroarray technology1 The establishment and advantages of glyco2m icroarray in studying the structure and function of carbohy2
drate was reviewed in this paper1
Key wo rds: 　Glyco2m icroarray　Glycan　Glycobiology　Fluorescence detection　Lectin
收稿日期 : 2008212218
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30670067)
作者简介 :陈礼刚 (19822) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :发酵工程
通讯作者 :李宪臻 ,教授 ,博导 ; Tel: 0411286314195, E2mail: xianzhen@dlpu1edu1cn
　　聚糖分子多以糖蛋白或糖脂形式存在于生命体
细胞表面 ,在介调细胞吸附、信息传递、免疫识别、病
原性攻击和蛋白质折叠与排列等过程中具有十分重
要的作用 [ 1 ]。虽然有关聚糖生物学功能的研究已
有很多 ,但糖结构与功能间的关系并未得到很好理
解 ,而且 ,不同研究常常会得到相互矛盾的结论 [ 2 ]。
与蛋白质磷酸化一样 ,糖基化现象普遍存在于真核
生物中 ,但与磷酸化的简单形式不同 ,糖基化异常复
杂 [ 3 ]。聚糖具有高度的结构多样性 ,因为组成聚糖
分子的单糖已发现有 60多种 ,而且每种单糖都含有
各种形式的异构体 ,相同糖残基间也存在不同的糖
苷键连接方式和分支结构 [ 4 ]。糖是基因的间接产
物 ,是多糖基因 -多蛋白 -多聚糖 ,而非单基因 -单
产物 ,聚糖无法采用类似 PCR技术进行扩增。聚糖
不能用自动序列仪直接测序或自动合成仪合成 ,一
些常用的 DNA和蛋白质基本技术无法用于聚糖研
究。所以 ,为了有效开展糖结构与功能研究 ,人们建
立了一种新的研究方法 ———糖微阵列技术 [ 5 ] ,它是
以 DNA微阵列技术为基础 ,具有高通量和高灵敏
度 ,可以用于聚糖结构分析。
1　糖微阵列技术
微阵列技术是许多微型化学反应区域的集合 ,
2002年首先被用于糖生物学研究而形成了糖微阵列
技术 [ 6 ]。它是将数以千计的寡糖序列以点阵形式固
定在特定的基板上 ,并通过高通量扫描技术分析糖分
子与其他生物分子间的特异性相互作用 ,研究聚糖在
生物体中的功能和作用机制 [ 7 ]。固相载体表面一般
都经过特殊理化处理 ,聚糖分子采用化学合成或直接
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
从生物体中分离。糖微阵列技术从产生到现在大约
有 6年的时间 ,在固定方法、表面处理和高通量检测
方面已有很大进步 ,在糖与蛋白质相互作用研究中也
取得了很多引人注目的结果 [ 8 ]。但是 ,糖微阵列制备
的关键是将糖分子固定在固相载体上的适当方法 ,这
很大程度上依赖于材料化学的发展 [ 9 ]。
糖微阵列的制备和分析与基因芯片类似 ,用于
DNA 阵列技术的各种自动化设备也可用于糖微阵
列研究。有两种方式可用于糖微阵列中的聚糖固定
化 ,分别是基于糖分子在载体表面的物理吸附作用
而固定和共价固定。多数固定化方法是将糖配基固
定在载体表面以形成二维单分子层 ,迄今已被固定
化的糖配基数量已增加到 200多种 [ 7 ]。糖微阵列制
备的主要步骤包括 : (1)糖库的建立 ,方法类似于基
因库和蛋白质库的建立 ,糖的主要来源是通过化学
合成、酶合成和生物合成 ; (2)样品的固定化 ,共价
固定化主要通过糖分子和载体之间的化学反应形成
共价键 ,非共价固定化主要通过糖分子和固相载体
之间的吸附作用 ; (3)标记的检测和数据处理 ,标记
方法主要有荧光标记和放射性标记 ,检测方法主要
依靠矩阵扫描仪以及质谱、液相色谱等。
糖微阵列技术最显著的特点是样品用量小、一次
性检测样品多 ,可同时对成百个样品进行分析、检测
和鉴别 [ 10 ]。糖微阵列可以将无数种糖配基固定在一
个非常小的芯片上 ,在同一条件下同时进行大量样品
的多参数检测。因此微阵列可以提供一种比传统方
法更灵敏和适当的分析系统 [ 11 ]。糖微阵列可以直接
表征糖 -蛋白间的相互作用 ,糖在载体表面的吸附也
能有效模拟这些化合物在细胞膜上的表现。
2　糖微阵列构建方式
糖微阵列构建方法是糖微阵列技术的关键 ,某
些依赖于糖与支持物间非特异性吸附的固定化方法
已被成功用于寡糖、聚糖、糖脂、糖蛋白和糖接合物
等糖生物学研究 [ 12, 13 ]。
211　共价连接单 (双 )糖微阵列
共价连接糖微阵列是将单 (双 )糖通过共价连
接方式固定在包被有单层活化基团的玻璃片载体上
形成的 [ 14 ]。一般是先将单 (双 )糖分子衍生化 ,然
后在糖环的 C6位置上转化成含有顺丁烯二酰亚胺
共轭键的糖衍生物 ,这种顺丁烯二酰亚胺共轭基团
与载体表面上的硫醇或苯醌基团通过加成或环化加
成反应连接在载体上 [ 15 ]。如图 1所示 ,载体表面处
理方式有两种 ,一种是用硫醇基团直接修饰载体
(图 12A ) ,另一种是将一个含有末端苯醌基团的烯
硫醇固定在载体表面形成单分子层 (图 12B )。当用
荧光标记的植物凝集素分析这种共价固定的单
(双 )糖探针的结合特异性时 ,不同凝集素分别按照
已知的特异性分别与各自的单糖或双糖相互结
合 [ 14 ]。这种方法的优点是无需添加额外的化学试
剂 ,反应速度快 ,符合糖微阵列的要求 ,因而是糖微
阵列的理想模型。
图 1　糖的共价连接固定化方法
随后 ,B iskup等 [ 16 ]提出了一种通过还原氨基化
或酰胺化将含有醛 (胺 )基的糖固定在氨基化 (甲酸
基化 )玻璃片上的方法。如图 2所示 ,首先通过一个
三乙二醇将单 (双 )糖与甲酰甲醇或氨基丙醇结合 ,
形成含有醛基或胺基的糖衍生物 ,然后用氢硼化氰钠
作为还原剂 ,将糖衍生物上的醛基与玻璃片上的胺基
发生还原氨基化反应而固定在载体表面 ,或者将糖衍
生物中的胺基与玻璃片上的羧基反应而固定。这种
方法的优点是可以在温和条件下进行固定化反应 ,糖
基上的各种功能基团无需保护。聚糖探针可以用荧
光染料进行标记并检测 ,首先在糖残基上连接一个含
有醛基或胺基的三已胺作为胺基化或醛基化载体的
固定连接物 ,然后将糖环 C6位上的叠氮基团进行氢
分解以释放出胺基 ,并在三已胺为碱试剂的催化下 ,
与荧光染料的磺酰基团共价结合实现荧光标记 ,最后
用三氟醋酸或氢氧化锂处理以暴露出醛基或氨基用
于固定。聚糖的固定方法影响阵列的荧光强度 ,在氨
基化玻璃片上的固定效果较好。
Angeloni等 [ 17 ]也开发了一种基于葡聚糖覆膜
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2009年第 6期 陈礼刚等 :糖微阵列技术在糖组学研究中的进展
图 2　还原胺基化、酰胺化固定化方法
玻璃片的万能微阵列平台 ,可用于共价固定聚糖和
凝集素等。它是以芳酰三氟甲基重氮基团衍生化的
葡聚糖为介质 [ 18 ] ,如图 32A所示 ,芳酰三氟甲基重
氮基团经光诱导形成活性碳烯后 ,能够与临近分子
形成共价键 ,这种方法能够用一步法共价连接任何
分子。光诱导共价固定生物分子的反应机理如图
32B所示 ,芳酰三氟甲基重氮基团通过甲硫二胺连
接在葡聚糖覆膜上以活化载体表面后 ,在 350 nm光
照下形成高度活性的碳烯并释放出氮气 ,碳烯能够
自发地发生插入反应 ,并与生物分子形成共价连接。
图 3　光诱导化学反应共价固定化方法
212　非共价吸附多糖微阵列
W ang等 [ 19 ]首先报道了这种疏水性吸附糖微阵
列技术 ,它是将多糖或糖蛋白通过非共价吸附固定
在表面疏水性载体上。多糖的高分子量和疏水性决
定了它能够与载体表面进行非共价吸附结合。载体
表面通常涂有高分子薄膜以增加表面疏水性 ,载体
的疏水表面要经过风干以提高载体对多糖的非共价
固定能力。固定化过程采用高精度的自动阵列仪 ,
而多糖探针的连接无需衍生化。目前所使用载体主
要有两类 ,一类是硝酸纤维素膜 ,另一类是具有粗糙
表面的相对疏水的聚苯乙烯膜。当将荧光标记的葡
聚糖或菊糖等阵列在载体表面上 ,并进行冲洗以评
估其固定化程度时发现 [ 19 ] ,尽管固定化效率与分子
量有关 ,但全部聚糖都能被固定在载体表面上 ,分子
量越大的聚糖固定化效果越好。这种糖微阵列在细
菌多糖的抗原分析方面有较好的应用结果。
213　寡糖微阵列
寡糖分子由于仅由 2～20个单糖组成 ,与多糖
相比具有分子量低和亲水特性 ,无法采用非共价固
定方法进行微阵列 ,为了克服这一缺点 , Feizi等 [ 5 ]
通过在寡糖分子中连接一个脂分子而建立了一种新
生糖脂微阵列技术。这种方法的基本原理是通过还
原氨基化 ,在寡糖分子上连接一个氨基磷脂 1, 22二
双十六脂酰 2sn2甘油 232磷酸乙醇胺形成新生糖脂 ,
或者衍生化形成糖基神经酰胺 ,以增加寡糖探针的
疏水性 ,然后通过疏水力很容易地被非共价吸附在
硝酸纤维素膜上 (图 42A )。目前已经制备了多种
类型的新生糖脂 ,如糖蛋白 (N2聚糖和 O2聚糖 )、糖
脂、蛋白多糖和多聚糖等 ,这种微阵列中的寡糖探针
能够与凝集素、抗聚糖抗体、抗硫酸软骨素血清和糖
结合细胞因子或趋化因子特异性结合。新生糖脂的
制备在糖组学研究中具有重要意义 ,因为足够量的
纯聚糖制备通常都比较困难。从技术观点出发 ,尽
管这种方法有进一步提高的潜力 ,但检测通量和灵
敏度仍不能充分满足后基因组学所需要的水平 ,因
为这种方法所需要新生糖脂的量仍然相对较大。
为了简化新生糖脂的制备和纯化过程 , Fazio
等 [ 20 ]建立了一种新的寡糖探针固定方法 ,如图 42B
所示 ,首先通过非共价吸附将长链脂肪炔固定在固
相支持物表面 ,然后加入连接有叠氮基团的寡糖 ,通
过 1, 32偶极环化加成反应将叠氮基团和炔基团原
位结合而连接到脂肪链上 ,达到固定化目的。当饱
和烃链的长度为 13～15碳时 ,单糖能够被完全保留
在固相支持物表面而不被冲洗掉 ,因此选择 14碳饱
和烃用于连接 2～6糖寡糖 ,冲洗和凝集素结合实验
证实寡糖探针能够被稳定地固定在载体表面 [ 21 ]。
该方法比较方便质谱对脂连接产物的表征、以及凝
集素结合产生颜色的检测等。
214　消失场荧光辅助凝集素微阵列
凝集素微阵列可以通过凝集素亲和技术获取聚
糖结构的核心信息 ,如 N2糖基化或 O2糖基化、高甘
露糖型或复合型、全部或部分神经氨酸化等 [ 22, 23 ]。
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图 4　新糖脂非共价吸附固定化方法
但是 ,考虑到凝集素 -聚糖相互作用相对较弱 , Kuno
等 [ 24 ]提出了一种基于消失场荧光检测方法的凝集素
微阵列技术。这种微阵列的优点是 : (1)可以不经冲
洗直接在糖 -凝集素结合反应的平衡条件下对糖 -
凝集素相互作用进行分析 ; (2)能够对阵列中各种凝
集素 -糖相互作用进行实时扫描 ; (3)能够对凝集素
-糖和蛋白 -抗体相互作用进行同时检测 ,以便与结
合在核心蛋白上的抗体进行糖基化差异性比较 ; (4)
能够同时测定几种凝集素 -糖相互作用的解离常数。
因为在较低折光指数样品介质中 ,消失场 (一种电磁
波 )仅能在远离传感器表面的波长中 (100～200 nm )
传播 ,所以消失场方法适于凝集素 -糖蛋白间等较弱
反应的分析 ,这是因为在探针反应后可以不经冲洗而
直接对进行中的相互反应原位检测。其构建过程与
蛋白芯片制作方法类似 [ 25 ] ,以 32环氧丙醇基丙醇三
甲氧基硅烷为交联剂。
3　糖微阵列技术展望
糖组学是继基因组学之后的一个重要研究领
域 ,许多生物信息都以丰富多样的复合糖形式存
在 [ 26 ] ,因此 ,糖微阵列技术作为糖组学研究的重要
手段将成为关注的焦点。但是糖微阵列还处于技术
开发的初级阶段 ,在很多方面需要进一步研究 ,如新
的构建方法、新的表面材料和显影技术、进一步微型
化、灵敏的检测技术和数据处理工具等。糖微阵列
中被固定糖探针具有高度稳定性 ,有利于推进基于
糖微阵列技术的诊断工具的开发。但是 ,迄今尚没
有一种象核酸扩增那样类似的 PCR技术可用于糖
链扩增 ,严重阻碍了糖微阵列技术的应用。研究证
实 ,很多抗体、凝集素和细胞感受器等都能与聚糖分
子特异性结合 ,它们是糖微阵列技术用于揭示生物
体内聚糖功能的重要基础 ,一旦与单克隆抗体技术
结合 ,糖微阵列技术将会对糖组学研究起到十分重
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