全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
虫生真菌抗逆的生化分子基础及利用
王定锋 曾明森 王庆森 吴光远
(福建省农业科学院茶叶研究所,福安 355015)
摘 要: 虫生真菌在生活史各个阶段均面临多种环境因子的危害。为了避开这些不利的因素,虫生真菌进化出多种抗
逆的机制。近年来, 以球孢白僵菌 (Beauver ia bassiana)和金龟子绿僵菌 (M etarh iz ium anisop liae)为代表的虫生真菌抗逆的生化
分子基础的研究取得了一定的进展,明确了某些生化成份和抗逆基因与菌株抗逆性能的相关性。就环境胁迫因子、虫生真菌
抗逆的生化分子基础及其在改良菌株抗逆性能方面的应用进行综述,这将为环境适应性强的虫生真菌制剂的研发与应用提
供理论依据。
关键词: 虫生真菌 环境胁迫 抗逆机理 菌株改良 微生物防治
Biochem ical andMolecular Bases of Stresstolerance of
Entomogenous Fungi and Their Application
W ang D ingfeng ZengM ingsen W angQ ingsen W u Guangyuan
(T ea Research Institute, Fujian A cademy of Agricultural Sciences, Fu an 355015)
Abstrac:t En tom ogenous fung i suffer harm from several env ironm ental facto rs during every lifecycle stage. In order to escape the
d isadvantages, entom ogenous fung i form m any stressto lerance m echan ism. Recent stud ies havem ade som e prog ress in biochem ica l and
m olecular bases of stressto lerance ofBeauver ia bassiana andM etarhiz ium an isop liae, and expound some biochem ica l components and
stressto lerance genes in assoc iation w ith the performance o f strain stressto lerance. The env ironment stress facto rs, the biochem ica l and
m olecular bases of stressto lerance o f entom ogenous fung i and the ir app lication in stressto lerance improvem en t have been rev iew ed in
this paper, wh ich prov ided theoretica l basis o f the deve lopm en t and application o f env ironm enta l stab ility fungal agents.
Key words: En tom ogenous fung i Env ironm enta l stress Stressto lerancem echanism S train im provement M icrob ia l contro l
收稿日期: 20100412
基金项目:福建省属公益类科研院所基本科研专项 ( 2009R100304 ) ,福建省农科院青年人才基金项目 ( 2009QB14 )
作者简介:王定锋,男,硕士,研究方向:杀虫微生物分子生物学; Em ai:l w angd f2005@ yahoo. com. cn
通讯作者:吴光远,男,研究员, Em ai:l gyw upt@ 163. com
化学农药是防治病虫草害的重要手段, 但长期大
量使用所引起的害虫抗药性产生、再猖獗和农残超标
等问题,已经严重影响了生态环境和人类健康。近年
来, 杀虫真菌制剂等生物农药的开发与应用正日益
受到人们的重视。截至 2007年, 全世界已有 171个
真菌杀虫剂产品注册成功, 其中以球孢白僵菌和金
龟子绿僵菌为有效成分的制剂各占 339% [ 1 ]。尽
管虫生真菌作为生物杀虫剂具有许多优点, 但也存
在击倒害虫时间长、受环境影响较大等弊端,限制了
它们在生产上的推广应用。虫生真菌的杀虫效果
除了与其自身致病力强弱有关, 还在很大程度上
受外界环境因素的影响 [ 2]。菌株自身的抗逆性能
对菌剂的环境适应性起决定性的作用。因此, 有
必要加强虫生真菌抗逆生化分子基础的研究及菌
株改良, 以便获得环境适应性强的生防菌株。通
过对虫生真菌面临的环境胁迫因子、虫生真菌抗
逆的生化分子基础及其利用的研究进行了综述,
为真菌杀虫剂的大规模商业化生产及应用提供
参考。
1 环境胁迫因子
虫生真菌在生活史各个阶段可能受到环境温
度、湿度、紫外线和其它生物 /非生物因子的胁迫,这
些影响因子经常交互作用影响孢子活力和侵染力,
制约着真菌杀虫剂在生产上的大规模应用。
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
1. 1 环境温度
环境温度是影响真菌杀虫剂贮存稳定性的一个
重要因素 [ 3 ]。在过冷或过热的环境中贮存的真菌
制剂都有可能损失或丧失活性或毒力 [ 4]。在 4! 下
贮存, 孢子活力可保持 128周, 8! 下孢子的萌发力
至少保持 52周, 而 23! 下保持 6- 13周, 30! 下仅
保持 4- 7周 [ 5 ]。含水量低于 5%的白僵菌孢子粉
在 4! 下贮存 1年仍有 90%左右的活孢率, 毒力也
维持较高水平;而 20! 下贮存的孢子在 8个月后完
全失活, 毒力也随之丧失 [ 6]。王成树等 [ 7]研究表
明,分生孢子的耐热性与其贮藏寿命存在显著正相
关关系,通过菌株耐热力的测定,可以间接评估孢子
的贮藏稳定性。环境温度也是影响真菌杀虫剂杀虫
效果的一个重要因素 [ 8, 9]。在 15! 以下和 35! 以上
的环境中,白僵菌孢子的发芽和生长均受抑制 [ 10] ,炎
夏高温甚至完全阻止孢子萌发 [ 5] , 不利于真菌病害
在昆虫种群内流行与传播。
1. 2 湿度
孢子的含水量与贮存温度经常交互作用, 影响
真菌孢子的贮藏寿命 [ 2]。如在低温 ( 4! )密闭的容
器内以及特定的储存期,随着孢子粉含水量的升高,
其活孢率显著下降 [ 11 ]。黄芳芳等 [ 12]通过存活衰变
模型预测白僵菌孢子粉冷贮 ( 4! )的含水量应控制
在 8%以下,才能保证贮藏 1年半以上的时间活孢
率不低于 90% ;而常温贮藏必须把孢子粉的含水量
控制在 5%以下, 才能贮藏 3个月以上并使活孢率
达 80%。研究还表明, 仅通过降低孢子粉含水量
( < 50% )的方法难以延长孢子粉在常温下的贮存
期 [ 6]。湿度对白僵菌孢子的萌发率和萌发时间都
有显著影响,较低的湿度会延长其萌发时间 [ 10 ]。在
田间应用阶段,高湿度是孢子萌发必不可少的条件,
多数虫生真菌孢子常在 95%以上的相对湿度下才能
在昆虫体表萌发和侵入 [ 13]。此外,较高湿度的土壤
还可以提高土壤中宿存的白僵菌孢子的存活率 [ 14]。
1. 3 紫外线
紫外线对活体细胞的伤害主要表现为使 DNA变
性和促使细胞内形成活性氧自由基的毒害作用 [ 15]。
日光照射 (尤其是其中的 UVB )对昆虫病原真菌的
田间存活率具有很大的负面影响 [ 16] , 影响孢子发芽
和菌丝生长,甚至杀伤白僵菌分生孢子 [ 17]。暴露在
UVB紫外光下使金龟子绿僵菌分生孢子的活孢率
降低及萌发时间延迟,从而导致菌株的杀虫毒力下
降 [ 18]。在相同的照射时间里, 随着紫外照射强度的
增加金龟子绿僵菌分生孢子的存活率和 LC50都显
著下降 [ 19]。研究还表明, 虫生真菌对 UVB的辐射
耐受力在种间甚至种内都存在较大差异 [ 20]。此外,
来源于低纬度的菌株往往具有较强的紫外辐射耐
受力 [ 16]。
1. 4 其它生物 /非生物因子
除了环境温度、湿度和紫外线的胁迫外,虫生真
菌还面临其它生物 /非生物因子胁迫,如其它微生物
拮抗作用 [ 21]、寄主的行为 [ 22, 23 ]和化学农药 [ 24 ]等因
素的影响。
2 虫生真菌抗逆的生化分子基础
虫生真菌侵染寄主的侵染体,包括分生孢子、芽
生孢子和菌丝体是具有细胞结构的活体物质, 其中
分生孢子常被加工成多种剂型 [ 2] , 其对环境胁迫的
抵抗力既影响真菌制剂的贮存稳定性又影响菌剂的
田间适应性和杀虫效果 [ 2, 25]。大量的研究证明, 真
菌对环境胁迫的耐受力与细胞中某些生化成份 (蛋
白质、海藻糖、多元醇等 )的代谢密切相关 [ 9, 26 30]。
此外,许多与真菌抗逆性相关的功能基因也相继被
研究证实 [ 28, 31 37 ]。
2. 1 蛋白类物质
Y ing等 [ 9, 26, 38]研究发现球孢白僵菌和玫烟色拟
青霉分生孢子的胞壁类疏水蛋白与分生孢子的耐热
性密切相关,通过改变培养条件来积累球孢白僵菌
分生孢子胞壁类疏水蛋白可以增强其耐热力。黄宝
福 [ 39]则提出, SOD酶活水平有可能成为筛选耐胁迫
生防真菌的有用参考指标。
2. 2 胞内相容性溶质
大量的研究证实, 多元醇 (丙三醇、赤藻糖醇
等 )和海藻糖等胞内相容性溶质的积累对真菌抗逆
性具有重要的意义 [ 27 30 ]。在构巢曲霉中丙三醇和
赤藻糖醇是适应渗透压变化的主要调节溶质 [ 40] , 而
分生孢子胞内丙三醇和赤藻糖醇的积累有利于球孢
白僵菌、金龟子绿僵菌和粉拟青霉在低水活度环境
下快速萌发 [ 27]。海藻糖是广泛存在于各种生物体
内的抗逆境剂 [ 41] , 在面临热激、冷冻、干燥、氧化应
激及有毒化学物质等逆境时, 丝状真菌和酵母合成
50
2010年第 10期 王定锋等 :虫生真菌抗逆的生化分子基础及利用
大量的海藻糖 [ 28]。高浓度海藻糖可通过增加酶的
稳定性保护真菌孢子免受热激损伤 [ 42]。 Liu等 [ 30]
也证明球孢白僵菌孢子中海藻糖的积累有助于提高
其耐热性。研究还表明, 细胞内海藻糖积累水平与
球孢白僵菌、金龟子绿僵菌、粉拟青霉及哈茨木霉等
丝状真菌孢子的贮存寿命有关 [ 27 ]。
2. 3 色素
在许多真菌中, 孢子色素的积累对于真菌的
抗逆性具有重要的意义 [ 43]。 B raga等 [ 44 ]研究金龟
子绿僵菌的分生孢子胞壁颜色深度 (黑色素 )与紫
外辐射耐受力的关系时, 发现胞壁无色或颜色较
浅的突变体抗紫外辐射的能力比原始菌株 (深绿
色 )弱; 而对胞壁颜色较浅的突变体进行回复突变
时, 当孢子颜色恢复为深绿色, 其对紫外辐射的耐
受力也恢复到了原始菌株的水平。Rangel等 [ 45 ]对
同一原始菌株的研究得出相似的结果, 但对金龟
子绿僵菌 ARSEF2575菌株进行相似的研究, 却发
现原始菌株与突变菌株的胞壁颜色对孢子的紫外
敏感性影响较小, 而且有些突变体比原始菌株具
有更强的耐热性。
2. 4 抗逆相关的关键基因
目前虫生真菌抗逆基因的研究已经引起了越来
越多研究者的关注, 并取得了一定的进展。早在
1992年, St Leger等 [ 31 ]就从金龟子绿僵菌中克隆到
与营养胁迫相关的疏水蛋白基因 ssgA。此后, 与球
孢白僵菌耐热性相关的类疏水蛋白基因 [ 26]、苯并咪
唑抗性有关的 微管蛋白基因 [ 46]等也陆续被研究
证实。海藻糖 [ 28]和热休克蛋白 [ 47 ]在昆虫病原真菌
抗逆方面发挥重要的作用, 其代谢途径中的几个关
键酶基因也已经被克隆、鉴定 [ 3234, 36, 37]。表 1详细
列出了白僵菌和绿僵菌抗逆基因研究的概况。虫生
真菌抗逆基因克隆及功能研究, 不但能从基因水平
上阐明其抗逆机制,而且为利用基因工程改良菌株
抗逆性能提供了靶标基因。
表 1 虫生真菌抗逆相关基因的研究
虫生真菌名称 基因名称 功能 参考文献
白僵菌 类疏水蛋白基因 BCW 15 与孢子的耐热力密切相关 [ 26 ]
微管蛋白基因 基因位点突变会引起白僵菌对杀菌剂 (苯并咪唑 )的抗性和耐热性发生显著变化 [ 46 ]
细胞分裂素活化蛋白激酶 MAPK
编码基因 Bb hog1 与高渗、高温、氧化胁迫等逆境的抗性以及致病力相关 [ 35 ]
海藻糖 6磷酸合成酶基因 tps1 海藻糖合成途径中的关键酶之一 [ 37 ]
海藻糖 6磷酸磷酸酯酶基因 tps2 海藻糖合成途径中的关键酶之一 [ 37 ]
热休克蛋白 Bbh sp70 与高温、低温和紫外胁迫等逆境的抗性相关 [ 36, 47]
绿僵菌 疏水蛋白基因 ssgA 与营养胁迫相关 [ 31 ]
热休克蛋白基因 h sp70 未知 ( GenBank登录号 DQ393579)
中性海藻糖酶基因 NTH1 调控胞内海藻糖代谢 [ 28 ]
中性海藻糖酶基因 CQM al02 NTL 调控胞内海藻糖代谢 [ 32, 33]
海藻糖 6磷酸合成酶基因 tsp1 海藻糖合成途径中的关键酶之一 [ 34 ]
3 菌株抗逆性能的改良
3. 1 优化培养条件改良菌株抗逆性能
通过改变培养条件可以在一定程度上改变虫生
真菌细胞中某些生化成分的代谢情况, 并在一定程
度上改善菌株对环境胁迫的适应性。通过调节培养
基中碳水化合物的种类和溶度可以改变球孢白僵
菌、金龟子绿僵菌和粉拟青霉胞内多元醇和海藻糖
的含量,而培养时间、温度和 pH也会影响这三种虫
生真菌体内多元醇和海藻糖的积累, 多元醇和海藻
糖的积累可能是增强生防真菌贮存寿命和害虫防治
效果的关键 [ 48, 49]。H allsw orth等 [ 27 ]还发现胞内甘油
和赤藓糖醇浓度较高的孢子,具有更强的耐旱能力。
51
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
Range l等 [ 29, 50]的研究表明,通过改变金龟子绿僵菌
生长基质和营养环境能够获得对紫外耐受力强和孢
子萌发速率快的分生孢子。在亚致死胁迫 (营养胁
迫、热激和渗透压 )下生长的菌丝体,其产生的分生
孢子对 UVB辐射和高温的耐受力能够得到提高。
Y ing等 [ 38, 51]研究表明, 培养基成分以及培养条件
(温度、pH )的改变对球孢白僵菌孢子的耐热性有显
著的影响,通过改变培养条件来积累球孢白僵菌分
生孢子孢壁类疏水蛋白可以改善其耐热性能。可
见,通过优化培养条件来调控虫生真菌胞内生理代
谢,可以在一定程度上提高其抗逆能力,更好的为害
虫生防服务。
3. 2 基因工程改良菌株抗逆性能
虫生真菌抗逆的生化分子机理的研究有利于为
增强虫生真菌的抗逆性能的基因工程改造提供靶点
基因和改造方案,为真菌杀虫剂的田间大规模应用
奠定基础。高效遗传转化体系的建立是开展虫生真
菌基因工程改良的先决条件。目前, 采用的遗传转
化法除了经典的 PEG /原生质体转化法、醋酸锂转
化法、电激法和基因枪法外,根癌农杆菌介导的遗传
转化法 [ 52]和基于芽生孢子的遗传转化法 [ 53]也受到
越来越多研究者的青睐。
大量研究表明, 通过基因工程改良虫生真菌的
抗逆能力是一套行之有效的方法。早在 1989年
Bernier等应用原生质体转化法将来自粗糙链孢霉
苯菌灵抗性突变体的抗性基因 ( 微管蛋白基因 )
转入到金龟子绿僵菌, 使重组菌株获得对杀菌剂
(苯菌灵 )抗性 [ 54]。而邹根 [ 55]在发现球孢白僵菌
微管蛋白基因突变与苯并咪唑类杀菌剂相关联的
基础上,通过对球孢白僵菌 微管蛋白基因的定点
突变和遗传转化,获得了多菌灵抗性提高但其它有
益性状无明显减弱的工程菌株。胡宗利 [ 56]通过对
金龟子绿僵菌 CQM a102中性海藻糖酶基因超表达
和 RNA干扰的研究发现,相对于出发菌株和超表达
转化菌, RNA干扰转化菌孢子内海藻糖的积累速度
更快, 耐贮性和耐热性都比较高;而且工程菌株与出
发菌株在固体培养基上的生长情况和产孢率没有明
显差异。冷亚君 [ 57 ]对同一菌株的中性海藻糖酶基因
的 RNA干扰和超表达的研究也获得了相似的结论,
并且发现重组菌株的毒力没有受到影响。谢翎 [ 37]在
球孢白僵菌中组成型表达 tps1基因, 所得到的重组
菌株在低温下的贮藏性能得到增强, 相对于出发菌
株, 重组菌株的活孢率同比提高了约 35% ; 同时在
一定热胁迫范围内,重组菌株耐热性能也得到了提
高, 相对于出发菌株,重组菌株的活孢率同比提高了
约 30% ;但重组菌株相对于出发菌落生长较慢, 且
产孢量降低。此外,应盛华在球孢白僵菌中分别异
源高效表达粗糙脉孢霉金属硫蛋白基因 MT和大肠
杆菌硫氧还蛋白基因 thxA, 并对重组菌株进行热胁
迫试验,结果表明重组金属硫蛋白和重组硫氧还蛋
白的球孢白僵菌耐热力都显著增强 [ 26]。可见,在对
抗逆基因克隆、研究的基础上,采用基因工程技术进
行菌株抗逆性能的改良可极大地提高虫生真菌的环
境适应性。
4 总结与展望
虫生真菌对环境胁迫的抵抗是一个较为复杂的
过程,不同生长阶段和胁迫条件都有可能涉及不同
的响应机制,不同生化成分的代谢和基因的表达在
其中扮演不同的角色。对虫生真菌抗逆的生化基础
研究,可为通过优化培养条件改良菌株抗逆性能提
供理论依据;而虫生真菌抗逆的分子生物学研究,尤
其是虫生真菌抗逆基因的发掘及功能分析, 为菌株
遗传改良提供靶标位点。此外, 虫生真菌抗逆机理
的研究,也可为其它动植物真菌病害的抗逆机理的
研究及防治提供理论参考。
近几年,在虫生真菌抗逆生化分子基础的研究
上虽然取得了一些进展, 但许多生化成分和抗逆基
因的作用机理还不清楚, 还有许多抗逆相关的生化
成份和抗逆基因尚未被发掘。进一步的研究需要继
续发掘、鉴定新的生化成份和抗逆基因,明确其具体
的代谢途径,以及代谢途径中的制约因子。通过 T
DNA随机插入突变等技术构建突变体库, 筛选出与
环境胁迫 (温度、高渗、紫外辐射等 )相关的突变体,
进而克隆相关基因, 并通过基因工程技术 (同源重
组、RNA干扰等 )验证相关基因的功能,为后期开展
转基因工程菌株的研究提供靶标位点,是今后研究
的一个重要方向。虫生真菌抗逆生化分子基础的深
入研究,有助于推进虫生真菌的侵染生物学、流行学
和剂型研究等领域的不断深入, 有助于提升真菌杀
虫剂的稳定性和应用效果, 推动真菌杀虫剂的大规
52
2010年第 10期 王定锋等 :虫生真菌抗逆的生化分子基础及利用
模商品化生产及应用,为绿色农业服务。
参 考 文 献
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