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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
沙冬青 cDNA-AFLP银染和条带回收方法分析
李召春 郭惠明 程红梅
(中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081)
摘 要: 通过比较而获得沙冬青 cDNA-AFLP银染和条带回收的最佳方法。银染时采取 Bassam 法和 Sanguinetti 法，凝
胶条带回收时利用直接回收法、试剂盒法、LiCl高盐法和聚丙烯酰胺凝胶高效回收法，比较不同方法对于开展聚丙烯酰胺凝胶
电泳的影响。采用 Bassam银染法对获得的扩增产物进行染色后无法得到差异显示条带，而利用 Sanguinetti 银染法显色后可
观察到比较明显的差异表达条带;以直接回收法、PAGE试剂盒法、LiCl高盐法对差异条带进行回收后，二次 PCR无法得到扩
增产物，采用聚丙烯酰胺凝胶高效回收法后则可获得比较清晰的二次扩增产物。Sanguinetti银染法和聚丙烯酰胺凝胶高效回
收法是应用于本研究的最佳方法。
关键词: 沙冬青 cDNA-AFLP PAGE 银染 条带回收
Analysis in PAGE Silver Staning and Band Recycling in the
Ammopiptanthus mongolicus cDNA-AFLP
Li Zhaochun Guo Huiming Cheng Hongmei
(Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: It aimed at comparing different silver staining and band recycling methods in order to obtain the best method in study of
Ammopiptanthus mongolicus cDNA-AFLP． Bassam and Sanguinetti methods were compared in silver staining efficiency，moreover，four
different kinds of methods were used to evaluate the effct for recycling efficiency of PAGE． The results indicated that target bands could
be amplified clearly using Sanguinetti method． The improved efficient band-recovering method was the best choice to improve the effi-
ciency of re-amplification from the Sanguinetti gels． Sanguinetti silver staining and the improved efficient band-recycling methods can be
employed in the future studies．
Key words: Ammopiptanthus mongolicus cDNA-AFLP PAGE Silver staining Band recycling
收稿日期:2010-10-09
基金项目:转基因专项项目(2008ZX08005-004)
作者简介:李召春，男，硕士研究生，研究方向:植物分子生物学;E-mail:lizhaochun@ 126. com
通讯作者:程红梅，女，研究员，博士生导师，研究方向:植物分子生物学;E-mail:chenghm@ caas. net. cn
聚丙烯酰胺凝胶银染和差异条带的回收是 cD-
NA-AFLP技术中的重要组成部分，二者效率的高低
将直接影响 cDNA-AFLP 的效果。作为一种常见的
分子标记技术，cDNA-AFLP中聚丙烯酰胺凝胶银染
和条带回收方法已经发展得比较成熟，但同一种方
法在针对不同研究对象时往往效率不同，因而在建
立 cDNA-AFLP体系时有必要根据试验材料特点比
较和优化有关方法，以期取得良好的试验效果。限
制片段长度多态性(amplified fragment length poly-
morphism，AFLP)技术是由荷兰 Keygene公司的科学
家 Zabean［1］和 Vos 等［2］创立的一种 DNA 指纹技
术。Bachem等［3］将 AFLP 技术与 mRNA 差异分析
相结合，使其发展成为一种新的 mRNA 指纹图谱技
术，即 cDNA-AFLP。它以 mRNA 反转录形成的 cD-
NA为模板进行 AFLP 分析，在保留了 AFLP 技术多
态性丰富、稳定性高和无需了解基因组序列信息等
优点的同时，可以集中显示基因表达序列的多态性
差异，并且重复性好、准确可靠、效率高［4］。随着生
物技术的发展，cDNA-AFLP已经成为研究基因表达
的重要工具［5］。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus
(Maxim1)Cheng F1)是我国特有的荒漠植物，常年
处于极端低温、高温和干旱等逆境环境，具有极强的
2011 年第 4 期 李召春等:沙冬青 cDNA-AFLP银染和条带回收方法分析
抗逆性，是开展抗逆研究的理想材料。针对经逆境
处理的沙冬青开展 cDNA-AFLP研究，进行逆境转录
谱的构建，对于发掘抗逆调控基因具有重要意义。
本研究在摸索和优化沙冬青 cDNA-AFLP 体系
的基础上，为简化程序、提高银染效果和条带回收效
率，对多种银染方法和条带回收方法进行比较研究，
确定适合本研究的 Sanguinetti银染法和聚丙烯酰胺
凝胶条带高效回收法。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
植物材料为蒙古沙冬青，种子由中国农业科学
院生物技术研究所裴新梧研究员提供。对出苗后 4
周(子叶 2 片，真叶 4 － 6 片)的沙冬青进行低温、高
温和干旱处理后，取沙冬青子叶提取总 RNA，进行
后续试验。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 cDNA-AFLP 分析 参照 Bachem 等［3］的方
法并略有改进。制备 6%变性聚丙烯酰胺凝胶，取
选择性扩增产物 4 μL上样，75 W电泳 2 h。
1. 2. 2 凝胶银染 电泳结束后，将胶板小心剥下，
分别采用 Bassam 法［6］和 Sanguinetti 法［7］对聚丙烯
酰胺凝胶进行染色。具体操作步骤见有关文献。
1. 2. 3 差异条带的回收
1. 2. 3. 1 直接回收法 参照陈亮等［8］方法并略有
改进。取 5 μL 灭菌的 ddH2 O 将目的条带周围润
湿，利用锋利的手术刀片将条带刮下后置于含有
20 μL ddH2O的 1. 5 mL 离心管中，煮沸 10 min，以
上清液为模板进行差异表达条带的二次 PCR。
1. 2. 3. 2 PAGE试剂盒法 在灭菌的 1. 5 mL 离心
管中，加入 20 μL ddH2O和 20 μL溶胶液并混合，取
5 μL混合液润湿目的条带周围，利用锋利的手术刀
切取条带置于离心管中，煮沸 10 min。后续步骤参
照试剂盒说明书。
1. 2. 3. 3 LiCl高盐法 参照李传友等［9］方法并略
有改进。将聚丙烯酰胺凝胶上的目的条带小心切
下，溶于 400 μL 高盐溶液(20% ethanol，1 mol /L
LiCl和 10 mmol /L Tris-HCl，pH7. 5)中，室温放置 24
h，65℃温育 2 h，无水乙醇沉淀，吹干后溶于 10 μL
ddH2O。
1. 2. 3. 4 聚丙烯酰胺凝胶高效回收法 将凝胶中
目的条带切下后利用 200 μL ddH2O漂洗 2 次，弃漂
洗液后加入 50 μL 灭菌 ddH2O 在室温下浸泡 24 h
以上。煮沸 10 min，瞬时离心后迅速置于冰上，以上
清液为模板进行差异表达条带的二次 PCR。
1. 2. 4 差异条带的二次扩增 以优化的聚丙烯酰
胺凝胶高效回收法得到的产物为模板进行 PCR 反
应，使用扩增该条带的相应选择性扩增引物对进行
PCR扩增反应。PCR 反应体系包括:10 × 缓冲液
5 μL、dNTP (2. 5 mmol /L)4 μL、正 反 向 引 物
(10 μmol /L)各 1 μL、DMSO 3 μL、Taq DNA 聚合酶
(5 U /μL)0. 5 μL、回收产物 5 μL、灭菌水 37. 5 μL。
反应程序:94℃ 10 min;94℃ 1 min，58℃ 1 min，
72℃ 1 min，37 个循环;72℃延伸 10 min。
2 结果与分析
2. 1 两种银染方法结果的比较
采取 Bassam银染法对获得的扩增产物进行染
色后，尽管银染后凝胶背景较低，但条带的灵敏性也
大为降低，甚至连 Marker也只能得到很模糊的条带
(图 1-a)。而利用 Sanguinetti银染法进行银染显色，
则可以在染色后观察到比较明显的差异表达条带
(图 1-b)。综合分析了两种银染方法的优缺点，结
合试验材料特点，在研究中对聚丙烯酰胺凝胶的染
色采用 Sanguinetti银染法。
2. 2 差异条带的回收与再扩增
以 cDNA-AFLP常用的条带煮沸直接回收法得
到的产物为模板，进行二次 PCR 后发现效果极差，
无法得到扩增产物(图 2-a)。在进行多次的重复，
并陆续试验了 PAGE 试剂盒法、LiCl 高盐法等有成
功报道的回收方法后，均无法得到有效的目标产物
(图 2-b，c)。
分析原因，可能是利用 Sanguinetti 银染法处理
凝胶后，回收条带残留的 NaOH 改变了 PCR 反应体
系的 pH值，从而影响差异表达条带的再扩增效率。
据此对直接回收法进行改进得到聚丙烯酰胺高效回
收法，在将目的条带置于沸水浴中处理前增加了去
离子水漂洗和浸泡的过程，从而获得比较清晰的二
次扩增条带(图 2-d)。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
a． Bassam银染法效果;b． Sanguinetti银染法效果
图 1 聚丙烯酰胺凝胶两种银染方法效果比较
a．直接回收法;b． PAGE试剂盒法;c． LiCl高盐法;d．聚丙烯酰胺凝胶高效回收法
图 2 四种方法回收差异条带后 PCR效果比较
2. 3 差异条带再扩增条件的优化
在 cDNA-AFLP流程中，二次 PCR 一般采取预
扩增时的反应体系和程序。而在多次重复后发现，
利用该方式在本研究中扩增效率不高，故对其进行
优化以确定适合本试验的二次 PCR 反应体系和
程序。
对二次 PCR反应的优化主要体现在:反应体积
由 25 μL扩大为 50 μL，以利于下一步产物的回收;
在二次 PCR 反应体系中增加适量的反应增强剂
DMSO，以提高扩增产物的特异性;反应引物由预扩
引物改为差异条带相对应的选择性扩增引物对;将
退火温度由 52℃提高至 58℃;反应循环数由 27 增
加到 37。
3 讨论与结论
cDNA-AFLP技术中，聚丙烯酰胺凝胶银染方法
的选择和从 PAGE 中回收差异条带效率的高低，对
后续的二次扩增以及以二次扩增为基础的纯化、克
隆和测序，具有重要的影响。
Bassam银染法和 Sanguinetti银染法是 PAGE中
最常用的两种凝胶显影方法，对于多种试验材料两
种方法均有成功报道［10，11］。比较研究发现，Bassam
法银染得到的聚丙烯酰胺胶板背景浅、灵敏度高，但
它需要冰醋酸、硫甙硫酸钠和碳酸钠等试剂，价格较
贵、用量较大、成本较高的缺陷限制了它的广泛应
用［12］;与 Bassam 法相比，Sanguinetti 法花费时间大
为缩短，银染过程中无需冰醋酸和碳酸钠，且由于利
用 NaOH代替了硫甙硫酸钠而使成本明显降低，具
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2011 年第 4 期 李召春等:沙冬青 cDNA-AFLP银染和条带回收方法分析
有快速、便宜等优点，更适合于大规模引物多态性筛
选等研究［13］。本研究中，采取 Bassam 银染法对获
得的扩增产物进行染色后几乎无法观察到明显的条
带，而同样的产物利用 Sanguinetti 银染法可获得清
晰的条带。这点与有关文献中 Bassam 银染法灵敏
度高于 Sanguinetti银染法的报道不相一致。
关于 PAGE银染后差异条带的回收，多个研究
者采用过不同的方法进行研究，所持的观点不尽相
同，这可能与所用的试验材料和试验条件不同有
关［14，15］。在开展 cDNA-AFLP 技术时，沙冬青总
RNA经 RT-PCR反应后获得的起始 cDNA量相对较
低。为减少二次扩增时模板信息量的损失，本研究
在以前学者研究［16］报道的基础上，利用经直接法改
进的高效聚丙烯酰胺凝胶回收法从 Sanguinetti 法银
染的 PAGE中回收差异条带，有利于减少二次扩增
时模板信息量的损失。经过二次扩增、回收、差异条
带的亚克隆及鉴定等后续技术环节，证明了该方法
的有效性和可靠性。
采用聚丙烯酰胺凝胶高效回收法从经 Sangui-
netti法银染的 PAGE 中回收差异条带，是开展沙冬
青 cDNA-AFLP研究的最佳方法，为后续的差异表达
基因的克隆和分析奠定了基础。
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(责任编辑 李楠)
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