全 文 ：细胞生物学杂志 Chinese Journal of Cell Biology 2009, 31(4): 547-552 http://www.cjcb.org
收稿日期: 2009-01-14　　接受日期: 2009-06-11
国家科技支撑计划项目(No.2007BAD68B03)、公益性行业(农业)
科研专项(No.nyhyzx07-007-1)、广西青年基金项目(No.桂科青
0991077)、 广西自然科学基金项目(No.桂科自0728065)和广西作物遗传
生物技术重点开放实验室开放课题(No.桂科能0815011-6-1-14)资助
*通讯作者。Tel: 0771-3247689, E-mail: liyr@gxaas.net
纯雌系苦瓜花经AgNO3诱雄后的雄蕊
发育和基因表达
王日升1,2,3 李杨瑞2* 周生茂3 张　曼3 方锋学3 杨丽涛1
(1广西大学广西亚热带生物资源保护利用重点实验室, 南宁530005; 2广西作物遗传改良生物技术重点开放
实验室, 南宁530007; 3广西农业科学研究院蔬菜研究中心, 南宁530007)
摘要　　为了研究AgNO3诱导下纯雌系苦瓜花蕾发育过程中的差异基因表达, 本文运用形态
学观察、cDNA-AFLP、RT-PCR和反向Northern杂交等技术在形态学和转录组学水平上对花蕾转
雄进行了研究。结果显示: (1)花蕾在AgNO3处理后第6天出现雄蕊, 第14天形成两性花, 而且两
性花中的花粉具有完全生活力, 第22天后恢复全雌花; (2)从128对引物组合中筛选出可获得丰富
清晰条带的引物组合36对, 它们从AgNO3处理的花蕾中分离到11个高度表达的差异片段, 经克
隆、测序和在线比对, 有2个未知基因, 9个已知基因, 其中1个与植物性别分化有关的CYP450家
族基因有高度同源性, 命名为McCYP72A1; (3) McCYP72A1在AgNO3处理后2~12 h内的花蕾中表
达, 而且在第8 h时表达丰度最高, 但在处理的根、茎和叶以及对照的各个器官中不表达。结果表
明, AgNO3处理可诱导纯雌系苦瓜花蕾中与雄性分化相关基因表达, 进而可能导致处理后14天内
雌花发育为两性花。
关键词　　苦瓜; 纯雌系; 诱雄处理; cDNA-AFLP; 差异基因表达
苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科
(Cucurbitaceae)苦瓜属(Momordica)一年生草本植物,
嫩瓜富含维生素C和苦瓜素等成分[1,2], 是炎热季节的
主选蔬菜之一。近年来, 苦瓜在全国尤其南方各地
栽培面积逐年扩大, 苦瓜杂交种需求量逐年增加, 但
苦瓜杂交制种工作量大且成本高等因素在一定程度
上制约了苦瓜杂交种的应用, 导致生产上仍以常规品
种为主[3]。所以, 应用雄性不育技术简化杂交制种对
苦瓜杂种优势利用具有重要现实意义。
雄性不育是有花植物普遍存在的一种自然现象,
通常包括雄蕊退化和花粉不育两种类型。自1763年
Kuehter首次报道植物雄性不育以来, 至今已在43科
162属617种植物中发现了雄性不育[4], 其中单子叶
禾本科植物和双子叶茄科、豆科、十字花科等植物
的雄性不育研究最为广泛, 它们的雄性不育系不仅用
来简化杂交制种程序, 而且其不育性和杂种优势一直
是研究热点之一[5]。葫芦科植物是雌雄同株异花授
粉植物, 雌雄分化受遗传背景、光温和化学物质等
多种因素的控制[6], 因而很难获得其不育系(纯雌系),
即使获得了纯雌株系, 也因无法有效保存纯雌株系而
限制了其在大规模杂交制种中的应用。自从具有诱
导黄瓜[7]、节瓜[8]、西葫芦[9]、瓠瓜[10]和苦瓜[11]等
葫芦科植物产生雄花/两性花的化学物质被报道后,
葫芦科植物纯雌株系用于大规模杂交制种的问题才
得到解决。黄瓜和苦瓜纯雌株系最有效的诱雄物质
是AgNO3, 研究表明AgNO3诱导黄瓜雌性系雄花分化
是由于Ag+能抑制乙烯部分氧化代谢途径, 阻碍乙烯
原初反应的发生, 最终抑制黄瓜雌花的产生[7]。但是
AgNO3诱导苦瓜雌性系雄性分化机制是否如此尚不
清楚, 因此, 研究AgNO3诱导下纯雌系苦瓜花蕾发育
过程中的差异基因表达很有必要。
本研究以我们选育并应用于杂交制种的苦瓜纯
雌系“X-黑-d-d”为材料, 在三叶一心期用AgNO3
处理苦瓜后, 首先观察雄蕊形态及其花粉活力, 然后
利用cDNA-AFLP、RT-PCR和反向Northern杂交等
技术研究AgNO3诱导下纯雌系苦瓜花蕾发育过程中
的差异基因表达, 为化学调控苦瓜性别分化和进一步通
过遗传工程手段创建新的苦瓜雌性系提供理论依据。
548 ·研究论文·
1 材料与方法
1.1 材料
以广西农科院蔬菜中心选育的苦瓜纯雌系
“X-黑-d-d”为研究材料, 种子在温度29 ℃±1 ℃
和相对湿度90%±5%条件下催芽2天露白后, 播于大
棚中。根据前期研究AgNO3诱雄的最佳处理时期和
浓度, 在苦瓜三叶一心期用300 mg/L AgNO3进行全
株喷施至叶冠上液滴形成为止, 对照喷施蒸馏水。
处理后2、4、6、8、10和12 h分别采集对照和
处理的花蕾、根、茎和叶, 并进行雄蕊形态观察及
其花粉活力鉴定。
TRIzol Kit购自Invitrogen公司; rTaq DNA 聚合
酶、pMD18-T载体购自Takara公司; SMARTTM PCR
cDNA Synthesis Kit购自Clontech公司; AgNO3、苯
胺蓝、EcoRI、MseI、IPTG、X-Gal、T4 DNA
连接酶、Acrylamide、B s-adrylamide、尿素、过
硫酸铵、TEMED、购自上海生物工程技术服务有
限公司, 接头和引物序列由上海生物工程技术服务有
限公司合成; PCR DNA Marker Ⅲ 购自天根生化科技
(北京)有限公司; Biospin Polyacrylamide Gel DNA Ex-
traction Kit和DNA凝胶回收试剂盒分别购自Bioer
Technology公司和上海华舜生物工程有限公司; DIG
High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I购
自Roche公司。
1.2 雄蕊形态观察和花粉活力鉴定
AgNO3处理后观察雄蕊是否正常, 花药有无花
粉; 采用以苯胺蓝染色的荧光显微技术鉴定花粉生活
力[12], 参照刘乐承等[13]所述方法进行花粉萌发。
1.3 总RNA提取与双链cDNA合成
参照TrizolÒ产品手册提取总RNA, 用SMARTTM
PCR cDNA Synthesis Kit合成cDNA,其中3端和5
端接头序列分别为3 RAS和5 RAS (表1), 检测合格
后备用。
1.4 cDNA-AFLP分析
参照Bachem等[14]和黄科等[15]的方法进行cDNA-
AFLP分析, 接头和引物序列见表1, 其中EAS1和
EAS2为EcoRI酶切后的接头序列, MAS1和MAS2为
MseI酶切后的接头序列, EPS1~EPS6和M 1~MPS6
分别为AFLP引物序列。采用6%聚丙烯酰胺凝胶电
泳, 1 500 V 电泳至二甲苯氰距下部边沿10 cm 处停止电
泳, 参照Sanguinetti等[16]方法进行银染。
1.5 差异片段的回收、克隆、测序和分析
用Biospin Polyacrylamide Gel DNA Extraction Kit
回收聚丙烯酰胺凝胶板上的差异片段, 用AFLP-PCR
扩增的相应选扩引物进行二次扩增, 用DNA凝胶回
收试剂盒回收目的片段, 二次扩增回收产物与载体连
接和转化; 用碱裂解法小量提取质粒DNA, 分别挑选
经酶切鉴定为阳性克隆的3个菌液送上海生工测序;
测序结果在NCBI数据库中进行网上比对, 以确定差
异片段是否为已知基因。
1.6 差异片段假阳性的反向Northern杂交分析
参照DI High Prime DNA Labeling and Detection
Starter KitⅠ进行反向Northern杂交验证。首先分别
将对照和处理各时期花蕾cDNA等浓度混合, 用地高
辛分别标记反向N rthern杂交的混合探针, 然后将二
次扩增回收产物点在尼龙膜上, 最后进行杂交、漂
洗和拍照。
1.7 差异基因表达的RT-PCR分析
根据前述BLAST比对和反向Northern杂交结果,
选取处理表达丰度强的CYP72A基因片段进行时空
表达分析。参照植物中普遍表达的Actin1基因[17]合
成上、下游引物AFS和ARS (表1)作为时空表达的
内参照系, 在CYP72A基因片段序列上设计上、下
游特异引物CFS和CRS (表1); 分别以处理各时期
Table 1　The sequences of both adaptors and primers used
Name Sequences Name Sequences
3RAS 5-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCA-5RAS 5-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGAC-
　TTACGGCCGGG-3′ 　ATG(T)30(A/G/C)(A/G/C/T)-3
EAS1 5-CTCGTAGACTGCGTACC-3 MAS1 5-TACTCAGGACTCAT-3
EAS2 5-AATTGGTACGCAGTCTAC-3 MAS2 5-GACGATGAGTCCTGAG-3
EPS1 5-GACTGCGTACCAATTCA-3 MPS1 5-GATGAGTCCTGAGTAAC-3
EPS2 5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3MPS2 5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3
EPS3 5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3MPS3 5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3
EPS4 5-GACTGCGTACCAATTCACA-3MPS4 5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3
EPS5 5-GACTGCGTACCAATTCACT-3 MPS5 5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3
EPS6 5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3 MPS6 5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3
CFS 5-CAGAGAGATTCTCAGAGGGAG-3CRS 5-AACGTAGGGTGACTACCATTA-3
AFS 5-TCTCTATGCCAGTGGTCGTA-3 ARS 5-CCTCAGGACAACGGAATC-3
549王日升等: 纯雌系苦瓜花经AgNO3诱雄后的雄蕊发育和基因表达
花蕾cDNA、处理各时期等浓度混合的根、茎及叶
cDNA、和对照各时期等浓度混合的根、茎、叶及
花蕾cDNA为模板进行RT-PCR分析, 反应体系: 0.2 ml
cDNA (约含15 ng), 2.5 ml10×PCR反应缓冲液(含15
mmol/L MgCl2), 1.0 ml 10 mmol/L dNTP, 10 mmol/L引物
各2 ml, 0.2 ml 1.0 U rTaq DNA聚合酶, 加灭菌ddH2O
至25 ml; 扩增条件: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃变性45 s,
50 ℃退火50 s, 72 ℃延伸 min, 共30个循环(该循
环数线性关系最好); 72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存; 扩
增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳, 拍照。
2 结果
2.1 雄蕊形态和花粉活力
对照主侧蔓上的花都为雌花。AgNO3处理后连
续6天雄蕊观察的结果表明, 尽管喷后5天内对照和
处理的雄蕊形态没有明显差异, 但是从处理第6天开
始能模糊看见雄蕊的花丝, 而对照没有, 此后二者差
别明显, 第14天花呈半开放状态时, 雄蕊各部位完全
形成(图1A), 说明在三叶一心期喷施AgNO3能够有
效地诱导纯雌系苦瓜雄性器官的形成进而使其发育
为两性花。但是AgNO3作用效果仅保持22天, 此后
只形成雌花。转雄后产生的花粉用苯胺蓝处理, 可
在荧光显微镜下观察到椭圆形的花粉粒发出黄色荧
光(图1B), 而且用培养基培养的花粉能够正常萌发
(图1C), 说明转雄后产生大量有生活力的花粉。
2.2 cDNA-AFLP引物筛选及差异表达基因片段
的扩增
用从对照和处理的苦瓜花蕾中提取的总RNA合
成cDNA, 前者电泳显示有28S、18S和5S特征条
带且未出现降解(图2A), 后者主要分布在300~4 500
bp(图2B)。分别将对照和处理不同时期的cDNA等
浓度混合用于cDNA-AFLP分析的引物筛选, 结果表
明, 128对引物组合中有36对引物(表1)组合扩增的
差异条带数目多、丰度高而且重复性好(图2C);
AgNO3分别处理2、4、6、8、10和12 h后, 提
取不同时期花蕾cDNA, 经引物组合EPS2/MPS3扩
增, 得到一个高度表达的片段(图2D)。
2.3 差异表达基因片段的筛选和阳性验证
利用初步筛选出的36对引物组合进行对照和处
理不同时期花蕾cDNA差异表达基因片段的筛选, 从
处理扩增众多条带中挑选出33条显色强的差异带, 回
收后分别用相应引物进行二次PCR扩增, 有20条片
段扩增成功, 编为第1~20号, 分别将这20个二次扩
增回收产物点于尼龙膜上, 用对照和处理cDNA混合
探针进行反向Northern杂交分析, 结果显示(图3), 第
1、3、5、11、12、16、19号片段在对照和处
理的花蕾中都有表达, 第7、20号片段在对照和处
理的花蕾中都没有表达, 所以这9个片段为假阳性片
段, 其余11个片段为AgNO3处理后特异表达的阳性
片段, 其中第4号基因差异片段表达丰度最强, 其次
是第13号。
2.4 阳性基因片段功能预测和相关基因时空表达
11个阳性片段克隆和测序后Blast结果显示, 除
第2、17号为未知基因外, 其他均为已知基因(表2),
这些已知基因功能涉及调节激素平衡、RNA加工修
饰、基因表达调控和能量代谢等。其中第4号片段
大小为300 bp, 可以翻译成100个氨基酸(图2D), 与
细胞色素P450超大基因家族中CYP72A亚家族的烟
草CYP72A58同源性最高为72% (登陆号: DQ350363.1),
该基因主要功能是调节激素平衡, 而激素与植物性别
分化密切相关, 因此, 命名第4号片段为McCYP72A1。
McCYP72A1基因的时空表达结果(图4)表明, 该基因
在AgNO3处理后2～12 h内的花蕾中表达, 表达模式
为从开始逐渐增加, 至8 h时最强, 此后又渐渐减弱, 而
在处理的根、茎和叶以及对照各个器官中均不表达。
3 讨论
苦瓜雌雄花通常共存于同一个植株, 两种类型的
花在形成之前要经过一个共同发育时期, 然后才向各
自的方向发育[18]。其他葫芦科植物也普遍存在这种
雌雄性别分化现象, 在其性别分化前叶面喷施生长调
节物质能够调控花发育方向和雌雄比例, 其中AgNO3
可成功诱导其纯雌系转雄, 从而有效保存了用于杂交
制种的纯雌系。目前研究发现, 植物乙烯合成途径
的关键酶ACC合成酶和黄瓜雌性基因紧密连锁[19], 而
且乙烯受体基因在黄瓜雌性系中高度表达[20]。本研
究用300 mg/L AgNO3在三叶一心期喷施纯雌系苦瓜,
花性别也成功实现了转雄分化, 不但花丝显著伸长, 而
且花粉具有生活力; 同时利用cDNA-AFLP和反向
Northern杂交等技术对处理花蕾中表达的差异基因进
行了筛选和验证, 获得了11个与转雄相关的阳性基
因片段, BLAST比对后未发现与乙烯合成途径和受体
相关的基因, 这可能和引物仅筛选了128对及主要挑
选表达丰度强的条带分析有关。但我们筛选到一个
属于细胞色素P450 (cytochrome P450, CYP450)超大
基因家族中CYP72A亚家族的一个成员McCYP72A1,
其可能与AgNO3诱导纯雌系苦瓜产生了两性花而不
是雄花有关。
550 ·研究论文·
Fig.3　Reverse-Northern hybridization analysis for positive verifications of the specific gene segments in flower buds of
bitter melon gynoecious line treated with AgNO3
1-20: the numbers of the related specific genes; CK: control; T: treatment.
Fig.1　Observations of stamen morphology (A) and its pollen activity (B, C) for bitter melon gynoecious line flower induced
into the male with AgNO3
CK: control; T: treatment.
Fig.2　Electrophoresis diagrams of the extracted RNA (A), the synthesized cDNA (B), the cDNA-AFLP products amplified by
selected primer combinations from the flower buds of bitter melon gynoecious line (C) and the fragment of McCYP72A1 amplified
by primer combination of EPS2 and MPS3 which expressed in the flower buds treated with AgNO3 (D)
M: PCR DNA MarkerⅢ; 1: control; 2: treatment. The former 4 lanes in (C) denote the products amplified by the primer combinations of
EPS2 and MPS3, and the latter 4 lanes denote those of EPS3 and MPS5.
551王日升等: 纯雌系苦瓜花经AgNO3诱雄后的雄蕊发育和基因表达
CYP450是一个古老的基因超家族, 在植物生长
发育过程中起着十分重要的作用, 其不但参与了油菜
素内酯、赤霉素、脱落酸、黄酮类化合物和木质
素等许多植物代谢物的合成[21], 而且其中一些成员直
接参与植物性别分化[22～24], 同时Cd2+、Hg2+等金属
离子易诱导其表达[25]。CYP72A功能主要是调节植
物内源激素平衡, 此外也参与吲哚碱和油菜素内脂等
激素的合成[21,26]。众所周之, 植物激素是性别分化的
诱导信号, 激素对植物性别分化都有一定影响。另
外, 我们在研究AgNO3 诱导下的纯雌系苦瓜两性花
分化与花蕾中内源激素的关系时也发现AgNO3处理
后花蕾中内源激素表现为激素动态平衡的规律(另文
发表)。由此推测, CYP450基因家族成员McCYP72A1
可能也在AgNO3诱导纯雌系苦瓜转雄过程起作用。
RT-PCR分析进一步证明McCYP72A1仅在 gNO3处
理的纯雌系苦瓜花蕾中表达, 而在处理的根、茎、叶
和对照的各个器官中均不表达。所以, McCYP72A1
是与AgNO3诱导纯雌系苦瓜花转雄相关的基因, 但是
它是否是决定转雄的关键基因还有待证明。
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DifferentialLength in
　segment number siz (bp)
2 330
4 300
6 255
8 225
9 210
10 204
13 156
14 110
15 200
17 245
18 346
Table 2　The aligned results of positive segments of differentially-expressed genes on line
Alignment result
Unknown
Plant CYP72A (cytochrome P450, 72family, A subfamily）
Arabidopsis brix domain-containing protein
Arabidopsis s l cing factor 3A, subunit 3
Bacteroides coprocola ATP-binding cassette transporter,
　ABC transporter
Arabidopsis N-acetyl-gamma-glutamyl-phosphate 　　　
　reductase, chloroplast precursor
Nicotiana related gene of cell death
Arabidopsis chloroplast 50S ribosomal protein L33
Arabidopsis glycosyl hydrolase family 38 protein
Unknown
Nidula niveotomentosa putative ATP synthase
The related physiological process
Unknown
Sex differentiation
Pr biosynthesis
RNA processing and modification
Ma erial t ansportation
Respiration metabolism related
Cell death
Regula io of gene expression or
　gene control
Carbohydrates metabolism
Unknown
Energy metabolism related
Fig.4　Analysis of the temporal and spatial expressions of McCYP72A1 by RT-PCR
1-6: the flower buds of bitter melon gynoecious line treated with AgNO3; 7-9: the m xed samples of roots (7), stems (8), leaves (9) of the treatment
at the aforesaid same times; 10-13: the mixed samples of buds (10), roots (11), stems (12), leaves (13) of the control.
552 ·研究论文·
Stamen Development and Gene Expression of Flower of Male-induced
Bitter Melon Gynoecious Line
Ri-Sheng Wang 1,2,3, Yang-Rui Li3*, Sheng-Mao Zhou 2, Man Zhang 2, Feng-Xue Fang 2, Li-Tao Yang 1
(1Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization, Guangxi University, Nanning 530005, China;
2Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China;
3Vegetable Research Center, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China)
Abstract To elucidate the differential gene expression during the development of stamens in female flower
buds of bitter melon gynoecious line induced with AgNO3, in the present study, it was studied at the levels of
morphology and transcription genomics using morphologic observations, cDNA-AFLP, RT-PCR and reverse-Northern
hybridization. The results showed as follows: (1) After treated with AgNO3, stamens were generated at the 6th day,
and bisexual flowers with viable pollen grains were observed at the 14th day, and gynoecious flowers were recov-
ered since the 22th day. (2) Thirty-six primer combinations could amplify many distinct bands, among them, 11
bands which were strongly expressed only in the AgNO3-treated buds were cloned, sequenced and aligned on line,
resulting in discovery of 2 unknown genes and 9 known genes. The sequence showing high similarity with CYP450
gene super family which related to plant sex differentiation was named as McCYP72A1. (3) McCYP72A1 was
expressed in the flower buds during the period of 2-12 h after treated with AgNO3, and expressed most strongly at
8 h, but not expressed in the roots, stems, leaves of treatment and the mixed samples of buds, roots, stems, leaves
of the control. It suggested that genes related to male differentiation in the flower buds of bitter melon gynoecious
line were expressed after treated with AgNO3, which might make female flowers develop into bisexual flowers
within 14 days.
Key words bitter melon; gynoecious line; male-induced treatment; cDNA-AFLP; differential gene expression
Received: January 14, 2009 Accepted: June 11, 2009
This work was supported by the National Key Technology R&D Pillar Program (No.2007BAD68B03), National Department Public
Benefit Research Foundation (No.nyhyzx07-007-1), Guangxi Youth Foundation Program (No.0991077), Guangxi Natural Science Founda-
tion Program (No.0728065) and the Foundation of Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab (No.0815011-6-1-14)
*Corresponding author. Tel: 86-771-3247689, E-mail: liyr@gxaas.net
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