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生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
利用重叠 PCR技术对 O sAM T112进行定点突变
李宝珍　李素梅　施卫明　苏彦华
(中国科学院南京土壤研究所 土壤与农业可持续发展国家重点实验室 ,南京 210008)
　　摘 　要 : 　铵是植物吸收利用的主要氮源之一 ,而铵转运蛋白对铵的吸收、转运和代谢方面有重要的作用。为了深入研
究水稻铵转运蛋白的结构功能特性 ,利用重叠 PCR技术对 O sAMT112蛋白质序列中保守的 253 aa和 257 aa的苯丙氨酸 ( F)
和丝氨酸 ( S)分别突变为丙氨酸 ,成功获得了相应的 2个点突变基因。因此 ,重叠 PCR技术是一种简单有效的进行体外基因
重组和突变的方法 ,对于研究高等植物功能基因的结构功能特性具有重要的意义。
关键词 : 　水稻 　铵转运蛋白 　O sAMT112　点突变 　重叠 PCR
PointM utant of O sAM T112 by Using Gene Splic ing by Overlap Extension
L i Baozhen　L i Sumei　Shi W eim ing　Su Yanhua
( S ta te Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture in Institute of Soil Science, Chinese Academ y of Sciences, N anjing 210008)
　　Abs trac t: 　Ammonium is one of the important inorganic nitrogen in p lant, and ammonium transporters are essential for ammonium
up take, transport, and metabolism. To further study the functional structure and characteristic for ammonium transporters in rice, high2
ly conserved phenylalanine and serine residues, F253 and S257 of O sAMT112 were rep laced by alanine respectively using gene sp licing
by overlap extension ( gene SOEing) method. Results indicated that anticipantmutant geneswere obtained successfully. Therefore, the
technique of gene SOEing is a simp le and effective method for gene recombination and mutation in vitro, which is significant to study
structurally and functional characteristic of gene in high p lants.
Key wo rds: 　R ice　Ammonium transporter　O sAMT112　Point mutant　Gene sp licing by overlap extension
收稿日期 : 2009205225
基金项目 :中国博士后科学基金 (20070421031) ,国家“973”计划项目 ( 2007CB109303) ,中国科学院知识创新工程重要方向项目 ( KSCX22YW 2
N2002)
作者简介 :李宝珍 (19772) ,女 ,博士 ,主要从事植物营养分子生理方面的研究 ; E2mail: bzli@ issas. ac. cn
通讯作者 :苏 T华 (19712) ,男 ,研究员
　　铵和硝是农业土壤中植物生长发育的两种主要
的氮源 ,但作物对氮肥的利用率低 ,仅为 30% ～
35% ,而土壤中氮素的损失率却非常高 ,在 30% ～
50% ,尤以稻田土壤严重 [ 1, 2 ]。近年来 ,随着分子生
物学不断深入到植物营养的研究领域 ,植物吸收利
用养分的分子机理和应用生物学的途径和植物本身
来提高土壤养分的利用率已成为研究的热点。研究
表明 , 氮素的吸收利用需要各种转运蛋白的参
与 [ 3 ]。目前已鉴定到至少 10个 AMT成员 ,分属于
不同的 4 个家族 ,分别是 AMT1, AMT2, AMT3 和
AMT4[ 4, 5 ] ,它们转录表达和组织定位存在差异 ,推
测其 具 有 不 同 的 生 物 化 学 特 性 [ 4 ]。其 中 ,
O sAMT111基因在根系和地上部均丰富表达 [ 6, 7 ] ,相 对于其它 AMTs基因对铵的吸收贡献最大 [ 2 ] ;而 O s2AMT112和 O sAMT113 则在根部特异性表达 [ 6 ]。Sonoda等 [ 6 ]和 Kumar等 [ 7 ]均研究发现 O sAMT112被铵诱导在根部表达 ,且低铵处理下 ( 10μM NH4 +营养液中处理 2 d) , O sAMT112 的增加量是 O s2AMT111的 50% [ 7 ] ,缺氮也增强其表达 ,缺氮两天其表达是正常供氮时的 3倍 [ 8 ] ; O sAMT113是一个低丰度表达的基因 ,利用半定量 PCR 分析发现 O s2AMT113基因仅在根部表达 ,且缺 N 增强表达 [ 8 ]。进一步研究发现 , O sAMT1 s表达与体内谷氨酸的含量密切相关 ,而且抑制 GS酶活性的物质同样影响O sAMT1 s的表达水平 ,表明 O sAMT1的表达受谷氨
酸的反馈调控 ,而不是直接受铵的调控 [ 9 ]。
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
多年来 ,通过生物信息学对蛋白质序列结构分析
和定点突变 ,发现了一些铵的重要调控位点 [ 10～14 ] ,其
中发现高度保守的苯丙氨酸位点 F215是铵转运和脱
质子时必需的结合位点 [ 10 ] ,此位点的突变导致转运
铵的能力丧失 [ 14 ]。参照 E. coil的 Am tB的研究 ,在高
等植物番茄和拟南芥中也发现了一些类似的调控位
点。Ludewig等 [ 15 ]研究 LeAMT1. 1和 LeAMT112的交
互作用时 ,它们 C端保守的甘氨酸 ( G)突变为天冬氨
酸 (D)即分别是 G458D和 G465D。G458D的突变导
致 LeAMT111转运铵的活性丧失 ,而突变体分别与野
生型的基因共注射到蛙卵中表达 , LeAMT111 和
LeAMT112转运铵的能力都降低了 ,推断 AMT蛋白之
间可能形成复杂的聚合结构来调控转运铵的能力 ,而
C端 G位点在这个过程中有重要的作用。之后 , Lo2
que[16 ]和 Neuhauser等 [17 ]先后研究拟南介的 AtAMT111
和 AtAMT112的蛋白质结构中发现了一些重要的铵吸
收调控位点 ,认为这些位点的变化导致蛋白质构象的
变化来调控 AMT的活性 ,从而可能减少或降低铵毒害
对植物的伤害。
目前 ,水稻铵转运蛋白的研究主要集中于其转录
表达调控方面 ,因此 ,深入探究水稻铵转运蛋白的功
能和结构特性 ,有助于进一步理解水稻喜铵和耐铵的
机制。重叠 PCR技术将为基因的体外改造或突变 ,
以深入研究功能基因的结构功能特性提供了一种简
便易行的方法。重叠 PCR技术即重叠区扩增基因拼
接法 ( gene sp licing by overlap extension, gene SOE2
ing) ,也称作套叠利用 PCR技术 ,即利用 PCR引物引
入突变的位点或原模板不存在的片段 ,让引物与模板
进行有效结合而不完全匹配地扩增 ,从而达到在体外
进行有效的基因重组和定点突变 [ 18, 19 ]。
　　利用重叠 PCR技术对水稻高亲和的铵转运蛋
白 O sAMT112的 2个高度保守的氨基酸位点进行定
点突变 ,为进一步进行同源或异源表达研究奠定基
础 ,以深入地了解水稻转运铵的调控机制。
1　材料与方法
111　材料
11111　基因 　O sAMT112 (NM _00105399)基因由实
验室李素梅博士克隆 ,并被连接到 pMD18的载体。
11112　菌株 　大肠杆菌 ( E. coli) DH5α。
11113　生化试剂 　r Taq酶 ,高保真的 DNA聚合酶
( PrimeSTAR HS DNA Polymerase) , pMD18 simp le T2
vector, DNA琼脂糖凝胶小量纯化试剂盒 ,质粒 DNA
小量纯化试剂盒 , DL2000和λDNA H ind III的 Mark2
er,以上均购自 TaKaRa 公司 ; 限制性内切酶购
自 NEB。
112　方法
11211　重叠 PCR的扩增原理 　如图 1所示 , P1和
P4与原模板完全匹配 , P2与 P3引入突变的位点 ,
并有 12个以上相匹配的互补碱基 [ 19 ]。以 T为模
板 ,用引物 P1和 P2, P3和 P4分别扩增得到 T1和
T2,再以 T1和 T2的混合物为模板 ,用引物 P1和 P4
扩增得到突变的基因。
图 1　重叠 PCR的扩增原理示意图
11212　PCR 引物 　根据 NCB I网站获得的信息 ,
O sAMT112基因全长为 1 497 bp,对其氨基酸序列特
定位点突变 ,设计引物如表 1。
表 1　重叠 PCR扩增的引物序列
基因 /突变体名称 引物名称 引物序列 (5′→3′) (斜体为保护碱基 ) 备注
O sAM T112 P12F TTTAAGCTTATGGCGACGTGCTTGGAC 画线为 H ind III位点
P42R TTTGGATCCCTACACAAACTGGCCCGCCGC 画线为 B am H I位点
F253A P22R1 GTGAAGGACCCCGGGTTggcG 小写表示第 253个氨基酸 F突变为氨基酸 A
P32F1 GCgccAACCCGGGGTCCTT
S257A P22R2 GTGAAggcCCCCGGGTTGAAG 小写表示第 257个氨基酸 S突变为氨基酸 A
P32F2 GCTTCAACCCGGGGgccTT
11213　PCR 反应 　以 pMD182O sAMT112为模板 , 根据重叠 PCR的反应原理 ,设定以下程序 : 95℃, 2
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2009年第 9期 李宝珍等 :利用重叠 PCR技术对 O sAMT1. 2进行定点突变
m in; 94℃, 20 s; 53～55℃, 30 s; 72℃, 90 s, 22个循
环 ; 72℃, 7 m in; 15℃保温。
11214　PCR产物的回收与克隆 　PCR产物用 TaKa2
Ra胶回收试剂回收后 ,利用常规 rTaq酶在无引物的
PCR反应体系中 72℃反应 20 m in,将产物的 3’端加上
碱基 A,然后连接到 pMD18 simp le的 T2vector。
11215　克隆载体的转化与鉴定 　利用热击法将克
隆载体转化到 E. coli DH5α中 ,在含有 l00 mg/L氨
苄青霉素的 LB平板长进行蓝白斑筛选 ,挑取白色
的单菌落进行液体扩大培养、提取质粒 ,将质粒经
H ind III和 B am H I双酶切鉴定大小片段正确后 ,将
阳性菌株送上海英骏公司进行基因序列测定。
2　结果与分析
211　初次 PCR扩增
以稀释后的 pMD182O sAMT112载体为模板 ,表
2所示的引物进行配对 ,并获得了相应的 PCR产物。
如图 2所示的清晰条带 ,其中 P32F2 /P42R 的 PCR
产物不特异 ,有两条带 ,割胶纯化相对较大的片段为
S257A2T2。
表 2　第一次 PCR扩增引物的配对
PCR产物名称 引物 长度 ( bp) PCR产物名称 引物 长度 ( bp)
F253A2T1 P12F /P22R1 776 F253A2T2 P32F1 /P42R 755
S257A2T1 P12F /P22R2 776 S257A2T2 P32F2 /P42R 755
M. Marker DL2000; 1. 产物为 F253A2T1; 2. 产物为 F253A2T2;
3. 引物为 S257A2T1; 4. 产物为 S257A2T2
图 2　第一次 PCR扩增产物
212　第二次 PCR扩增
第一次获得的各突变体的模板 T1和 T2,经胶回
收和纯化 ,稀释到一定的浓度 ,等量混合后用引物 P12
F /P42R进行扩增 ,获得各突变体基因。将它们分别
割胶、回收、纯化得到基因大小均为 1 497 bp (图 3)
M. MarkerDL2000; 1. O sAMT112; 2. F253A; 3. S25A
图 3　第二次 PCR扩增产物
213　PCR产物鉴定
与 T2vector连接后转化到 E. coil DH5α中 ,提取
质粒 ,用 H ind III和 B am H I进行双酶切 (图 4) ,酶
切片段大小正确 ,再进行测序鉴定。
M. marker H ind III; 1. O sAM T112克隆载体 ; 2. O sAM T112载体的 H ind
III和 B am H I的双酶切产物 ; 3. F253A 克隆载体 ; 4. F253A 载体的
H ind III和 B am H I的双酶切产物 ; 5. S257A克隆载体 ; 6. S257A载体
的 H ind III和 B am H I的双酶切产物
图 4　克隆载体及其酶切验证
214　克隆载体的测序分析
经测序结果分析 ,所获得突变基因是预先设计
的定点突变 (图 5) ,说明 overlap PCR技术是一种简
便易行且有效的进行定点突变的的方法。
图 5　O sAM T112和其突变体的序列比对
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
3　讨论
重叠 PCR技术提供了一种有效且简便的体外
基因重组和突变的方法 ,它不仅可以进行单位点或
多位点突变 ,也可以通过缺失、外源片段的插入导致
突变 [ 18～22 ]。在进行 overlap PCR反应进行基因改造
时 ,要注意以下几点 : (1)高保真 DNA聚合酶 ,具有
3′→5′外切核酸酶校对能力 ,并避免在产物 3’端引入
非模板碱尾 A; (2)第二次 PCR反应时 ,两模板等里
混合 ,且浓度相当 ,不能太高。本试验中在 PCR产
物纯化后 ,测 ODA260在 0102左右 ,一般扩增效果比
较好 ; (3) PCR反应时 ,循环数不要太多 ,一般 20～
26个循环 ,以减少错配的机率。
水稻铵转运蛋白基因已鉴定到至少有 10个左
右 ,但目前对它们的研究仅局限于转录表达 ,而其吸
收的机制和结构功能特性尚不清楚 ,而且水稻基因
组超过 38 000个基因 [ 23 ] ,相对比较大的基因组的
作物 ,要获得铵转运蛋白的突变体也比较困难 ,所以
可以利用重叠 PCR技术进行功能基因的体外突变
和基因重组 ,再通过异源表达系统进行研究。
对水稻 O sAMT112的蛋白质序列所进行的单点
突变 ,如 253F, 257S,和 455D是 AMT中高度保守的
序列 ,在大肠杆菌、番茄、或拟南芥的同源 F和 D位
点突变导致铵转运蛋白的活性下降 ,甚至无法转运
铵 , S位点的突变可以增强大肠杆菌转运铵的能力 ,
而 E位点是相对特异的位点 ,还未有文献对其有所
报道。本研究改造和重组所得的突变基因 ,将用于
酵母异源表达和双电极电压钳的电生理特性研究 ,
以揭示 O sAMT112蛋白质的结构功能特性 ,为从生
物学的途径提高水稻氮肥利用率 ,减少氮肥的损失
和施用 ,改善环境污染奠定基础。
参 考 文 献
1　朱兆良. 土壤与环境 , 2000, 9 (1) : 1～6.
2　赵首萍 , 施卫明. 土壤 , 2007, 39 (3) : 460～464.
3　 Sohlenkamp C, Wood CC, Roeb GW , et al. Plant Physiol, 2002,
130: 1788～1796.
4　 Suenaga A, Moriya K, Sonoda Y, Ikeda A, et al. Plant Cell Physi2
ol, 2003, 44: 206～211.
5　 李宝珍 , 范晓荣 , 徐国华. 植物生理学通讯 , 2009, 45 ( 1 ) : 80
～88.
6　 Sonoda Y, Ikeda A, Saiki S, von W iren N, et al. Plant Cell Physi2
ol, 2003, 44: 726～734.
7　 Kumar A, Silim SN, Okamoto M, et al. Plant, Cell & Environ2
ment, 2003, 26: 907～914.
8　 L i BZ, Xin WJ, Sun SB, et al. Plant and Soil, 2006, 287: 145～
159.
9　 Sonoda Y, Ikeda A, Saiki S, et al. Plant Cell Physiol, 2003, 44
(12) : 1396～1402.
10　Merrick M, Javelle A, Durand A, et al. The Escherichia coli Am tB
Protein as a Model System for Understanding Ammonium Transport
by Am t and Rh Proteins. Transfusion Clinique et B iologique, 2006,
13: 97～102.
11　L i XD, Lupo D, Zheng L, et al. Structural and Functional Insights
into the Am tB /Mep /Rh Protein Fam ily. Transfusion Clinique et B i2
ologique, 2006, 13: 65～69.
12　Conroy MJ, Durand A, Lupo D, et al. PNAS, 2007, 104: 1213～
1218.
13　Ludewig U, Neuhauser B, DynowskiM. FEBS Letters Plant Trans2
porters and Channels, 2007, 581: 2301～2308.
14　Javelle A, Lupo D, R ipoche P, et al. PNAS, 2008, 105: 5040
～5045.
15　Ludewig U, W ilken S, W u B, et al. J B iol Chem, 2003, 278:
45603～45610.
16　Loque D, Lalonde S, Looger LL, et al. Nature, 2007, 446: 195～
198.
17　Neuhauser B, Dynowski M, Mayer M, et al. Plant Physiol, 2007,
143: 1651～1659.
18　周鹏 , 沈文涛 , 黎小瑛. 生命科学研究 , 2004, 8 (1) : 28～31.
19　周鹏 , 董克家. 生命科学研究 , 2001, 5 (1) : 52～55.
20　李成华 , 房海燕 , 邓小云 , 等. 中华医学遗传学杂志 , 2004, 21
(1) : 52～55.
21　罗师平 , 冷希岗. 国外医学生物医学工程分册 , 2005, 28 ( 3 ) :
188～192.
22　朱明月 , 沈文涛 , 周鹏. 生命科学研究 , 2006, 10 ( 4 ) : 309
～312.
23　 International R ice Genome Sequencing Project. The map2based se2
quence of the rice genome. Nature, 2005, 436 (7052) : 793～800.
27