全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
一种简单有效且适于土壤微生物
多样性分析的 DNA提取方法
张海燕　王彩虹　龚明福　张利莉
(塔里木大学生命科学院 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室 ,阿拉尔 843300)
　　摘 　要 : 　参照 Zhou[ 11 ]的方法进行了改进 ,获得了一种简单、有效的 DNA提取方法。此方法操作简单、从大量样品改为
小量样品的提取 ,利用高浓度的 PEG沉淀 ,不作回收纯化 ,所提 DNA片段较大 ,在 23 kb以上 ,每克土的 DNA提取量从 3. 74～
15. 28μg, OD260 /OD230比值在 0. 89～1. 21范围内 ,用真菌和细菌核糖体特异性引物进行 PCR扩增 ,均获得较好的结果 , DGGE
图谱显示丰富性较高 ,可用于细菌多样性和真菌多样性的分析。此方法能够从 4种不同性质土壤中提取出 DNA,但提取盐渍
土壤和碱性土壤的效果更好一些 ,为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定良好的基础。
关键词 : 　土壤微生物多样性 　宏基因组 DNA　DNA提取 　PCR　DGGE
A Simple and Effective M ethod of DNA Extraction
from Soil for M olecular Biodiversity Analysis
Zhang Haiyan　W ang Caihong　Gong M ingfu　Zhang L ili
( Key Laboratory of P rotection and U tilization of B iological R esources in Tarim B asin of X injiang
Production and Construction Groups, Institute of L ife Science, Tarim University, A lar 843300)
　　Abs trac t: 　 In this paper, based on Zhou’method, a simp le and effective method for direct extraction of DNA was obtained, in
which small amount of samp les and DNA p recip itation with higher concentration polyethylene glycol without purification involved in.
The result showed that this method not only generate the largest DNA fragments in size, but also was directly used as PCR amp lification
with bacterial and fungal specific p rimers. The OD260 /OD230 ratio of the isolated DNA was 0. 89～1. 21, and the yields from one gram
soil was 3. 74～15. 28μg. DGGE p rofiles demonstrated the method was suit for simultaneous recovery of bacterial and fungal communi2
ty total DNA. It p roved that this method can extracted DNA from four kinds of soil, especially saline2alkaline soil.
Key wo rds: 　Soil m icroorganism s diversity　Metagenom ics DNA　DNA extraction　PCR　DGGE
收稿日期 : 2009204213
基金项目 :国家“973”计划前期研究专项资助课题“新疆连作棉田土壤微生态平衡机理研究 ( 2007CB116303) ,新疆生产建设兵团基础研究项
目”新疆棉花连作条件下土壤微生物与棉花相互作用机理的研究 (2007JC06) ,新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重
点实验室开放课题 ( TD06005)
作者简介 :张海燕 (19792) ,江苏人 ,女 ,硕士 ,讲师 ,从事干旱区生物分子生物学研究 ; E2Mail: zhanghaiyansw03@163. com
通讯作者 :张利莉 (19632) ,河南人 ,女 ,博士 ,教授 ,从事微生物分子生物学研究 ; E2Mail: zhang63 lyly@yahoo. com. cn　　土壤中只有一小部分微生物可以分离培养出来 ,拒估计大约有 99%的微生物不可培养 [ 1 ] ,大大限制了人们对土壤微生物资源及其基因资源的研究与利用。目前 ,对土壤微生物的研究主要是借助了分子生物学的手段 ,直接从土壤中获得微生物的宏基因组 DNA进行分析 ,该策略使环境微生物多样性分析成为一种尽可能全面的方法。近年来 ,关于土壤宏基因组 DNA提取方法的报道很多 [ 2, 3 ] ,然而主 要侧重于提取土壤中细菌群落的总 DNA的提取 ,较少关注土壤中真菌群落总 DNA的提取及其提取效果。来自环境中的样品含有非常复杂的成分 [ 4 ] ,尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中不能去除掉 ,直接影响后续的 PCR扩增。所以大多数方法初提的 DNA都要经过回收纯化 ,然而回收的过程或多或少的会损失部分 DNA ,尤其是大片段的 DNA回收率比较低 ,有人利用通过透析袋回收纯化 ,纯化回
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
收率只能够达到 65. 34% [ 5 ] ,仍然丧失了一部分
DNA ,对于实际上存在量本来就少的微生物种类在
后续的检测中就很难检测到 ,因而不能真实地反应
土壤微生态结构。因此 ,如何减少提取以后的 DNA
损失是有待于解决的问题。
对于土壤微生物群落结构分析 ,目前常利用特
异引物对核糖体 DNA进行 PCR扩增 ,结合 DGGE
电泳检测技术进行。 1998 年 Muzyer等 [ 6 ] 首次将
DGGE技术技术应用于分析其微生物种群结构的差
异变化 ,并证实了这种检测技术以其高灵敏性在揭
示白然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面
具有独特的优越性。越来越多的人将其应用于追踪
微生物的变化与环境条件变化的规律 [ 7～9 ]。然而 ,
DGGE技术的分析结果受到很多因素的影响 ,其中
最重要的就是土壤中宏基因组的提取 ,有研究报道
不同的 DNA提取的方法对 DGGE分析土壤微生物
的多样性有较大的影响 ,有些提取方法造成 DGGE
分析条带的亮弱均一 ,导致对土壤中的优势种 ,特殊
种的分析产生偏差 ,有些方法提取的效率较低 ,所提
取的 DNA在进行 DGGE的检测时 ,所能检测到的条
带数非常少 ,反应的微生物多样性程度较低 [ 10 ]。
本实验室以 Zhou[ 11 ]的方法为基础 ,经过改进 ,
获得一种只需少量土壤样品、无需回收纯化、简单有
效的 DNA提取方法 ,从土壤中能同时有效地提取细
菌和真菌的总基因组 DNA,可用于土壤微生物分子
生态学研究。
1　材料和方法
111　土壤样品的采集
土壤样品的采集来源及特点如表 1。
表 1　土壤样品的特点
样品标号 来源 特征 土壤 pH值
1 四川省螺髻山 药用植物根际土 4. 30
2 新疆罗布泊湖 盐土 6. 96
3 新疆塔里木河岸 胡杨根际土 8. 64
4 新疆阿克苏 棉田土 7. 60
　注 :样品 1为四川农业大学微生物系赵珂博士提供
112　土壤 DNA的提取方法
参照 Zhou的方法 ,并进行了改进 :称 0. 5 g土
样于 2 m l离心管中 ,加 1. 3 m l提取液 ( 0. 1 mol
Tris, 0. 1 mol EDTA, 0. 1 mol磷酸缓冲液 , 1. 5 mol
NaCl, 1% CTAB, pH8. 0)涡旋混匀后置于 - 80℃冰
箱静止 30 m in (或液氮速冻 5 m in) ,取出于 65℃水
浴融化 ,反复冻融 3 次 ; 加 100 μl蛋白酶 K ( 10
mg/m l) , 37℃摇床振荡 30 m in,加 200 μl浓度为
20%的 SDS, 65℃水浴 2 h (期间每 15～20 m in轻轻
颠倒混匀 ) ,室温 6 000 r/m in离心 10 m in,收集上
清 ,尽可能的不要取到上清与土壤沉淀之间的杂质 ;
沉淀加 0. 75 m l提取液和 50μl 20% SDS,涡旋 10 s,
65℃水浴 10 m in,室温 6 000 r/m in离心 10 m in,合
并上清 ; 上清中加 0. 5 倍体积的聚已二醇 8000
(50% PEG, 1. 5 mol NaCl)混匀 ,沉淀过夜 ; 6 000
r/m in离心 30 m in,弃上清 ,沉淀加入 0. 5 m l 1 ×TE
溶解 ;用等体积的氯仿 ∶异戊醇 ( 24∶1 )抽提 , 4℃,
12 000 r/m in离心 20 m in收集上清 ,重复一次 ;用
0. 1倍体积 NaAc ( 3 mol/L )和 0. 6倍体积异丙醇
( - 20℃预冷 )室温沉淀 4 h, 4℃, 12 000 r/m in离心
20 m in弃上清 ;沉淀用 70%乙醇洗涤 , 4℃, 12 000
r/m in离心 20 m in弃上清 ,晾干 ;加 50 μl超纯水
溶解。
113　土壤 DNA浓度及纯度的检测
取 5μl所提取的 DNA, 0. 7 %琼脂糖检测 ,以
λm ix19 ( Fermentas)为 Maker,用紫外分光光度计
( B ioPhotometer 6131, Eppendorf ) 测 定 DNA 的
OD260、OD230、OD260 /OD230的值及 DNA的纯度 ,测定
时 DNA稀释了 10倍 ,所提土样量为 0. 5 g,最终换
算成每克土壤中所提 DNA的量。
114　土壤 DNA的 PCR反应
利用细菌的 16S rDNA和真菌的 18S rDNA 特
异引物分析土壤中细菌和真菌 DNA的提取质量。
细菌 16S rDNA的扩增引物 F27: 5′2AGAGTTTGATC
MTGGCTCA23′; R1522: 5′2AAGGAGGTGATCCAGCC
GCA23′,再利用 V3区的引物 F3572GC: 5′2CGCCCG
CCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG
CCTACGGGAGGCAGCAG23′和 R518: 5′2ATTACCGC
GGCTGCTGG23′扩增 V3区 ;真菌 18SrDNA 的扩增
引物为 Geo11: 5′2CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC23′,
GeoA2: 5′2ACCTTGTTACGACTTTTACTTCC23′; 扩增
其中片段 [ 12 ]用 NS12GC: 5′2CGCCCGCCGCGCGCGG
GCGGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTT
GTC23′, NS2: 5′2GGCTGCTGGCACCAGACTTGC23′进
行。二次扩增的引物前均加 GC夹子 ,便于后续的
251
2009年第 8期 张海燕等 :一种简单有效且适于土壤微生物多样性分析的 DNA提取方法
DGGE分析。
长片段 PCR反应体系及程序 :扩增反应在 B io2
Rad公司生产的 Mycycle PCR仪中进行 ,反应总体
积为 20μl:模板 DNA1 ng, PCR buffer 2μl, Mg2 + 2
μl,引物 (10μM )各 0. 2μl, BSA ( 10 mg/m l) 2μl,
dNTPs(各 10 mM ) 0. 3μl, Taq酶 ( 5 U /μl) 0. 2μl,
ddH2 O 补齐至 20 μl。长片段扩增应程序 : 94℃
4 m in; 94℃40 s, 46℃40 s, 72℃40 s,共循环 38次 ;
72℃延伸 10 m in; 4℃保存。
PCR二次扩增反应体系 :取一次扩增产物 1μl,
PCR buffer 5μl,Mg2 + 5μl,引物 (10μM )各 0. 5μl,
dNTPs(各 10 mM ) 0. 7μl, BSA (10 mg/m l) 2μl, Taq
酶 (5 U /μl) 1μl, ddH2 O补齐至 50μl。采用降落式
PCR反应程序 : 94℃4 m in; 94℃30 s, 63℃ 30 s, 72℃
30 s,共循环 15次 ; 94℃ 30 s, 63℃ 30 s(每循环 1次
下降 1) , 72℃ 30 s,共循环 13次 ; 94℃ 30 s, 52℃
30 s, 72℃ 30 s; 72℃延伸 7 m in; 4℃保存。扩增产
物利用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 , DL2000作为
Marker。
115　PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳 (DGGE)
分析
采用 B io2Rad公司 DcodeTM的基因突变检测系
统对 PCR反应产物进行分离。分别用浓度为 10% ,
6%的丙稀酰胺 ,变性剂范围为 30 % ～60 %。电泳
150 V, 6 h。EB染色 15 m in后 ,凝胶成像系统 (B io2
Rad, Gel Doc 2000TM )观察拍照。
2　结果与分析
211　DNA的提取效果
用改进的方法提取 4种不同性质的土壤均能提
取出 DNA (图 1) ,片段在 23 kb以上 ,与国内外土壤
微生物的提取片断大小吻合。在酸性土壤中有略微
拖尾现象 ,其他的 3类土壤中不存在拖尾现象。腐
殖酸在 230 nm处有吸收峰 ,通过估算 OD260 /OD230
值来确定所提取的 DNA 中腐殖酸的污染程度 ,
OD260 /OD230值越高 ,表明 DNA纯度越纯 ,反之 ,腐殖
酸污染越严重 [ 13 ]。用此方法所提的 DNA的比值在
0. 89～1. 23之间 (表 2) ,从酸性土壤提取的 DNA的
OD较低 ,而在盐渍土壤和碱性土壤中提取的 DNA
的 OD比值高一些 ,表明此方法更适合于提取盐渍
土壤和碱性土壤的 DNA。每 1 g土壤中 ,所提取的
DNA的从 3. 74～15. 28μg,从罗布泊盐碱土壤中提
出的量最少 ,可能与此种土壤中本身生物量较少有
关。虽然比值低于理想值 ,此纯度能够满足后续分
析的需要。
11药用植物根际土 ; 21罗布泊湖盐土 ; 31胡杨根际土 ; 41棉田土壤
图 1　4种不同质地土壤总 D NA的琼脂糖凝胶检测
表 2　4种不同性质土壤微生物总 D NA的提取量和纯度
样品编号 OD230 OD260
OD260 /
OD230
DNA的浓
度 ( ng/μl)
每克土壤 DNA
的量 (μg/g)
1 0. 443 0. 394 0. 89 78. 8 7. 88
2 0. 158 0. 188 1. 19 37. 4 3. 74
3 0. 610 0. 714 1. 17 142. 8 14. 28
4 0. 632 0. 765 1. 21 152. 8 15. 28
212　PCR的琼脂糖凝胶检测结果和 DGGE检测结果
利用细菌的 16SrDNA和真菌的 18S rDNA的特
异引物对所提取的 4种性质的土壤进行 PCR扩增 ,
均获得较强的扩增结果 ,如图 2。16S rDNA V3区的
扩增的目标片段为 230 bp左右 ,对 18S rDNA的扩增
在 550 bp左右 ,在胡杨根际土和棉田土壤中的扩增
条带更亮些 ,说明在这两个样品中的扩增更强一些。
DGGE图谱条带的丰富性和亮弱程度可以反应
土壤的微生物的多样性和优势种类、特殊种类 ,可利
用 DGGE技术分析评价该方法所提 DNA的全面性。
图 3为土壤细菌的 DGGE图谱 ,细菌的条带数达到
40条以上 ,并且优势种条带明显 ,条带集中于整个
凝胶的中间部分。图 4为土壤真菌的 DGGE图谱 ,
真菌的条带数达到 30条以上 ,优势种条带明显。分
析表明细菌的丰富性较真菌多 ,不同性质的土壤中
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
1～4. 16SrDNA V3区的扩增结果 ; 4、5～7. 18SrDNA的扩增结果 ; 1、
5. 药用植物根际土 ; 2、6. 罗布泊湖盐土 ; 3、7. 塔里木河岸胡杨根际
土 ; 4、8. 团棉田土壤
图 2　16S rD NA V3区的扩增结果和 18SrD NA的扩增结果
真菌之间的相似性较细菌之间的相似性小 ,条带集
中于整个凝胶的中间部分 ,显示真菌、细菌均存在较
丰富的多样性。此方法能够较为灵敏、全面的反应
土壤微生物的多样性 ,也说明所提 DNA较为全面。
1. 药用植物根际土 ; 2. 罗布泊湖盐土 ; 3. 胡杨根际土 ; 4. 棉田土壤
图 3　16S rD NA V3区的 D GGE检测结果
3　讨论
目前认为 ,从土壤微生物群体基因组的角度研
究其多样性及功能是可行的方法 ,并受到广泛的关
1. 药用植物根际土 ; 2. 罗布泊湖盐土 ; 3. 胡杨根际土 ; 4. 棉田土壤
图 4　18S rD NA的 D GGE检测结果
注 [ 14 ]。因而越过分离培养的步骤 ,直接从土壤中获
得总 DNA分析土壤微生态群落结构关键的步骤是
如何尽可能全面地提取土壤中微生物的总 DNA ,土
壤本身成分复杂 ,有许多物质难以预料 ,对提取较好
质量的 DNA提出了很高的要求。因此建立一种简
单有效的提取方法显得非常重要。目前提取土壤
DNA的方法主要有直接提取法和间接提取法 ,间接
提取纯度较高 ,但提取的种类和数量较少 ;直接提取
法是直接在土壤中裂解细胞 ,使其中内含物尽可能
的释放 ,能够代表大部分的土著微生物。但是由于
土壤中所含物质种类较多 ,量较大 ,因而提取的质量
受到很大的影响 ,许多方法需要对粗体 DNA做纯化
处理 ,常用的氯化铯密度梯度超速离心、电泳法、过
滤法、试剂盒法。回收纯化后往往造成部分 DNA的
丧失 ,可能在土壤中本身存在量较少的种类会丧失
或检测不到 ,影响土壤微生物多样性的分析。本方
法在参照 Zhou的方法进行了改进。大量样品提取
改为小量样品的提取 ,样品加入裂解液后 - 80℃冰
箱 (或液氮 )与 65℃反复冻融 ,利于细胞壁较厚的微
生物充分破壁 ,使细胞内含物的充分释放 ,在 DNA
沉淀的过程中采用聚乙二醇 ( PEG8000 )。沉淀
DNA分子所用的 PEG的浓度也不同 ,沉淀大片段
DNA分子所需 PEG的浓度只需 1%左右 ,小片段
DNA分子所需 PEG浓度高达 20%。本试验加入终
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2009年第 8期 张海燕等 :一种简单有效且适于土壤微生物多样性分析的 DNA提取方法
浓度为 17% PEG进行沉淀 ,获得较好的沉淀效果。
另外 ,有人用 PEG沉淀结合碱裂解法提取 DNA可
消除肝素对 PCR检测结果的影响 DNA [ 15 ] ,这可能
也是本方法不用回收纯化而获得较好质量 DNA的
一个原因。目前对于土壤 DNA的提取质量方面 ,一
般认为所提取的片段在 23 kb以上即可 ,有人报道
每克土壤中所提 DNA的量在 2. 5～31μg之间 ,本
方法所提大小在 23 kb以上 , DNA的提取量每克土
壤中所提取的 DNA的从 3. 74～15. 28μg获得较稳
定的提取量。
从土壤中尽可能的提取出所有种类微生物的
DNA是进行土壤微生态分析的基础 ,也是充分发应
土壤微生物多样性的必备条件。提取土壤 DNA进
行微生物多样性分析的一个重要的环节在于是否能
够进行 PCR扩增。土壤中存在大量的 PCR反应抑
制剂 ,如腐殖酸、腐殖酸类似物 ,重金属离子等 ,有人
提取粗 DNA 不经过纯化 , 就无法获得 PCR 产
物 [ 16 ]。本方法不经过纯化直接进行 PCR反应 ,通
过两次 PCR,细菌 16S rDNA 特异引物及真菌 18S
rDNA核糖体 DNA特异引物均获得较好的扩增结
果。PCR过程中发现 ,加入 BSA对 PCR有一定的
影响 ,可能由于本方法不做回收纯化 ,而土壤中有些
不确定的物质残留到 PCR体系中 ,从而影响 Taq酶
的活性 ,加入了 BSA对 Taq酶有一定的保护作用 ,
从而达到更好的扩增效果。PCR分析中发现 ,此方
法提取的宏基因组 DNA不但能够扩增原核生物的
特异基因 ,也能扩增真菌的特异基因 ,表明该方法能
从土壤中同时有效提取细菌和真菌总基因组 DNA,
DGGE分析结果显示 ,土壤细菌和真菌均表现出较
高的多样性 ,代表了较丰富的类群。本方法不但适
于分析土壤细菌群落结构 ,同时也可用于分析真菌
等真核微生物的多样性。
本方法从 4种不同性质的土壤中均有效地提取
到 DNA,在酸性土壤中提取的 DNA的杂质残留较
多 ,可能与土壤偏酸性有关系 ,其 DNA提取融解液
的颜色深 ,色素残留较多 ,但是并不影响后续的
PCR及 DGGE分析 ;从盐土及碱性土壤中所提的
DNA的质量较高 ,说明该方法更适合于盐碱土壤
DNA的提取。
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