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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2009年第 4期
猪源冠状病毒 TGEV中国分离株
纤突蛋白生物信息学分析
李建强 1, 2
柳纪省1
程杰 1, 2
兰喜 1
殷相平 1
李宝玉 1
李学瑞1
杨彬 1
娄忠子 1
吴润 2
( 1中国农业科学院兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 农业部畜禽病毒学重点开放实验室,
兰州 730046; 2甘肃农业大学动物医学院,兰州 730070 )


摘
要:
以猪源冠状病毒 ( Po rc ine coronav irus) TGEV纤突蛋白基因序列为基础,利用生物软件对 TGEV中国分离株纤
突蛋白进行 N
糖基化位点、跨膜螺旋、进化树、二级结构及抗原位点的预测和分析。结果显示所有 TGEV毒株可分为 3个基
因型, 4株中国分离株分别归属于以上 3个基因型, 属于
型的中国株 TSX在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上与其他中国株
有明显的差异, 而同属于
型中国毒株 SC
Y和 TH
98在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构上非常接近, 而所有中国分离株抗原
表位没有明显差别, 表明 TGEV在中国没有显著的变异。
关键词:
猪源冠状病毒
猪传染性胃肠炎
纤突蛋白
生物信息学分析
Bioinformatics Analysis of Spike Protein Gene of Porcine Coronavirus
L i J ianqiang
1, 2
L iu J ix ing1
Cheng Jie1, 2
Lan X i1
Y in X iangp in1
L i Baoyu1
L iXuerui
1
Yang B in1
Lou Zhongzi1
W uRun2
(
1
K ey Laboratory of Animal V irology of M inistry of Agr iculture, S tateK ey Laboratory of Veterinary E tiologicalB iology,
Lanzhou Veterinary R esearch Institute, ChineseA cademy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046;
2
College of VeterinaryM edicine, Gansu Agricultural University , Lanzhou 730070)


Abstrac:t
Based on the sequence of spike prote in of transm issib le gastroenter itis co rnav irus ( TGEV ) , the N
g lycosy la tion site,
transm em brance reg ion, phy logeny tree, secondary structure and B ce ll epitopew ere ana ly zed and pred icted using b io
softw are
The re

su lts show ed tha t a ll the refe rence TGEV iso lates cou ld be div ided into 3 genetic groups wh ich inc ludes 4 Ch inese iso la tes. The TSX
from Ch ina be longed to
g roup had h igh differences on transm em brance reg ion and secondary structu re w ith o ther Chinese iso la tes,
wh ile the SC
Y and TH
98 belonged to
group have h igh sim ilarity on transm embrance reg ion and secondary structure
But there
w ere no differences o f B ce ll ep itope am ong a ll the Chinese iso lates, ind ica ting that no no tab le variation happened on theCh ineseTGEV
iso lates

Key words:
Porc ine coronav irus
transm issib le g astroenteritis coronav irus
Sp ike gene
B io inform atics analysis
收稿日期: 2008
10
20
基金项目:重大基础研究
973
前期研究专项 ( 2004CCA00500)
作者简介:李建强 ( 1979
) ,男,甘肃秦安人,在读博士,研究方向:动物病毒分子生物学与生物信息学; E
m ai:l jianqiangli2003@ sina
com
通讯作者:柳纪省, E
m ai:l liu jixing@ hotm ail
com


猪传染性胃肠炎病毒 ( transm issible gastroenterit is
virus of sw ine, TGEV )隶属于冠状病毒科冠状病毒属,
是引起猪腹泻的重要病原,所引起的猪传染性胃肠炎
(TGE)以对仔猪高度致死 (通常达 100% )为特征 [ 1]。
截至目前,我国大部分省市 (区 )均有本病流行,并且
呈上升趋势。TGEV的基因组为不分节段的单股正
链 RNA, 3
端有 Poly(A ),基因组长约 28
5 kb,编码 4
种结构蛋白 ( S、M、sM 和 N )和 3种非结构蛋白
( ORF1、ORF3和 ORF7)。TGEV的纤突 ( S)蛋白突出
于病毒粒子外,携带主要的 B淋巴细胞识别抗原决定
簇,是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫原,
可介导细胞吸附、膜融合,并在决定病毒毒力、组织嗜
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
性及血凝性等方面起重要作用, 因而 S蛋白基因是
基因工程疫苗研究的首选基因。 S基因全长约 4
4

103 bp ,主要抗原位点位于 S蛋白的 N端, 约占 S
蛋白的一半,其诱导产生的免疫保护作用几乎相当于
整个 S蛋白诱导产生的保护作用 [ 2, 3]。
本研究应用生物信息学技术对 TGEV中国分离
毒株 S蛋白二级结构和 B淋巴细胞表位进行预测,以
期研究 TGEV中国分离毒株的变异情况,并为 TGEV
反向遗传学及基因工程疫苗的研究提供理论依据。
1
材料与方法
1
1
TGEV纤突蛋白氨基酸序列
TGEV TS株序列由兰州兽医研究所家畜疫病
病原生物学国家重点实验室测出并提交 GenBank
(登陆号: DQ201447) , 其它序列均来自 GenBank,
包括 96
1933 ( AF104420, UK ) , To14 ( AF302263,
Japan), V irlent Purdue ( DQ811789, US ), M iller M 6
( DQ811785, US) , TH
98 (AF494337, China) , SC
Y
( DQ443743, China), TSX ( DQ001167, China)。
1
2
TGEV纤突蛋白功能位点及跨膜预测
利用 Pro tein Prediction[ 4 ]在线软件对 TGEV不
同毒株 S蛋白进行功能位点的分析;利用 SOSU I[ 5]
在线软件对其进行跨膜分析。
1
3
TGEV纤突蛋白基因系统进化树
根据 TGEV纤突蛋白基因, 利用 C lustal X l
82
软件对 TGEV绘制系统进化树。
1
4
TGEV纤突蛋白蛋白二级结构预测
应用 DNAS tar Protean 软件提供的模块, 用
Chou
Fasman法 [ 6, 7 ]从氨基酸残基的晶体结构来预
测蛋白质的二级结构, Garnier
Robson法 [ 8 ]计算特
定氨基酸残基在特定结构内部的可能性, K arp lus

Schu ltz法 [ 9]预测蛋白质骨架区的柔韧性。
1
5
TGEV纤突蛋白 B细胞抗原表位的预测
应用 DNAS tar Pro tean软件, 以 7个氨基酸残基
为一组的方案, 采用 Kyte
Doo little法 [ 9]预测蛋白质
的疏水区和亲水区; Em in i法 [ 10]预测特定区域位于
蛋白质表面的可能性; Jameson
Wolf法 [ 11]预测蛋白
的抗原指数。
2
结果
2
1
TGEV纤突蛋白功能位点及跨膜预测
TGEV不同毒株 S蛋白功能位点结果显示,
TS、M illerM 6、96
1933和 TSX株有 3个糖基化位
点, V irulent Purdue和 SC
Y有 33个 N
糖基化位点,
To14和 TH
98有 32个 N
糖基化位点。跨膜预测
如表 1。
表 1
TGEV 不同毒株跨膜预测
菌株 数量 N基端 跨膜区 C基端 类型 长度 ( n t)
TS 1 4
LFVVLVVMPL IY
GDNFPC SKLTN
26 secondary 23
2 1 400
VVIFC IPLLLFC
CCSTGCCGC IG
1422 prim ary 23
M iller 1 4
LFVVLVVMPL IY
GDNFPC SKLTN
26 secondary 23
M6 2 1 400
VVIFC IPLLLFC
CCSTGCCGC IG
1422 prim ary 23
To14 1 4
LFVVLVVMPL IY
GDNFPC SKLTN
26 secondary 23
2 1 400
VVIFC IPLLLFC
CCSTGCCGC IG
1422 prim ary 23
V iru lent 1 4
LFVVLVVMPL IY
GDNFPC SKLTN
26 secondary 23
Purdue 2 1 399
VVIFC IPLLLFC
CCSTGCCGC IG
1421 prim ary 23
TH
98 1 4 LFVVLVVMPL IY
GDNFPC SKLTN
26 secondary 23
2 1 398
VVIFC IPLLLFC
CCSTGCCGC IG
1420 prim ary 23
SC
Y 1 4 LFVVLVVMPL IY
GDNFPC SKLTN
26 secondary 23
2 1 397
VV IFC IPLLLFCC
CSTGCCGC IG
1419 prim ary 23
96
1933 1 1 MK ILFVVLVVM
PLIYGDNFPC SK
23 secondary 23
2 1 400
VVIFC IPLLLFC
CCSTGCCGC IG
1422 prim ary 23
TSX 1 1
MKILFVVLV IM P
L IYGDNFPCSK
23 secondary 23
2 1 400
VVIFC IPLLLFC
CCSTGCCGC IG
1422 prim ary 23
2
2
TGEV纤突蛋白二级结构预测
4株 TGEV中国分离株 S蛋白二级结构预测结果
如图 1。综合 Garn ier
Robson法和 Karplus
Schultz法预
测 TGEV S蛋白二级柔性区域位于 N端第 47~ 49, 98~
100, 109~ 112, 120~ 125, 135~ 138, 283~ 286, 382~ 385,
416~ 418, 553~ 555, 920~ 924, 936~ 940, 1 030~ 1 032, 1
209~ 1 212, 1 279~ 1 280, 1 337~ 1 340和 1 437~ 1 438
区段。
96
2009年第 4期 李建强等:猪源冠状病毒 TGEV中国分离株纤突蛋白生物信息学分析
图 1
TGEV不同毒株二级结构预测
2
3
TGEV纤突蛋白基因系统进化树分析
TGEV纤突蛋白基因核苷酸序列系统进化树如
图 2。
图 2
根据 TGEV纤突蛋白基因核苷酸
序列绘制系统进化树
2
4
TGEV纤突蛋白 B细胞抗原表位的预测
TGEV中国分离株抗原表位预测结果显示, 4株
TGEV中国分离株 S蛋白抗原表位没有显著差异 (图
3),结合表面可能性及亲水性区域预测 S蛋白抗原表
位区域位于 N端第 44~ 50, 71~ 75, 97~ 103, 118~ 123,
136~ 144, 234~ 244, 395~ 397, 541~ 544, 558~ 564, 643~
649, 701~ 705, 779~ 786, 950~ 958, 978~ 983, 1 058~ 1
060, 1 165~ 1 193, 1 259~ 1 263, 1 320~ 1 325, 1 349~ 1
357, 1 434~ 1 443。
3
讨论
纤突蛋白基因是 TGEV结构蛋白基因中最大的
基因,此外,由于其存在于病毒粒子之外,也是变异最
大的基因。本研究对 TGEV中国分离株纤突蛋白 N

糖基化位点、跨膜螺旋及其二级结构进行了预测和分
析,以期从以上 3个方面对 TGEV中国分离株进行遗
传和变异分析。TGEV S蛋白的 N
联糖基化位点的
变异主要集中在氨基端区域, S蛋白的 4个主要抗原
位点 (A、B、C、D )也存在于氨基端区域, A、B两位点
是依赖于 S蛋白的糖基化作用和正确折叠构型产生
的,而 C、D两位点的这种依赖性则很小 [ 12]。糖基化
位点预测发现, TS和 TSX有 34个 N
糖基化位点, SC

Y株和 TH
98株各含有 33和 32个 N
糖基化位点。
跨膜预测结果显示所有 TGEV毒株 S蛋白皆有两次
跨膜螺旋,中国毒株 TS、SC
Y、及美国毒株 M illerM 6、
V irulent Purdue和日本毒株 To14跨膜区域氨基酸残
基均相同,中国毒株 TSX和英国毒株 96
1933跨膜区
域氨基酸残基相同,而此 2毒株首次跨膜区域氨基酸
残基与其它毒株有一定的差异。二级结构综合分析
显示 4株中国分离株中 TSX株与其他 3株二级结构
差异最大,而 SC
Y和 TH
98二级结构最为相似。
为了进一步研究中国分离株之间及其与国外分
离株的关系, 进行了 TGEV系统进化树分析, 系统
进化树表明所有 TGEV毒株可分为 3个基因型, 即

型、
型、
型,其代表株分别为英国株 96
1933、
美国株 M iller株及美国株 Purdue株, 而 4株中国分
97
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2009年第 4期
离株分别归属于以上 3个基因型。由此可见, TGE
在中国流行的范围比较广,而且 TGEV流行毒株比
较复杂,这给 TGE的防治带来了一定困难。属于

型的中国株 TSX在跨膜螺旋的氨基酸及二级结构
上与其他中国株有明显的差异, 而同属于
型中国
毒株 SC
Y和 TH
98在跨膜螺旋的氨基酸及二级结
构上非常接近。由此可见,不同 TGEV基因型在跨
膜螺旋区域和二级结构上有一定的差异,所以跨膜
螺旋和二级结构可以作为 TGEV遗传变异的两个标
志, 对 TGEV的流行病学研究有一定的意义。
图 3
不同毒株抗原表位预测比较


由于 RNA聚合酶缺乏矫正功能,所以 RNA病毒
容易发生变异。截止目前,相关研究表明 TGEV只有
一个血清型,与其它冠状病毒没有抗原相关性,传统
实验室方法不能鉴定不同 TGEV毒株抗原的差异性。
为了进一步研究 TGEV的变异性,对不同中国分离毒
株的抗原性、跨膜螺旋及二级结构进行预测分析, 抗
原比较结果表明所有毒株抗原性没有发生大的变化,
虽然不同毒株二级结构有一定的差异,但抗原表位预
测表明所有中国 TGEV分离株纤突蛋白 B细胞抗原
表位没有明显的差异。因此,中国 TGEV分离株虽然
来源比较复杂,但其抗原性非常相似,说明 TGEV在
中国没有发生明显的变异,这就为研制预防中国流行
的 TGE疫苗带来了希望。
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