全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究进展
杨恒 夏雪山 李盛陶 陈伟
(昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650224 )
摘 要: 猪传染性胃肠炎是由猪传染性胃肠炎病毒 ( TGEV )引起猪的一种高度接触性肠道疾病, 可导致仔猪发生严重
的呕吐、腹泻与脱水,死亡率可达 100%。口服疫苗是 TGEV基因工程疫苗研究的主要方向, 目前已在腺病毒、细菌、转基因植
物及 DNA疫苗中对 TGEV的 S基因进行了表达, 并对其口服免疫后的免疫原性进行研究。现针对 TGEV基因工程疫苗近年
来研究的概况进行综述,分析其优点与不足, 并对其未来的发展进行展望。
关键词: 猪传染性胃肠炎病毒 基因工程疫苗 口服免疫
Research Progress of Transm issible Gastroenteritis V irus ( TGEV)
Genetic Engineering Vaccine
YangH eng Xia Xueshan L iShengtao ChenW ei
(College of L ife Science and T echnology, Kunm ing University of Science and T echnology, Kunming 650224)
Abstrac:t Porc ine transm issib le gastroen teritis is a h ighly con tag ious, enteric disease o f sw ine caused by transm issib le gastroen
ter itis v irus ( TGEV ) . The d isease is espec ia lly severe in baby pigs less than two w eeks o ld, character ized by vom iting, severe d iarrhe
a, and near ly 100% m orta lity. New developm ents o f TGEV genetic eng ineer ing vacc ine have focused on production and de livery o f the
S pro te in through ora l imm un ization. A t present, seve ra l sy stem s such as adenovirus, bacte ria, transgen ic plant, and DNA vacc ine have
been used to express the TGEV S pro te ins. A fte r o ra l immuniza tion, the imm unogen ic ity o f these vacc ines has been studied. The re
search progress of TGEV genetic eng ineer ing vacc inew ere rev iew ed in this article, its advantage, d isadvantage and further deve lopm ent
w ere also prospec ted.
Key words: T ransm issib le g astroenteritis v irus Genetic eng ineer ing vaccine Ora l immunization
收稿日期: 20101008
基金项目:云南省自然科学基金项目 ( 2010ZC 058 )
作者简介:杨恒,男,博士,讲师,研究方向:动物传染病学与病毒分子生物学; Em ai:l yangheng2008. coo@l 163. com
猪传染性胃肠炎 ( transm issib le gastroenterit is of
sw ine, TGE)是由冠状病毒科 ( coronaviridae)冠状病
毒属 (Coronavirus)猪传染性胃肠炎病毒 ( transm issi
b le gastroenteritis v irus, TGEV )引起猪的一种高度接
触性肠道疾病。该病以呕吐、严重腹泻和失水为特
征,各种年龄和品种的猪均易感,尤其是两周龄以内
的仔猪感染后致死率可高达 100%, 该病是导致世
界各养猪国家仔猪早期死亡的重要疫病之一 [ 1 ]。
近年来,随着 TGEV流行危害的进一步加剧,我国各
地不断有从猪场分离出该病毒的报道 [ 2- 4]。每年冬
季和早春寒冷季节 TGEV常呈爆发性流行,给我国
养猪业造成了严重的经济损失。在 国际动物卫生
法典中,猪传染性胃肠炎被列入 B类传染病, 是我
国法定重点防控的疫病之一。
1 猪传染性胃肠炎病毒的致病机理
TGEV无论通过口腔还是鼻腔途径感染, 病毒
都被吞咽入消化道。在消化道中 TGEV能抵抗低
pH和蛋白酶水解而保持活性, 直至与高度易感的小
肠上皮细胞接触。病毒通过分布于小肠上皮细胞表
面的氨基肽酶 N ( porcine am inopeptidase N, pAPN ) [ 5]
和大小约 200 kD的黏蛋白型糖蛋白 ( mucintype
g lycoprotein, MGP)两种受体 [ 6] , 特异性侵入小肠绒
毛上皮细胞并在其中大量增殖, 导致上皮细胞死亡
并大量脱落,小肠绒毛显著萎缩。由于小肠内的酶
活性明显降低,扰乱机体正常的消化和肠上皮细胞
对营养物质与电解质的运输, 引起急性吸收不良综
2011年第 2期 杨恒等 :猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究进展
合症。同时,对于新生仔猪而言,小肠黏膜上皮细胞
的损害,导致产生乳糖酶的酶类机制受阻,妨碍了糖
类的分解吸收,肠管内的渗透压增高,导致液体的滞
留,甚至从机体组织中吸收液体, 引起病猪失水、代
谢性酸中毒,发生腹泻和脱水。最后,仔猪由于脱水
和代谢性酸中毒以及由于高血钾而引起的心、肾功
能衰竭导致死亡。
2 TGEV的免疫保护机制及目前主要防控
措施
TGEV感染后康复猪的攻毒试验表明, 肠道黏
膜局部免疫应答,尤其是针对 TGEV的 sIgA抗体可
有效中和病毒从而阻止病毒对小肠绒毛上皮细胞的
感染。虽然仔猪在出生后即具备产生黏膜抗体免疫
应答的能力,但需较长时间才能达到成年猪抗体免
疫应答的产生水平。因此, 试图通过给仔猪疫苗接
种,使其在出生后关键的头几天快速产生抗 TGEV
感染的主动免疫应答希望不大 [ 7 ]。被动免疫在保
护新生仔猪免受 TGEV感染中起着至关重要的作
用,特别是母猪乳汁中的 sIgA抗体可有效抵抗胃肠
道中蛋白酶水解,在抗 TGEV感染中起着关键作用。
妊娠母猪乳腺中产生 sIgA抗体的浆细胞来源于肠
道相关淋巴组织 ( GALT ) ,它被肠道中的抗原物质
激活后进一步移行至乳腺定植, 并将 IgA抗体分泌
至初乳和常乳中 [ 8, 9]。因此, 通过 肠 - 乳腺免疫
轴的激活,激发母猪乳汁中 sIgA抗体产生,是保护
仔猪免受 TGEV感染的一个主要途径。
目前对 TGEV感染尚无有效的治疗药物,疫苗
接种仍然是该病的主要防控措施。在生产中使用最
为广泛的疫苗为 TGEV弱毒苗, 在免疫方式上主要
采取怀孕母猪的肌肉注射和口服免疫。肌肉注射虽
可有效激发怀孕母猪血清中 IgG抗体的产生,但由
于无法激活 GALT, 因此不能有效激发母猪乳汁中
sIgA抗体的产生,往往不能给仔猪提供有效的免疫
保护。怀孕母猪口服弱毒疫苗免疫似乎是激发
GALT的一个合理的方式, 但效果尚不理想。其主
要原因在于致弱后的病毒在小肠只能进行极为有限
的增殖,导致对 GALT中产生 sIgA抗体的浆细胞的
抗原刺激较少,相应乳汁中 IgA抗体分泌也较少 [ 1 ]。
此外, 在使用弱毒疫苗时, 另一个值得注意的问题是
弱毒疫苗存在毒力返强和散毒的潜在危险。基于上
述问题,进一步研究简便、安全、能有效激活 GALT
的 TGEV基因工程疫苗仍然十分必要。
3 猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究
TGEV可编码 3种主要结构蛋白: 纤突蛋白 ( S
蛋白 )、膜内在 (M )蛋白和核衣壳 ( N )蛋白。 S蛋白
为高度糖基化蛋白,突出于病毒粒子囊膜表面,其上
含有宿主细胞氨肽酶 N( pAPN)的识别位点, 在病毒
感染、发挥致病性和决定宿主细胞亲嗜性等方面起
关键作用 [ 10- 13 ]。S蛋白的 N端包含了 A、B、C和 D
4个主要的 B淋巴细胞抗原决定位点, 是诱导机体
产生 TGEV中和抗体的主要区域 [ 14, 15]。研究表明,
S蛋白 N端可激发与全长 S蛋白相当的中和抗体的
产生 [ 16]。在 TGEV的 3个主要结构蛋白中, S蛋白
是唯一能诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的
结构蛋白, 因此 S基因成为 TGEV基因工程疫苗研
究的首选抗原基因。同时, 为有效激发肠道黏膜免
疫应答,口服疫苗成为 TGEV基因工程疫苗研究的
重点。因此,目前已在多种不同的载体系统中对全
长或截短的 S蛋白进行了表达, 并对其口服免疫后
的免疫原性进行了研究。
3. 1 以病毒为载体表达 S蛋白
腺病毒易于培养纯化,病毒产量高,在腺病毒基
因组中特定区域内插入外源 DNA, 不影响病毒增
殖,而且还能使外源基因良好表达。口服重组腺病
毒后,可诱导较强的系统免疫反应与局部的黏膜免
疫应答。因此,腺病毒较早作为 TGEV口服基因工
程疫苗的活载体。 To rress等 [ 17, 18] 用人腺病毒 5
( AD5)为载体,构建了系列表达 S基因不同片段的
重组腺病毒,将表达 A - D 4个主要抗原位点的重
组腺病毒通过口鼻和腹膜途径接种猪,可诱发猪血
清中 TGEV中和抗体的产生。将免疫后的猪血清与
致死剂量的 TGEV混合后口服接种乳猪, 可被动地
减少仔猪的腹泻和死亡,但不能抵抗 TGEV的感染。
这说明重组腺病毒口鼻和腹膜途径接种猪后产生的
抗体效价不高,不能完全中和病毒。由于采用人腺
病毒作为动物病毒载体存在安全问题, 因此 Tuboly
等 [ 19]采用猪腺病毒 ( PAdV5)分别构建了表达全长
S基因和 S基因 5端约 2. 2 kb的重组猪腺病毒, 从
中筛选出 3个重组腺病毒经口接种易感猪。结果表
明, 重组腺病毒同时诱发了针对 TGEV和 PAdV5
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
的特异性血清 IgG抗体,且在免疫猪的小肠和肺脏
中检测到 TGEV分泌型 IgA抗体, 但用 TGEV对接
种猪进行攻毒,其结果如何有待进一步研究。
3. 2 以细菌为载体表达 S蛋白
随着以肠道细菌为活载体传递抗原进而激发肠
道粘膜免疫这一技术路线的提出, 研究者也试图在
肠道菌中表达 TGEV的 S蛋白, 进行重组活菌的口
服免疫。目前研究主要集中在减毒沙门氏菌、乳酸
杆菌等肠道菌上。与活病毒载体疫苗相比, 其优势
在于细菌培养操作简单, 成本低廉。 Smerdou等 [ 20]
将编码 TGEV S蛋白氨基端、羧基端、中间段以及全
长 S蛋白的 4个基因片段分别插入原核表达质粒
pYA292( asd+ )中,转化入减毒鼠伤寒沙门氏菌 3987
( asd、cya和 crp)中进行表达。结果表明, 编码 S
蛋白氨基端与全长 S蛋白的基因片段能在沙门氏菌
中稳定表达,且两种重组菌在体外连续繁殖 50代后
仍有 60%和 20%的重组菌能持续表达 S蛋白氨基
端与全长 S蛋白。将表达 S蛋白氨基端的重组沙门
氏菌口服免疫猪后, 细菌在空肠中定植的时间长达
10- 20 d, 在猪的血液和唾液中均检测到 TGEV特
异抗体。Smerdou等 [ 21]还将不同拷贝数的 S蛋白 D
抗原位点与大肠杆菌热不稳定 B毒素亚基在减毒
鼠伤寒沙门氏菌 3987中进行了融合表达, 将重组
菌口服免疫家兔后可诱导血清中 TGEV IgG抗体和
肠道黏膜中 TGEV sIgA抗体的产生,但在小肠中 sI
gA抗体滴度较低。除在沙门氏菌的胞质中进行
TGEV S蛋白的表达外, 研究者也在沙门氏菌的菌
毛上对 S蛋白的抗原位点进行表达 [ 22, 23 ]。其优势
在于表达的抗原蛋白直接位于细菌的表面, 能更好
地刺激免疫应答。但由于是将抗原位点嵌合在菌毛
中表达,因此只能表达很短的一段抗原肽,这极大地
限制了特性抗体应答的强度。Ho等 [ 24]在乳酸杆菌
中成功进行了 TGEV S蛋白 N端约 75 kD的重组蛋
白的分泌表达。将重组菌口服免疫小鼠后, 可检测
到接种的小鼠产生了针对 TGEV的特异性血清 IgG
和 IgA, 诱导的抗体具有一定的 TGEV中和活性。
唐丽杰等 [ 25]也报道,将表达 TGEV S蛋白的重组乳
酸乳球菌口服免疫可激发肠道黏膜产生抗 TGEV IgA
抗体。
3. 3 转基因植物表达 S蛋白
近年来,植物基因工程技术的迅速发展,将病原
微生物的抗原基因在农作物中进行表达,研制可食
疫苗成为当前植物基因工程研究的一个重要方向。
在转基因农作物中表达抗原蛋白进行口服免疫具
有成本低廉、免疫途径简单, 疫苗存储无需冷藏设
备,可大范围给药等优点 [ 26]。 Gomez等 [ 27 ]将分别
编码 TGEV S蛋白氨基端与完整 S蛋白的基因片
段与花椰菜花叶病毒的 CaMV 35S启动子组成表
达盒, 通过基因重组将表达盒整合入拟南芥植物
基因组中。结果表明, 整合入植物基因组中的 S
蛋白得以表达。从转基因拟南芥叶子中提取的重
组蛋白免疫小鼠后可激发血清中 TGEV抗体的产
生,且抗体具有一定的中和活性。 Gomez等 [ 28]又
在转基因马铃薯表达了 TGEV S蛋白的氨基端区
域 ( NgS) ,将从马铃薯块茎中提取出的重组 N gS
蛋白通过腹膜内途经免疫小鼠, 接种的小鼠产生
了针对 TGEV的特异性血清 IgG, 而且用表达 N gS
的马铃薯块茎直接饲喂小鼠时, 小鼠也产生了针
对 S糖蛋白特异性血清抗体。Lamphear等 [ 29, 30]构
建了表达 S基因的转基因玉米, 用该转基因玉米
种籽饲喂母猪, 母猪血清、初乳和常乳中均检测到
TGEV抗体的产生。
3. 4 S基因 DNA疫苗研究
DNA疫苗免疫后能有效激发细胞免疫与体液
免疫,具有安全可靠、便于多价苗和多联苗研制、制
备工艺简单及存储运输方便等优点, 已广泛应用于
多种疫病的疫苗研究中, 并取得良好的试验效
果 [ 31]。目前,对于 TGEV S基因的 DNA疫苗, 已进
行了初步的研究。任晓峰等 [ 32 ]以真核表达质粒 pC I
为载体, 构建了含 S基因主要抗原位点的 DNA疫
苗, 肌肉注射免疫小鼠后可诱导小鼠血清中特异性
TGEV IgG抗体的产生,显示了良好的免疫原性。近
年来,以减毒细菌为载体携带 DNA疫苗进行口服免
疫被证实是激发黏膜免疫的一种理想途径 [ 33]。本
研究构建了含 S基因主要抗原位点的真核表达质粒
pVAXS,进一步将其转化入减毒沙门氏菌 SL7207
中, 构建了携带 TGEV S基因 DNA疫苗的重组沙门
氏菌 SL7207( pVAXS)。将重组沙门氏菌口服免疫
小鼠后,结果表明, 除可有效激发免疫小鼠血清中特
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2011年第 2期 杨恒等 :猪传染性胃肠炎病毒基因工程疫苗研究进展
异性 TGEV IgG抗体的产生, 也可有效激发免疫小
鼠肠道中 sIgA抗体的产生 [ 34]。
4 问题与展望
尽管目前在 TGEV基因工程疫苗研究上取得了
可喜的成果,但上述几种形式的 TGEV基因工程仍
存在一些不足。以腺病毒作为载体, 一方面其外源
基因容量较小难以克隆大片段或多个外源基因的表
达;另一方面由于表达蛋白大小受限,导致机体免疫
系统对腺病毒大蛋白的强烈应答, 可能消弱外源蛋
白诱导的免疫应答反应 [ 35]。在肠道细菌中表达抗
原蛋白其缺陷在于细菌中表达的抗原蛋白无法进行
正确的翻译后修饰与糖基化,这极大地影响表达蛋
白的免疫原性;同时,重组细菌在体内存活时间,蛋
白在细菌中的表达量、稳定性等问题也仍需进一步
研究与完善 [ 36 ]。转基因植物疫苗目前尚待解决的
问题主要有两个:一是转基因植物中抗原蛋白表达
量普遍较低,限制了食入转基因植物后激发的免疫
应答强度;二是转基因植物中的抗原蛋白在通过胃
肠道时容易受到降解而丧失其免疫原性 [ 26]。以减
毒沙门氏菌携带 DNA疫苗口服免疫, 存在免疫后机
体内细菌携带的高拷贝质粒迅速丢失的情况, 同时
针对沙门氏菌载体的免疫应答将消弱其传递的
DNA疫苗免疫效果 [ 37, 38 ]。综上, 在 TGEV口服基因
工程疫苗的研究中, 目前选用的载体系统各有优缺
点,但尚没有合适的载体系统能同时满足以下 3点:
( 1) S蛋白能大量的表达; ( 2)表达的 S蛋白能有效
进行翻译后修饰、折叠; ( 3)有效避开胃肠道对表达
的 S蛋白的消化降解。
冠状病毒是自然界最大的单股正链 RNA病毒,
对 TGEV全长 cDNA克隆的拯救成功, 是 RNA病毒
反向遗传研究的一个重要突破。A lmazan等 [ 39]在
TGEV的感染性 cDNA克隆的基础上进行了基因置
换, 将来源于呼吸道嗜性的弱毒株基因组全长 cD
NA克隆中的 S基因替换为具有肠嗜性强毒株的 S
基因,结果所拯救的病毒是具有肠嗜性的强毒株,
这表明可通过反向遗传技术来改变 TGEV的组织
嗜性和毒力。 Izeta等 [ 40]将创造一个来自 TGEV和
呼吸道毒株嵌合的病毒用于表达 S蛋白, 如果能
把它充分致弱,这种嵌合病毒有望成为候选 TGEV
疫苗。
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