全 文 ：研究报告
Letter
接骨木花色苷组成及抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)活性分析
雷用东 1，2 王丹 1 童军茂 2 马越 1 张莉 1 赵晓燕 1*
1北京市农林科学院蔬菜研究中心、农业部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室、农业部都市农业(北方)重点实验室，北京
100097；2石河子大学食品学院，石河子 832003
*通讯作者，xiaoyanzhao001@163.com
摘 要 猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)能够导致猪传染性胃肠炎疾病，
致大批猪死亡。本研究探讨了接骨木(Sambucus williamsii Hance)花色苷对猪传染性胃肠炎病毒的体外
抑制作用。采用脱机检测(LC-MS)的方法分析鉴定接骨木花色苷的结构成分；以接骨木花色苷处理不
同时间侵染TGEV的猪睾丸(ST)贴壁细胞，采用 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐法(简称
MTT法)与显微镜观察法检测ST细胞的存活率及形态学变化，研究接骨木花色苷对TGEV的预防和治
疗效果。结果表明，接骨木花色苷提取物中主要含6种花色苷，其中主要为矢车菊色素-3-葡萄糖苷。接
骨木花色苷处理 ST细胞，当质量浓度低于 50 μg/mL时，ST细胞生长良好，无细胞毒性；ST细胞接种
TGEV后，10 μg/mL的花色苷处理就能抑制TGEV的增殖，且抑制程度在安全浓度范围内成剂量反应关
系。在细胞培养条件下，接骨木花色苷对TGEV的预防作用比治疗作用较好。本研究鉴定了接骨木中
至少存在6种花色苷组分，50 μg/mL的接骨木花色苷抗TGEV的活性最大，将为开发新型植物源抗病毒
剂提供理论依据。
关键词 接骨木，花色苷，猪睾丸细胞，猪传染性胃肠炎病毒，MTT法
The Anthocyanin Profiles from Sambucus williamsii Hance and Analysis
of Its Anti-Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) Activity
LEI Yong-Dong1,2 WANG Dan1 TONG Jun-Mao2 MA Yue1 ZHANG Li1 ZHAO Xiao-Yan1*
1 Beijing Vegetable Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science, Key Laboratory of Biology and Genetic
Improvement of Horticultural Crops (North China), Ministry of Agriculture, Key Laboratory of Urban Agriculture (North), Ministry of
Agriculture, Beijing 100097, China; 2 College of Food, Shihezi University, Shihezi 832003, China
* Corresponding author, xiaoyanzhao001@163.com
Abstract Transmissible gastroenteritis virus (TGEV) can make the pig infectious gastroenteritis disease, and
lead to death of large numbers of the pigs(Sus scrofa). Our study investigated that the inhibitory activities of
anthocyanins from Sambucus williamsii Hance to TGEV in vitro. Anthocyanins structure of S. williamsii Hance
was identified by LC- MS. Prevention and treatment roles of anthocyanins in the TGEV- infected different
phase were studied, 3- (4,5- dimethylthiazol- 2- yl)- 2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) and inverted
microscope assay were used to observe the swine testicular (ST) cell survival rate and cell morphological
changes. The results showed that S. williamsii Hance contained six major anthocyanins, and one of the main
基金项目：国家自然科学基金资助项目(No. 30972048)和北京市自然科学基金(No. 6111001)
收稿日期：2013-05-13 接受日期：2013-05-30
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2013, 21(10):1185~1192
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2013.10.007
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
接骨木 (Sambucus williamsii Hance)为忍冬科
(Caprifoliaceae)接骨木属(Sambucus linn)植物，该属
为珍贵的药用植物，英国植物药典、芬兰法定植物
药名录和法国规定用于临床的植物药名录均收载
了接骨木属植物(Xiao et al., 2011)。野生接骨木是
我国东北地区的乡土树种，几乎遍及吉林省各个地
区，该属植物所含的化学成分复杂，具有多种生物
活性物质(杨红梅，2006)。近年来，国内外学者从
不同角度对其药理作用、生物活性及临床方面作了
较为深入的研究，也发现了一些新的作用，如抗炎
症 (董培良等，2008)和抗菌活性 (Bomi et al.,
2011)。接骨木富含花色苷，花色苷属于生物类黄
酮，具有抗氧化 (Lachman et al., 2009)、抗肿瘤
(Zhang et al., 2009)、降血脂(张名位等, 2006)、抗病
毒(Bedoya et al., 2001)等多重生物活性功能。目
前 ，猪 传 染 性 胃 肠 炎 病 毒 (Transmissible
gastroenteritis virus, TGEV)能够导致猪传染性胃肠
炎疾病，致大批猪死亡，尤其在仔猪感染该病毒后
其死亡率达 100%，带来巨大的经济损失 (Ren et
al., 2008)。
前期实验本课题组已经确定了紫甘薯花色苷
在 20~60 μg/mL质量浓度范围内对 TGEV有很好
的抗病毒功效(雷用东等, 2012)，然而不同结构花
色苷具有不同的功能性，那么接骨木属植物的花色
苷成分是否也具有抑制 TGEV的作用还未见报
道。本研究拟鉴定接骨木花色苷的组成且研究其
是否具有抗TGEV作用，为开发新型植物源抗病毒
剂提供理论依据。
1结果与分析
1.1 接骨木花色苷的HPLC-MS成分分析
通过反相高压液相色谱分离，接骨木花色苷抽
提物可被检出不同色素峰组分。图 1为接骨木花
色苷的 HPLC色谱图，结果显示，接骨木主要有 6
个峰，根据其保留时间，结合质谱碎片离子信息，鉴
定了 6种主要花色苷的组成。接骨木花色苷的主
要组成见表1，主要是咖啡酰基化或未酰基化的矢
车菊色素。
1.2 接骨木花色苷对ST单层细胞的毒性研究
细胞毒性，是考察花色苷对ST单层细胞生长
无影响的最大安全浓度，本研究设定不同浓度的花
色苷处理 ST单层细胞 96 h，测定OD490值，间接说
明ST的生长情况。从图 2可知，花色苷与ST细胞
作用 96 h后，浓度 10~50 μg/mL，均对ST细胞的生
长无影响。但是，当浓度高于50 μg/mL时，OD490值
逐渐降低，对细胞生长有毒性作用，提示 60 μg/mL
的花色苷是对ST细胞单层细胞的最大安全浓度。
1.3 接骨木花色苷体外抑制TGEV活性
通过花色苷对ST单层细胞毒性的实验(图2)，
结果表明 50 μg/mL花色苷对 ST无细胞毒性作用
的剂量，因此实验在安全浓度范围内研究其抗
TGEV的活性。在预先加入花色苷培养 2 h后，再
接种TGEV培养2 h的预防作用实验结果见图3，以
ST细胞为参照，培养 48 h，TGEV病毒对照组的细
胞存活率仅为 23.57%，当加入 10 μg/mL的接骨木
花色苷进行处理时，细胞存活率为53.78%，细胞存
活率随着浓度增加而逐渐上升，抑制TGEV效果也
增强，呈剂效关系，尤其在 50 μg/mL时，细胞的存
活率提高至 87.10%。可见花色苷对TGEV具有明
显的预防作用。
治疗作用与预防作用趋势大体一致，随着花
色苷添加浓度增加，治疗TGEV效果增强，花色苷
在 5 个浓度下的细胞存活率分别为 38.03%、
component was cyanidin-3-glucoside. ST cell was well-grown without the cytotoxic response when treated
with anthocyanins lower than 50 μg/mL. Anthocyanins could restrain the proliferation of TGEV under 10 μg/
mL, and the inhibition effect showed as dose- dependent manner in the safe concentration. In cell culture
condition, the prevention was better than treatment effects about anthocyanins anti-TGEV. In short, this paper
identified that there were at least six kinds of anthocyanins component of Sambucus williamsii Hance, and the
best activity of anthocyanins against TGEV was about 50 μg/mL, and this will provide theoretical basis for the
development of the new plant source of antivirals medicine.
Keywords Sambucus williamsii Hance, Anthocyanin, Swine testicular(ST) cell, Transmissible gastroenteritis
virus(TGEV), MTT
1186
1
23 4 5
6
吸
光
度
单
位
/A
A
bs
or
ba
nc
e
un
it
s
保留时间/min
Retention time
0
10
20
30
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
40.49%、48.03%、59.24%和 72.03%，与 TGEV对照
组的细胞存活率 21.15%比较，花色苷处理组的细
胞存活率高出20%~50%。显示花色苷对TGEV具
有治疗作用，并且治疗作用与质量浓度呈剂效关
系，差异显著。
由图 4可知，培养 72 h，以正常 ST细胞作对
比，TGEV病毒对照组的 ST细胞存活率仅为
0.69%，说明此时ST细胞已基本上脱落死亡。预防
作用试验中，花色苷 5个浓度处理TGEV的细胞存
活率分别为 16.1%、18.44%、20.51%、25.98%和
32.21%，细胞存活率随浓度上升而升高，呈剂效关
系，差异显著。与 48 h的预防效果比较，细胞的存
活率明显降低，说明大部分细胞脱落死亡。同样，
治疗效果趋势与预防效果一致，5个浓度处理
TGEV 的细胞存活率分别为 8.12%、10.22%、
13.51%、16.49%和 19.99%，具有显著差异性。同
时，治疗效果的细胞存活率明显低于预防效果。
1.4 接骨木花色苷与TGEV对ST细胞形态学的影响
倒置显微镜观察结果，如表 2所示，ST细胞在
96 h内，细胞形态完整；接入TGEV后，在24 h开始
发生病变，病毒快速繁殖期为 36~48 h，表现为 ST
脱离单层。采用TGEV感染ST单层细胞2 h后，再
加入不同浓度花色苷处理后，ST细胞脱落时间延
长至72 h，其中 50 μg/mL花色苷的处理，在96 h仍
图1接骨木主要花色苷的520 nm色谱图
Figure 1 The profiles of major anthocyanins from Sambu⁃
cus williamsii Hance at 520 nm
表1接骨木中主要花色苷组分
Table 1 The major anthocyanin components of Sambucus williamsii Hance
峰号
Peak number
1
2
3
4
5
6
保留时间/min
Retention time
3.7
4.2
4.3
4.8
5.0
5.3
分子离子/m·z-1
Major ions
773
611
773
581
611
449
二级质谱碎片离子/m·z-1
Secondary mass spectrum
fragmentions
611449287
449287
287
287
449287
287
结构
Composition
矢车菊素-3-(6′′-咖啡酰葡萄糖苷)-5-葡萄糖苷
Cyanidin-3-(6′′- caffeoyl glucoside)-5-glucoside
矢车菊素-3-半乳糖苷-5-葡萄糖苷
Cyanidin-3-galactoside-5-glucoside
矢车菊素-3-咖啡酰槐糖苷
Cyanidin-3-caffeoyl sophoroside
矢车菊素-3-咖啡酰阿拉伯糖苷
Cyanidin-3-caffeoyl arabinoside
矢车菊素-3-半乳糖苷-5-葡萄糖苷
Cyanidin-3-galactoside-5-glucoside
矢车菊素-3-葡萄糖苷
Cyanidin-3-glucoside
接骨木花色苷组成及抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)活性分析
The Anthocyanin Profiles from Sambucus williamsii Hance and Analysis of Its Anti-TGEV Activity
a
b
c
0 10 20 30 40 50 60 70
0.42
0.48
0.54
0.60
0.66
0.72
0.78
OD
49
0
花色苷浓度/μg·mL-1
Concentration of anthocyanin
a a
a a a
图 2接骨木花色苷对ST细胞的毒性实验结果(X—±SD)
Figure 2 The result of anthocyanin on cytotoxicity test for
ST cell(X—±SD)
n=6；柱状图上标有不同字母表示数据间存在 5%的显著水
平性差异(P＜0.05)。下同
n=6; The bar graph with different letters indicate significant
difference at 5% (P＜0.05). The same below
1187
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
花色苷浓度/μg·mL-1
Concentration of anthocyanin
预防作用 Preventive effect
治疗作用Therapeutic effect
a a
f f
e
e
d
e
c
d
bc
c
b
b
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
10 20 30 40 50
M
T
T
法
测
定
S
T
细
胞
的
存
活
率
/%
T
he
su
rv
iv
al
ra
te
of
S
T
ce
ll
by
M
T
T
ST CK TGEV CK
花色苷浓度/μg·mL-1
Concentration of anthocyanin
预防作用 Preventive effect
治疗作用Therapeutic effect
ST CK TGEV CK 10 20 30 40 50
M
T
T
法
测
定
S
T
细
胞
的
存
活
率
/%
T
he
su
rv
iv
al
ra
te
of
S
T
ce
ll
by
M
T
T a a
f
f
e
e
d
g
c
d
g
c
b
b
105
100
95
35
30
20
10
0
5
15
25
图4 72 h时不同浓度接骨木花色苷体外抑制TGEV的作用
Figure4 Inhibition for TGEV under different concentra⁃
tion of anthocyanin in vitro at 72 h
有少量细胞未脱离单层。进一步采用显微镜观察
其形态学变化(图5)显示：ST生长至48 h时，正常的
ST细胞贴壁后(图5A)，多为多角形或短梭形，呈铺
路石状，大小均匀；TGEV病毒侵染ST细胞48 h后
(图 5B)，大部分 ST细胞脱离单层，无正常细胞形
态，发生严重的病变；10和 50 μg/mL花色苷处理
ST细胞后(图 5C和 E)，ST细胞大小均一，单层表
面形态完整，细胞折光性良好，无破碎死亡；花色
苷 10 μg/mL治疗处理(图 5D)，图片显示部分细胞
脱离单层，部分细胞变圆、膨胀，细胞数也明显较
稀疏；而花色苷浓度 50 μg/mL治疗效果(图 5F)显
示，细胞数目明显增加，细胞肿胀，形态较为完整，
与病毒对照组相比较，花色苷能明显抑制 TGEV
的增殖。
2讨论
2.1 接骨木花色苷组分的种类分析
目前，关于报道接骨木花色苷结构的鉴定方
面，还比较少。本研究采用HPLC-MS联检方法，鉴
定出6种主要的花色苷，基本上是以矢车菊色素为
图3 48 h时不同浓度接骨木花色苷体外抑制TGEV的作用
Figure3 Inhibition for TGEV under different concentra⁃
tion of anthocyanin in vitro at 48 h
不同正体字母表示预防作用显著差异(P＜0.05)，不同斜体
字母表示治疗作用显著差异(P＜0.05)。下同
There were significant differences in different upright letters
as prevention effect (P＜0.05) and different italics as thera-
peutical effect (P＜0.05). The same below
表2不同浓度花色苷对感染TGEV的ST细胞的形态学观察结果
Table 2 The morphology of ST cells infected by TGEV under different concentration of anthocyanin
浓度/μg· mL-1
Concentration
细胞对照 Cell control
病毒对照 Virus control
10
20
30
40
50
12 h
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
+++++
24 h
+++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
36 h
+++++
+++
++++
++++
++++
++++
++++
48 h
+++++
+
+++
+++
+++
+++
++++
60 h
+++++
-
+
++
++
++
+++
72 h
++++
-
+
+
+
+
++
96 h
++++
-
-
-
-
-
+
+++++：细胞生长最好，细胞呈长圆形，形成完整单层；++++：细胞生长良好，形成单层，基本无空隙；+++：细胞生长一般，细
胞有间隙，有极少圆细胞；++：细胞生长较差，细胞间有大量空隙，有较多圆细胞；+：细胞生长很差，基本为圆细胞，极少部
分细胞贴壁；-：细胞生长极差，全部细胞已破碎，细胞死亡。
+++++: The cell grow best, show oblong, and form a complete monolayer; ++++ : The cell grow good, form monolayer, and
there is almost no gap; +++: The cell grow commonly, own cell gap, and there is a little round cells; ++: The cell grow poorly,
own a lot of cell gaps, and there is more round cell; +: The cell grow worse, and there is almost the round cells with few adherent
cells; - : The cell growth badly, and all cells have broken and death
1188
基本结构单元，再连结不同的糖苷和咖啡酰基化结
构所构成的 6种组成。其中矢车菊色素-3-葡萄糖
苷使其主要组成成分，也是构成接骨木紫色成分的
主要活性物质。近年来，许多学者研究证明矢车菊
色素-3-葡萄糖苷具体抗氧化、抗肿瘤(陈亮等，
2012)等多种活性功能，因此，接骨木花色苷功效组
成的鉴定为探讨花色苷抗病毒功效提供理论基础。
2.2 接骨木花色苷对ST细胞毒性的效果
本研究采用体外试验方法，首先考察花色苷对
ST的细胞毒性作用，当 花色苷浓度为 10~30 µg/
mL时，ST存活情况比对照组较好，但差异不显著；
当花色苷浓度超过50 µg/mL时，ST细胞存活率显
著下降。花色苷是优良的天然抗氧化剂，Ahmad等
(2012)研究证实，花色苷有抗氧化性，能提高老鼠
学习记忆能力；张名位等(2005)研究发现花色苷具
体抗氧化作用，推测花色苷对细胞免疫系统具有调
节作用，因此一定浓度范围内可能提高了ST细胞
机能，从而促进其生长，但浓度太高可能对细胞生
长产生毒理作用，揭示其安全浓度是研究其抑制
TGEV功能的先提条件。
2.3 接骨木花色苷对TGEV预防和治疗作用
MTT分析法是通过检测其光密度值(OD490)的
改变以判断活细胞的经典方法，运用此方法研究花
色苷对ST细胞的毒性作用以及抗病毒活性的定量
分析。本研究结果表明，花色苷活性成分在对正常
细胞系 ST无毒性的情况下，加入TGEV病毒诱导
后，随着花色苷浓度含量升高，ST存活数也显著增
加，这说明了花色苷对TGEV繁殖有明显的抑制作
用。陶欣艺(2005)等研究表明，欧洲越桔和笃斯越
桔对神经细胞氧化损伤有保护作用。花色苷可能
通过提高机体抗氧化酶类活性，降低自由基水平，
从而起到减慢ST受TGEV入侵的作用。
本研究结果显示，不同浓度的花色苷预先与
ST作用后，再接入TGEV病毒，其细胞存活率相对
预先接入病毒后再接入花色苷均有上升趋势(图 3
和4)，表明花色苷对TGEV的预防作用比治疗作用
明显。在治疗作用和预防作用上，72 h后，花色苷
抑制TGEV病毒诱导的细胞凋亡的能力均显著低
于 48 h的效果，主要有以下两方面原因：一方面
TGEV为急性传染病毒，其繁殖快、传播迅速、毒价
高(Smerdou et al., 1996)等病毒特点使得细胞易于
病变；另一方面随着细胞培养时间的延长，同时在
花色苷与TGEV相互作用过程中，细胞培养液的酸
碱度、氧气等条件的变化，会使花色苷结构稳定性
降低，花色苷发生一系列降解作用(Fan et al., 2008;
Cevallos-Casals et al., 2004)，花色苷组分发生变化，
可能导致抑制TGEV活性能力逐渐减弱。可见，体
外实验中，花色苷抑制病毒繁殖，应提早加入适量
的花色苷，以增强细胞抵抗病毒的能力，延长细胞
的存活时间。
接骨木花色苷组成及抗猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)活性分析
The Anthocyanin Profiles from Sambucus williamsii Hance and Analysis of Its Anti-TGEV Activity
图5花色苷处理ST细胞48 h时形态
Figure 5 The microscope image of effect of anthocyanins on
ST morphology at 48 h
A：ST细胞，细胞呈多角形或矮梭形，大小均匀；B：ST+
TGEV对照，无正常细胞形态，细胞发生病变；C：ST+花色苷
10 µg/mL，细胞大小均一，折光性良好，无破碎死亡；D：ST+
TGEV+花色苷10 µg/mL，部分细胞变圆、膨胀，细胞稀疏；E：
ST+花色苷50 µg/mL，细胞大小均一，折光性良好，无破碎死
亡；F：ST+TGEV+花色苷50 µg/mL
A: ST cells are polygonal or short spindle with uniform size;
B: The control of ST cell and TGEV shows that there is no
normal cell morphology and cell lesions; C: ST cells own
uniform size, refraction sex good, without broken within 10
µg/mL anthocyanins; D: ST cell and TGEV within 10 µg/mL
anthocyanins show that some cells become round, swell and
sparse; E: ST cells own uniform size, refraction sex good,
without broken within 50 µg/mL anthocyanins; F: ST+TGEV+
anthocyanins 50 µg/mL
1189
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
3材料与方法
3.1实验试剂及仪器
试剂：接骨木(Sambucus williamsii Hance)花色
苷粉由北京绿色金可生物技术股份有限公司提供，
猪 (Sus scrofa)睾丸 ST 贴壁细胞 (swine testicular
cell)、已经测定 TCID50的猪传染性胃肠炎病毒
(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)由北京市
农林科学院畜牧所提供；胰蛋白酶由美国BD公司
提供；胎牛血清(FBS)、MEM培养基由美国Hyclone
公司提供；3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑
溴盐 (MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)由美国Sigma公
司提供；分析所用的其它化学试剂均为国产分析纯。
仪器：HPLC 1200-MS 6310液质联用仪，美国
Agilent公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏州安泰空
气技术有限公司；倒置显微镜，重庆奥特光学公司；
二氧化碳水套式培养箱，美国Thermo公司；CYT-
100细胞自动计数分析仪，日本CYTORECON公司。
3.2接骨木花色苷的主要成分分析
进样样品制备：将花色苷粉用0.01 mol/L磷酸
盐缓冲液稀释成母液，样品母液的质量浓度为 1
mg/mL，0.22 μm滤膜过滤备用。
HPLC实验参数：采用反相色谱柱Zorbax SB-
AQ C18(100 mm× 3.0 mm, 1.8 µm, Agilent公司)；
流动相：A相为 5%甲酸水溶液，B相为 100%乙腈。
进行梯度洗脱：0 min(13%B)，8 min(22%B)，15 min
(23% B)，20 min(100% B)，25 min(100% B)，26 min
(13%B)，33 min(停止)。流速：0.3 mL/min；柱温：
25℃；进样量：5 μL；检测波长：520 nm。
MS实验参数：采用安捷伦公司生产的6310离
子阱质谱仪，设置为正离子模式，电场强度 3 500
V，离子扫描范围为 100~1 000 m/z；干燥气温度为
350℃；N2流速为 12 L/min；喷雾器压力为 310.26
kPa。数据使用Agilent ChemStation Rev. A. 09.01
Software统计分析。
3.3 ST细胞培养与TGEV病毒繁殖
按文献的方法(程宝鸾, 2006; Ren et al., 2011)，
从液氮中取出 ST细胞，置于 20% FBS的MEM培
养液在 5% CO2、37℃培养箱复苏；待长成单层，弃
液，胰蛋白酶消化，加入 10% FBS的MEM生长液
进行传代培养。在无菌条件下，移取细胞悬液 5
mL于 25 mm2细胞培养瓶中，置于 5% CO2、37℃培
养箱培养，长成单层细胞后，弃液，按每瓶体积的
10%量加入病毒液500 μL，置于37℃、5% CO2培养
箱孵育2 h，向瓶中加入花色苷使其终浓度为10和
50 μg/mL，用细胞维持液(含 2% FBS的MEM培养
基)补至 5 mL。置于 5% CO2培养箱 37℃继续培养
2 d，反复冻融 3次后备用。同时，设置正常细胞和
病毒对照。
3.4接骨木花色苷对ST细胞毒性作用实验
移取 ST细胞浓度大小为 1~5×105 cells/mL的
200 μL于96孔细胞培养板中，置于培养箱中，待细
胞铺满成单层约80%，弃液。随后用无菌磷酸盐缓
冲液缓慢洗一次，再用MEM维持液来调花色苷浓
度为10、20、30、40、50、60和70 μg/mL，每个孔的总
体积为200 μL，于培养箱中继续培养，培养至96 h，
采用MTT法测定光密度(OD)值。简单步骤如下：
首先对孔板弃液，其次向每孔加入15 μL MTT溶液
(MTT为 5 g/L)，置于避光条件下 37℃孵育 4 h后，
小心弃液，再向每孔加入 170 μL DMSO溶解结晶
体，振荡摇匀10 min，最后在单波长490 nm下测定
各孔吸光值，通过OD490值的大小间接反应细胞存
活情况(仝钢等，2001)。设置正常细胞对照组，每
个质量浓度做6个平行复孔，3次重复实验。
3.5接骨木花色苷体外抗TGEV活性的研究
预防作用实验，按照3.4所述实验方法，铺96孔
板，待细胞铺满80%，在花色苷安全浓度范围内，向
孔中加入色素样品母液，使得最终花色苷的浓度为
10、20、30、40和50 μg/mL，37℃培养2 h，再接入稀释
104倍后的TGEV病毒液20 μL，培养2 h后，加入维
持液继续培养，分别在48和72 h时，测定OD490值。
治疗作用实验，用 96孔细胞培养板同上成单
层后，弃生长液，每孔加入 20 μL稀释 104后的
TGEV病毒液，37℃孵育2 h，向孔中加入花色苷终
浓度为10、20、30、40和50 μg/mL的样品母液，细胞
维持液补液体至 200 μL。置于 5% CO2培养箱
37℃培养 48和 72 h，MTT法测定OD490值。实验对
照同3.4所述。
3.6接骨木花色苷与TGEV对ST细胞形态学试验
按照3.5治疗效果实验方法，1 mL/well的细胞
悬液(浓度为 4~5×105 cells/mL)于 24孔细胞培养
1190
板，培养成单层，弃生长液，按体积的10%加入稀释
104后的TGEV病毒液，37℃孵育 2 h，向孔中加入
花色苷终浓度为 10、20、30、40和 50 μg/mL的样品
母液，细胞维持液补液体至1 mL。实验设细胞、病
毒对照，置于培养箱培养，间隔 12 h观察一次细胞
生长情况。
3.7 数据处理方法
本实验结果数据采用 DPS统计软件分析和
Origin 8.0软件作图，数据均以X—±SD表示，多组间
运用单因素Duncan新复极差法分析，以不同字母
表示5%显著水平的差异，具有统计学意义。
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年份
被引篇数
引用次数
平均单篇引用
11
1
1
1
10
7
8
1.14
09
14
15
1.07
08
28
31
1.11
07
32
53
1.66
06
30
43
1.43
05
42
84
2
04
38
74
1.95
03
39
64
1.64
02
25
50
2
01
27
55
1.96
00
35
46
1.31
99
14
26
1.86
98
12
22
1.83
97
15
26
1.73
96
16
43
2.69
95
15
30
2.73
94
4
18
4.5
93
2
4
2
合计
396
693
引用/次
13
10
9
9
9
9
被引作者
邢怡明
赵红盈
闫亚东
吴孔明
闻伟刚
廖晓兰
被引期刊
J AGR BIOTECHNOLOGY
J AGR BIOTECHNOL
J AGR BIOTECH
J AGR BIOTECHNOL
J AGR BIOTECHNOL
J AGR BIOTECH
年
1994
2004
2005
2007
2003
2004
卷
2
12
13
15
11
12
页
91
76
66
1
192
80
论文发表
表1 《农业生物技术学报》论文被引用年代分布
表2 《农业生物技术学报》被SCI引用次数高的论文
表3《农业生物技术学报》论文被引用次数
引用/次
论文/篇
13
1
10
1
9
4
8
3
6
4
5
9
4
11
3
30
2
74
1
259
SCI引用《农业生物技术学报》论文统计(2012)
􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇􀤇
史丽文 任立刚 王淑凤 徐正一
(中国农业大学)
《农业生物技术学报》创刊于 1993年，2004~2009年又出版了英文版《Chinese Journal of Agricultural Biotechnology》，
在国内外农业生物技术研究领域都具有一定的影响力。截至2012年10月，在SCI（科学引文索引数据库）中，《农业生物技
术学报》发表的论文共有396篇被引用，总被引用次数为693次。在SCI数据库中检索《农业生物技术学报》所使用的检索
词为：J AGR BIOTECHNOLOGY、J AGR BIOTECHNOL、J AGR BIOTECH及CHINESE J AGR BIOTEC。
一《农业生物技术学报》被SCI引用统计
(下转1202页)
1192