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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
接种丛枝菌根真菌和有机土栽培对甜椒根际
微生物分子多态性的影响
王林闯 贺超兴 张志斌
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081)
摘 要: 通过采用变形梯度凝胶电泳 ( DGGE )技术对普通土、普通土 + GM、有机土和有机土 + GM 4个不同处理下甜椒
根际土壤微生物的多样性进行研究。结果表明,接菌处理使细菌的种类在数量上有所增加, 其中有新的细菌类型的出现, 也
有一些细菌类型的减少和消失,一些共有细菌种类的数量也得到了丰富;应用有机土栽培有利于一些菌群的生长繁殖, 有助
于促成优势菌群的建立;对电泳图谱的相似性系数分析表明, 有机土对细菌菌群多样性的影响强于接种菌根真菌处理; 普通
土接种菌根真菌对土壤微生物种群的影响强于有机土;接种菌根真菌使土壤的细菌种群结构发生了变化, 并增加其菌群种类
的相似性。
关键词: 丛枝菌根真菌 有机土 DGGE 微生物分子多态性 甜椒
Effect of ArbuscularMycorrhizal Fungi and Organic Soil
Substrate on theM icrobialM olecular D iversity in Sweet
Pepper Rhizosphere of Protected Cultivation
W ang L inchuang H e Chaox ing Zhang Zhib in
( Institute of Vegetables and F lowers, ChineseA cademy of Agr icultural Sciences, Beij ing 100081)
Abstrac:t The DGGE techniquew ere used to study the e ffect o f d ifferen t treatm ents( general so i,l general so il+ GM, o rganic so i,l
o rganic so il+ GM ) on the m icrob ia lm olecu lar diversity in sw eet pepper rh izo sphere. The results showed tha t the num be r of bac teria spe-
cies increased w ith the inocu la tion of GM, w hich includ ing the appear and d isappea r of some kinds o f bacter ia. The o rganic so ils are
bene fic ia l to the grow th and propagation o f some bacteria l flora, and m ake som e advantage flora bu ilt up. Through analyses the sim ilar ity
o f DGGE pro file can get that the effec t o f o rganic substrate is stronger than the inocu la tion of GM on so ilm icrobia l flora, and the genera l
so il+ GM is stronger than organ ic so i.l The structure o f bacter ia spec ies in both so il have a sam e change w ith the inoculation o f GM,
wh ich increased the sim ilar ity of the ir bacter ia spec ies.
Key words: A rbuscular m ycorrh izal fung i O rganic substra te Denaturing grad ient ge l e lectrophoresis M icrobia l diversity
Sweet pepper
收稿日期: 2010-10-20
基金项目:农业部行业科技项目 ( nyhyzx07-007) ,中央级公益性科研院所基本科研业务费专项 ( 082060302-05 ), 农业部园艺作物遗传改良重点
开放实验室资助
作者简介:王林闯,男,硕士研究生,研究方向:设施蔬菜栽培; E-m ai:l w lc516@ 163. com
通讯作者:贺超兴,男,博士,研究员,研究方向:设施蔬菜有机栽培和微生物; E-m ai:l ivf_sszp@ m ai.l caas. net. cn
土壤微生物是土壤的一个重要组成部分,是土壤
有机质和养分转化、循环的动力,它们参与土壤有机
质分解、腐殖质形成、土壤养分转化和循环等过程。
土壤微生物群落的组成与活性不仅决定了土壤肥力
和质量,也与植物的生产力有关 [ 1]。PCR-DGGE技术
提供了一个快速研究和比较不同体系下的微生物群
体差异的分子方法来取代传统的平板培养方法 [ 2 ]。
变性梯度凝胶电泳 ( DGGE)技术可以有效的将具有
相同大小而碱基序列不同的 DNA片段分离开来。国
内外的研究者已经利用 PCR-DGGE对土壤微生物群
2011年第 5期 王林闯等:接种丛枝菌根真菌和有机土栽培对甜椒根际微生物分子多态性的影响
体的一些基础方面进行了调查,如在不同的环境、空
间、时间下微生物群体的变化和差异 [ 3]。
设施蔬菜生产在我国发展很快, 为新鲜蔬菜的
周年供应提供了强有力的保障,但设施蔬菜产量偏
低及土壤连作障碍、微生物区系失调和次生盐渍化
等影响了设施蔬菜的可持续生产。近年来, 我们通
过将秸秆、有机肥还田开发出设施蔬菜有机土栽培
技术, 不仅克服了设施栽培通常存在的土壤易板结、
土壤传病害频发、连作障碍和地下水污染等缺陷,还
可改善蔬菜品质, 节省生产成本 [ 4]。另外, 在蔬菜
育苗时通过接种有益共生微生物菌根真菌开发出菌
根苗生产技术,将之与设施有机土栽培相结合可以
增加蔬菜产量,改善品质,减少化肥和农药用量,保
护生态环境,提高经济效益 [ 5 ]。为了探究新技术的
应用对土壤微生物群落多样性的影响, 本试验以甜
椒为材料,普通土为对照, 对有机土栽培下接菌处理
后土壤微生物的分子多态性进行研究, 以期探明有
机土和菌根应用技术的促生作用中微生物的变化。
1 材料与方法
111 试验材料与设计
供试甜椒品种为中椒 105, 由中国农业科学院
蔬菜花卉研究所选育。
供试菌剂为 G lomus mossea-2(简称 G1M ), 由匈
牙利科学院土壤科学与农业化学研究所 Tunde
Takacs博士提供。
试验 2009年在廊坊中国农业科学院国际高新
技术产业园区日光温室进行,以甜椒为试验材料,共
设 4个处理: ( 1)普通土 +普通苗 ( PCK ) ; ( 2)普通
土 +菌根苗 ( PGM ); ( 3)有机土 +普通苗 ( YCK ) ;
( 4)有机土 +菌根苗 (YGM ), 每处理 5个重复, 每重
复 30株。普通土为沙壤土, 有机土由腐熟秸秆、有
机肥和普通土壤按一定比例配制而成, 并经过一年
的栽培 (理化性质见表 1) ;普通苗由常规育苗所得,
菌根苗是由播种时接种菌根真菌培育而来。
表 1 栽培基质的主要营养元素含量
类型 全 N
(% )
全 P
(% )
全 K
(% )
速 N
(m g/kg)
速 P
( mg /kg)
速 K
( mg /kg)
有机质
(% )
普通土 0. 118 0. 442 0. 670 77. 7 339 146 2. 98
有机土 0. 286 0. 165 0. 494 151 547 197 11. 69
于甜椒开花期对各处理甜椒根际土进行取样,
采用 5点取样法, 将每处理 5个不同地点的根际土
样混合均匀后用无菌的自封袋密封保存,至于冰盒
中带回实验室后过 2 mm筛放于 - 20e 冰箱保存。
112 方法
11211 土壤基因组 DNA的提取 土壤微生物基因
组 DNA的提取采用土壤基因组 DNA快速提取试剂
盒 (离心柱型 - 百泰克 )进行提取, 并用 018%的琼
脂糖凝胶对获得的总 DNA进行电泳检测。提取后
无需进行纯化,根据提取 DNA的质量只需适当倍数
( 100, 150, 200倍等 )的稀释即可进行下游 PCR
反应。
11212 基因组 DNA的 PCR扩增 采用大多数细
菌和古细菌的通用引物对 16S rDNA的特异性 V3
区进行扩增,引物序列 [ 6]为: F357-GC ( 5c-CGCCCGC-
CGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGG GGC-
CTACGGGAGGCAGCAG-3c) ; R518 ( 5c-ATTAC-
CGCGGCTGCTGG-3c) ,由上海生工生物工程技术服
务有限公司合成。扩增反应体系为: 10 @缓冲液
215 LL, dNTP ( 25 mmo l/L ) 2 LL, 引 物 1
( 25 pmol /LL) 1 LL, 引物 2 ( 25 pmo l/LL ) 1 LL,
M g
2+
( 25mmol /L ) 215 LL,模板 (适当倍数稀释的土
壤微生物 DNA ) 2 LL, Taq DNA聚合酶 ( 215 U ) 015
LL, ddH2O 1315 LL,总体积 25 LL。反应程序: 95e
变性 5m in; 94e 30 s, 50e 30 s, 72e 2m in, 30个循
环; 72e 延伸 10m in。反应结束后, 用 115%的琼脂
糖凝胶对 PCR产物进行电泳检测。
11213 PCR产物的变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )分
析 制备 8% 的聚丙烯酰胺凝胶, 变性剂梯度为
40% - 60% ( 100%变性剂为 7mo l/L的尿素和 40%
的去离子甲酰胺的混合物 ), 变性剂浓度由胶的上
方到下方依次递增;待胶凝固后, 加入 PCR样品 30
LL,电泳缓冲液为 1 @ TAE, 60e , 60 V电压电泳 1
h, 100V电压电泳 16 h;电泳结束后,用 SyBR Green
Ñ ( 1 @TAE稀释 10 000倍 )核酸染料对凝胶进行染
色 30m in;将染色后的凝胶于凝胶成像系统中观察、
拍照,并用 Quantity One分析软件 ( B io-R ad)对电泳
图谱进行数字化处理和聚类分析。
113 数据分析方法
对各处理土壤样品的 PCR产物经变性梯度凝
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
胶电泳 ( DGGE )分离后的电泳图谱照片进行观察,
采用 B io-Rad凝胶成像分析系统所带的 Quant ity-
One分析软件对各土壤样品 DGGE图谱条带进行数
字化处理, 并生成 DGGE图谱条带的示意图, 并采
用 UPGMA法对 DGGE图谱进行聚类分析, 计算其
相似性系数,以初步统计多样性指标数据。
2 结果分析
211 不同处理土壤样品中微生物基因组 DNA的
提取
土壤微生物基因组 DNA的提取采用直接提取
法,由于土壤中含有各种各样的杂质,因而也增加了
提取的难度。试验前期,耗费了大量时间,尝试了多
种手工提取法, 未能得到理想稳定的结果。尽管通
过琼脂糖电泳能够检测到提取的目标条带, 但其中
含有太多的杂质 (腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物
和蛋白质等 ), 以致影响下游的其他操作而无法使
用。而本试验最终通过使用土壤基因组 DNA快速
提取试剂盒进行提取,获得了理想的大小约为 23 kb
的目标产物 (图 1), 而且操作快捷, 省工省时, 易于
进行后续试验、, 但成本也相对提高。
图 1 不同处理土壤样品中的微生物基因组 DNA
212 不同处理土壤样品 16S rDNA V3区片段的
PCR扩增
按照上述的 PCR扩增体系及相应的反应程序
直接对用试剂盒所提取的基因组 DNA进行扩增,通
过琼脂糖电泳检测并没有得到应有的 PCR产物,通
过仔细观察反而能够看到一条比较细弱的基因组
DNA条带。而后通过对基因组 DNA进行不同浓度
的稀释, 发现在 150、200、250和 300倍稀释液中都
得到了大小约 230 bp的 PCR产物 (图 2, 150倍 )。
213 不同处理土壤样品细菌群落多样性分析
21311 不同处理土壤样品的 DGGE图谱 将 16S
rDNA V 3区片段的 PCR产物进行变性梯度凝胶电
泳 ( DGGE ) ,可以使 PCR产物中碱基序列不同的片
段分离,得到数目不等、位置各异的电泳条带, 从而
能够分析不同生态系统或处理土壤中细菌群落结构
的差异和多样性。根据 DGGE能分离长度相同而
序列不同 DNA的原理,每一个条带大致与群落中的
一个优势菌群或操作分类单元 (Operational taxonom-
ic uni,t OUT)相对应,条带数越多说明微生物多样性
越丰富,条带染色后的荧光强度越亮也可以表示该
种群的数目越多, 从而反应土壤中微生物的种类和
数量 [ 7]。
图 2 不同处理土壤样品 16S rDNA
基因的 PCR扩增产物
由图 3-A可见,通过变性梯度凝胶电泳使各处
理 16S rDNA V3区片段的 PCR产物得到了有效的
分离,每一泳道都获得了大量的条带。采用 Quant-i
ty-One分析软件对所得到的各处理的 DGGE图谱进
行分析,结果 (图 3-B )表明,不同处理土壤的 DGGE
图谱条带的位置和数目均存在一定差异,其中有许
多公共条带,但有些条带的亮度产生了明显的差异,
说明这些处理土壤存在一些共有的细菌类型, 但这
些细菌类型在数量上发生了较大变化; 另外,不同处
理间还有少数特有条带, 说明不同处理改变了土壤
中细菌种群的构成, 增加或减少了一些细菌类型。
从总体上看,有机土的 DGGE图谱的条带较为分散
且亮度较强,普通土的则相对较为集中、亮度较弱,
说明有机土栽培条件下有较多亲缘关系较远细菌种
群, 这也是种类多样化的一种反应,而且该条件也有
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2011年第 5期 王林闯等:接种丛枝菌根真菌和有机土栽培对甜椒根际微生物分子多态性的影响
利于一些优势菌群的生长并得到大量繁殖; 接菌处
理的 DGGE图谱的条带数略多于不接菌对照, 而且
一些共有的条带亮度也得到加强, 通过对比发现菌
根真菌的介入不只是简单地增加了几个细菌类型,
而是在增加一些细菌类型的同时也减少了一些细菌
类型, 一些种类细菌的数量得到丰富,从而使土壤中
的菌群结构产生了改变。
21312 土壤细菌群落相似性分析 从各处理
DGGE图谱的聚类分析的树状图 (图 4)中可以看
出, 普通土接菌处理 ( PGM )和不接菌对照 ( PCK)归
为一类, 相似性系数为 0161; 有机土的接菌处理
( YGM )和不接菌对照 ( YCK )归一类,相似性系数为
0173;然后再将其聚合到一起,相似性系数为 0155,说
明土壤类型对细菌菌群多样性的影响强于接种菌根
真菌处理。另外,通过对同一土壤类型下两个处理的
相似性系数进行比较可以得出,接种菌根真菌对普通
土中微生物种群的影响强于有机土,这可能也与两种
土壤类型所原有的基础菌群类型有关。
图 3 不同处理土壤样品的 DGGE图谱 (A )及示意图 ( B)
从不同处理 DGGE图谱各泳道的相似性系数
(表 2)还可以看出, 普通土接菌处理 ( 3, 4号泳道 )
和有机土接菌处理 ( 7, 8号泳道 ) DGGE图谱间的相
似性系数 (平均 01608)大于普通土对照 ( 1, 2号泳
道 )和有机土对照 ( 5, 6号泳道 )间的相似系数 (平
均 01485), 说明接种菌根真菌使两种类型土壤的细
菌种群结构发生了一致的变化,使它们的菌群种类
更加相似。
3 讨论
随着环境污染问题的日益突出和人们对农产品
质量品质要求的逐步提高, 土壤微生物的多样性及
其动态变化越来越受到科学家们的关注和重视, 成
为当前国内外研究的热点领域, 诸多现实问题 (如
重金属、石油污染、连作障碍和土壤修复等 )的解决
都希望从中能有所突破。
由于土壤成分比较复杂, 所以也增加了微生物
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
总 DNA提取的难度。目前, 有很多报道的手工提取
方法, 但经过一些尝试之后, 没有得到理想的结果。
尽管在土壤微生物 DNA的提取过程中,针对土壤中
的大量杂质 (腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物和蛋
白质等 )也采取了一些措施 (如 SDS、EDTA、CTAB、
苯酚和氯仿等药品 ) ,但仍然难以将它们完全去除,
以致影响到后续的操作 ( PCR扩增、杂交等 )。为解
决这一问题, 在获得粗制的 DNA溶液之后, 还需
进行纯化, 如 PVPP柱层析法、胶回收试剂盒纯化
及透析袋电洗脱纯化回收法等方法的采用, 虽在
一定程度上起到了对 DNA溶液纯化的效果,但也
存在 DNA损失严重、回收率低、耗时费力和费用
昂贵等问题, 因此本试验最终选择了用试剂盒进
行提取。
图 4 不同处理 DGGE图谱的聚类分析
表 2 不同处理 DGGE图谱中各泳道间的相似性系数
泳道 1 2 3 4 5 6 7 8
1 10010 8611 6219 6217 4817 4918 5511 5613
2 8611 10010 5914 5915 4714 4812 5119 5315
3 6219 5914 10010 8510 5418 5412 6012 6114
4 6217 5915 8510 10010 5617 5518 5917 6118
5 4817 4714 5418 5617 10010 9012 7313 7315
6 4918 4812 5412 5518 9012 10010 7411 7214
7 5511 5119 6012 5917 7313 7411 10010 8819
8 5613 5315 6114 6118 7315 7214 8819 10010
丛枝菌根 ( arbuscu larmycorrh iza, AM )真菌是自
然界中分布较广一个菌种类型, 能与陆地上 80%以
上的植物根系建立共生关系, 形成共生体 [ 8, 9]。研
究表明, AM真菌不仅能够对宿主植物个体的生长
发育产生显著的影响,而且能够对宿主植物的个体
与个体、个体与其他生物、以及 AM真菌本身与其他
微生物之间的关系产生影响 [ 10 ]。
目前,已有很多关于 AM真菌与土壤微生物互
作的研究,如 AM真菌与根瘤菌的互作 [ 11]、其他微
生物对 AM真菌孢子寄生的影响 [ 12]及 AM真菌与
根际促生细菌的互作 [ 13]等。其中报道较多的还是
有关 AM真菌对土壤中病原微生物的影响。AM真
菌可通过影响宿主植物根系生理生化过程或根际微
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2011年第 5期 王林闯等:接种丛枝菌根真菌和有机土栽培对甜椒根际微生物分子多态性的影响
生态环境而影响病原菌。可以说, AM真菌对土壤
微生物的影响, 不仅有直接的互作, 还有间接的作
用,这些都可能使一些病原菌得到有效地抑制。刘
润进等 [ 14]发现, AM真菌侵染可以激发宿主植物根
系产生病程相关蛋白 ( PR s) , 从而使植物对病原菌
产生抑制;胡正嘉等 [ 15]的研究发现, 接种 AM真菌
能够改变植物根际微生物群落及几丁质酶活性,抑
制病原微生物。Folion等 [ 16 ]对 AM真菌外生菌丝与
根际微生物的互作进行了研究, 发现 G lomus intrara-
d ices外生菌丝的分泌物能够促进 Trichoderma harzi-
anum和 P seudomonas chlororaphis的分生孢子的萌
发和增殖, 抑制 Fusarium oxy sporum f1 sp1 chrysan-
them i的分生孢子萌发,对 Clavibaterm ichiganensis影
响不明显, 而 T1 harzianum与 P 1 chlororaphis恰恰都
是土壤有益菌, F 1oxysp orum f1sp1chry santhem i是病
原菌。朱红惠等 [ 17]通过 DGGE图谱也证实了 AM
真菌对青枯菌的抑制效应,还揭示出接种 AM真菌
对根际土壤中细菌群落结构所产生的复杂的影响。
还有试验证实了接种 AM真菌能够减轻立枯丝核菌
Rhizoctonia solan
[ 18]、镰刀菌 Fusarium solan [ 19]、寄生
疫霉 Phytophthora parasitica [ 20]等病原菌引起的病害。
VA菌根真菌除对根部病原菌有拮抗和抑制作
用外, 对根瘤菌、固氮菌、解磷细菌和根际促生菌等
有益土壤微生物还有相互促进的作用。甚至, 某些
AM真菌就是一些细菌存在的原因, 因为 AM真菌
分泌物激活了一定种类的细菌 [ 21]。接种 AM真菌
能够促进根瘤形成,增强根瘤菌的固氮作用,最终促
进宿主植物的生长 [ 22]。固氮细菌可以提高植物对
氮的生物利用, 并且当植物被 AM真菌侵染时这种
能力会增强 [ 23]。AM真菌和荧光假单孢菌 (P seudo-
monas f luorescens)接种的试验结果表明,混合接种更
能促进番茄对 P的吸收和植物的生长 [ 24]。AM真
菌和解磷细菌 (Bacillus mega terium )在红三叶草上
的接种试验结果表明,双接种与单接种相比较,更能
促进植物的生长和 P元素的吸收 [ 25 ]。用 AM真菌
和重氮营养醋杆菌 (A cetobacter d iazotrophicus )对超
甜玉米进行双接种, 能够显著提高 AM 真菌的侵染
率,叶片 N和 P含量增加,植物地上生物量增大,单
果重提高 [ 26]。李树林等 [ 27]研究结果表明, VA菌根
能明显影响茄根际微生物的组成, 有利于革兰氏阴
性细菌、放线菌、固氮菌的发育, 不利于真菌和革兰
氏阳性细菌的发育。
菌根真菌可影响根际土壤中微生物的数量和优
势菌群的形成。Bagyaraj等 [ 28]最先发现 VA菌根真
菌侵染马铃薯后, 根际细菌和放线菌的数量增多。
Kothari等 [ 29]的研究表明,即使在微生物种类大致不
变的前提下,菌根真菌也能使根际微生物数量发生
变化, 达到新的平衡并提高它们的活性。耿广东
等 [ 30]的研究结果表明, 接种了 GM和 GV菌根的黄
瓜幼苗植株,其根际土壤中细菌、真菌以及放线菌数
量分别比对照都大幅增加。胡正嘉和王平 [ 15]的试
验表明,接种 AM真菌后棉花根际的细菌、真菌和放
线菌等均发生了数量上的变化。
本试验通过采用变性梯度凝胶电泳对不同处理
下的甜椒根际土壤微生物 16S rDNA V3区片段的
PCR产物进行检测,得到了较好的 DGGE图谱。通过
Quantity One分析软件对图谱进行处理分析, 结果表
明,不同处理的甜椒根际土壤中存在一些共有的细菌
类型,但这些细菌类型在数量上发生了较大变化;不
同处理还改变了土壤中细菌种群的构成,增加或减少
了一些细菌类型;有机土较普通土中有较多亲缘关系
较远细菌种群,而且也有利于一些优势菌群的生长繁
殖,这可能与有机土所具有的优良的理化性质和较高
的有机质、腐殖质含量有关,为微生物的生长提供了
一个良好的环境条件;接菌处理使细菌的种类在数量
上有所增加,其中有新的细菌类型的出现,也有一些
细菌类型的减少和消失,一些共有细菌种类的数量得
到了丰富,改变了土壤中的菌群结构, 结合前人的研
究报道,这应该与菌根真菌对植物的生长发育的影响
和抗病性等有关系, 如有益菌类的增加和丰
富 [ 11, 13, 24, 25, 27, 28] ,病原菌类的减少和消失 [ 15- 20]。通过
分析的图谱的相似性系数还可以得出,土壤类型对细
菌菌群多样性的影响强于接种菌根真菌处理;普通土
接种菌根真菌对土壤微生物种群的影响强于有机土,
接种菌根真菌使两种类型土壤的细菌种群结构发生
了一致的变化,增加了它们菌群种类的相似性。
总之, 通过采用变形梯度凝胶电泳对土壤微生
物的多样性进行检测,可以看出有机土栽培和接种
菌根真菌都对土壤细菌种群的多样性和种群结构产
生了影响,具体表现为一些细菌种类的增多、减少和
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数量上的丰富,而发生变化的那些细菌种类还有待
进一步的确定,并检验其对作物的影响,为更多微生
物菌剂、菌肥的开发和利用打下基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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