全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 5期
噬藻体的分子生物学研究进展
向安 刘丽 魏大巧 夏雪山
(昆明理工大学生命科学与技术学院,昆明 650224 )
摘 要: 噬藻体是一种侵染原核藻类的病毒, 可能是控制蓝藻水华生消的重要生态因子 ,在自然水体中大量存在。随
着分子生物学和遗传学技术的不断发展,噬藻体的不断分离和发现, 水生生态系统的研究内容更加丰富。对近年来国内外有
关噬藻体分子生物学、遗传标记和分子生物学检测等方面的最新研究进展作了综述,并对今后研究工作进行了展望。
关键词: 噬藻体 分子生物学 基因转移 遗传标记 分子生物学检测
Molecular Biological Studies on Cyanophages
X iang An L iu L i W e iDaqiao Xia Xueshan
(Faculty of L ife Sciences and T echno logy, Kunm ing University of Science and T echnology, Kunming 650224)
Abstrac:t Cyanophage, the v irus of b luegreen a lg ae that has been w idespread in the aquatic env ironm en t and o ften occur in a lg ae
b looms, could be the facto r in contro l o f bluegreen a lg ae b loom W ith the deve lopm en t o f mo lecu lar too ls and genetic techn iques that
have p layed an im portant ro le in the research o f aquatic ecosystem sThis rev iew dea led w ith the m o lecular b io log ical studies on cya
nophages, gene tic ma rkers and m o lecular biology detection in recent years, and research prospects w ere proposed
Key words: Cyanophage M olecular bio logy Gene transfer Geneticm arkers M olecu lar bio logy de tection
收稿日期: 20081111
作者简介:向安 ( 1983) ,男,湖南辰溪人,在读研究生,研究方向:分子病毒学
通讯作者:刘丽,硕士研究生导师, Em ai:l L iu li2272@ 163 com
蓝藻 ( B lueG reen A lgae )是一类原核光合自养
生物, 具有细菌的某些特征,因此常把蓝藻称为蓝细
菌 ( Cyanobacteria) , 感染蓝细菌的病毒就被称之为
噬藻体 ( Cyanophage)。除了蓝藻以外,所有其他的
藻类都是真核生物, 通常将感染真核藻类的病毒称
为 藻病毒 ( Phycov irus)。噬藻体的命名与宿主有
关,即取宿主拉丁文名称的第一个字母,如感染鱼腥
藻 (Anabaena )的病毒, 简称 A病毒, 感染念球藻
(N ostoc)的病毒, 简称 N病毒, 同时感染鞘丝藻
(Lynbya )、席藻 (P horm idium )和织线藻 ( P lectone
ma )的 LPP病毒。血清学亚型则在字母后加上阿
拉伯数字区分,如 SM 1、SM 2和 LPP1等。国际病
毒学分类委员会 ( ICTV )细菌病毒分类会根据噬藻
体形态不同,参照噬菌体的分类方式,将其分为肌病
毒科 (M yov iridae) ,长尾病毒科 ( Sty lov iridae)和短尾
病毒科 ( Podovir idae) 3个科。 1963年 Safferman和
M orris
[ 1]在降解蓝藻时首次分离得到了能感染鞘丝
藻 (Lynbya )、席藻 (Phorm id ium )和织线藻 (P lectone
ma) 3种宿主蓝藻的 LPP病毒。这是人们发现的
第一株噬藻体,也是分布最广,为人们所研究最多的
噬藻体之一。在这一时期, 噬藻体与宿主的作用机
制得到了较多研究 [ 2]。
上世纪 90年代未,研究者发现海洋中噬藻体的
含量十分丰富, 而且噬藻体与藻类之间关系紧密。
人们对噬藻体在生态环境中的重要性有了重新认
识, 也激发了人们对噬藻体的强烈关注。
1 分子生物学研究概况
噬藻体分子生物学研究发展很快, 对海洋聚球
藻噬藻体的研究报道最多。噬藻体基因组全序列的
测定对噬藻体以及蓝藻的生物学特性、亲缘关系以
及分类进行基因水平研究具有重要意义。 2002年 5
月 Chen等 [ 3]测定了第一株噬藻体 P60的基因组全
序列。与其它裂性噬藻体一样, P60有类似的 80个
潜在开放阅读框 ( ORF) ,在分子水平上证明它是一
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
种重要的裂性噬藻体。对 P60的 DNA复制系统研
究发现,短尾病毒科噬藻体 DNA复制系统比肌病毒
科和长尾病毒科噬藻体要保守的多, 说明 DNA复制
系统的保守性可作为裂性噬藻体的判断标准。另
外, P60还与海洋单细胞蓝藻具有高度相似的核酸
代谢相关基因序列。 2007年 2月, Pope等 [ 4]对噬藻
体 Syn5基因组序列、衣壳组织和结构蛋白作了详细
报道。随后, W eigele等 [ 5]又发现了噬藻体 Syn9基
因组, 全长 177 300 bp,包含 226个蛋白和 6个 tRNA
编码基因。尽管 Syn9与噬菌体 T4有 19%的基因
同源相关性, 但它们却有不同的 DNA复制模式,
Syn9可利用同源蛋白组装成与噬菌体 SPO1和疱疹
病毒有相同拓扑学特征的衣壳整体结构。另外,在
Syn9中还发现了与宿主相关的光合反应亚单位,电
子传递蛋白和戊糖途径相关酶编码序列,表明 Syn9
在进化过程中与宿主有过遗传物质交换。
同年 9月, Stoddard等 [ 6]报道了海洋聚球藻对
噬藻体的抗性与其细胞表面的噬藻体结合位点基因
突变有关,细胞表面受体结合位点的改变会影响噬
藻体与宿主的结合。由于这种与抗性相关的受体基
因具有高变异性,所以藻细胞对某一噬藻体的抗性
会转变成对多种噬藻体的交互抗性, 这种交互抗性
对蓝藻和噬藻体的种群分布和多样性有着重要
影响。
淡水铜绿微囊藻的噬藻体 M aLMM01是近年
来淡水噬藻体研究的热点, 人们期望它可用于铜绿
微囊藻水华的生物控制。噬藻体 M aLMM01由一
个不对称头部和含有一条中央管的可收缩的螺旋对
称的尾鞘组成。经两个开放阅读框的氨基酸序列同
源性分析得出 M aLMM01介于海水和淡水噬藻体
之间 [ 7]。MaLMM01核酸为线性双链 DNA, 甲基化
水平较低。基因组全长 162 129 bp, 包含 184个蛋
白编码基因和两个 tRNA基因。与已发现的肌病毒
科噬藻体有所不同, M aLMM01中没有发现普遍分
布于海洋噬藻体的光合基因, 却有编码 nb lA (可降
解蓝藻藻胆蛋白体光捕复合物 )的必需基因。Ma
LMM01中含有位点特异重组酶 ( sitespec ific recom
b inase)编码基因, 抗阻遏物激活因子 ( an tirepres
sors)编码基因以及与宿主高度同源的转坐酶编码
基因, 说明MaLMM01基因不仅可整合到宿主基因
组当中而且还与其宿主发生基因传递 [ 8 ]。
国内有关噬藻体的研究相对较晚, 2002年, 赵
以军等 [ 9]分离得到一株能裂解织线藻和席藻的噬
藻体, 是国内首次分离得到的噬藻体。 2003年, 汤
显春 [ 10]报道了云南滇池中的微囊藻病毒, 并对此类
噬藻体进行了电镜观察及核酸分析。随后刘艳鸣
等 [ 11, 12]运用透射电镜及荧光显微技术, 对富营养化
的武汉东湖中浮游病毒丰度及多样性进行了研究。
2007年, 安成才等报道了感染席藻 (Phorm id ium fo
veolarum )的 PfWMP4和 PfWMP3。这两种噬藻体
在很早之前就已发生分化, 但却有相同的形态学结
构、结构蛋白 SDSPAGE条带及氨基酸序列和右臂
基因结构。并证明左臂基因除一些关键的 DNA复
制基因外具有多样性,而结构基因相对保守 [ 13, 14 ]。
2 分子生物学遗传标记
噬藻体是高度差异性病毒类群, 因此寻找应用
较为广泛的遗传标记成为近年来噬藻体分子生物学
研究的关键。
21 p sbD、psbA 基因
p sbD、psbA 基因编码光系统 ( PS )反应中心
蛋白 D1和 D2蛋白。D1和 D2蛋白组成二聚体与
Ps反应中心色素 叶绿素 P6so分子结合,共同
构成光系统的光化学反应中心。研究者已在海洋
聚球藻和绿球藻的噬藻体中都发现了 p sbA 和 p sbD
基因,之后, 在许多噬藻体中均有发现 [ 15]。来自夏
威夷海的水样中 88%的噬藻体含有 psbA, 50%的噬
藻体同时包含有 psbA和 psbD,而且几乎所有可编
码 psbA和 psbD的噬藻体均有广泛的宿主范围。且
噬藻体的光合作用基因能在感染宿主过程中表
达 [ 16] , 增加宿主的光合作用能力, 同时增加病毒的
释放量,提高自身生存率。P sbA基因的有无与噬藻
体感染宿主的潜伏期长短有关, P sbD基因能反应噬
藻体与不同宿主间的耦合关系以及相关参数, 噬藻
体基因内重组以及与宿主间的基因转移也能得到证
明 [ 17]。另外, 淡水噬藻体与海洋噬藻体的 p sbA 基
因有不同的进化史,同一地理区域的噬藻体 psbA 基
因结构也存有差异。噬藻体 p sbA 基因在进过程中
经过了多次基因水平转移, 这些都可影响彼此基因
多样性以及光合系统的进化 [ 18]。最重要的是 p sbA
基因可作为噬藻体遗传多样性和进化史研究的一个
32
2009年第 5期 向安等:噬藻体的分子生物学研究进展
基因标识 [ 19]。光合基因在噬藻体中的普遍存在,对
于了解病毒超微型光合自养生物生理以及生物地化
循环的影响有重要意义。
22 g20基因
g20基因是肌病毒科噬藻体的一个保守区域,
与噬菌体 T4的衣壳组装蛋白编码序列极其相似。
Fu ller等 [ 20]设计了噬藻体 g20基因的引物 CPS1和
CPS2。利用此引物能特异扩增多数肌病毒科噬藻
体中一个 165 bp的 DNA片段。试验证明海洋水样
经浓缩甚至有些水样直接经 PCR扩增就可准确地
检测到目的 DNA 片段 [ 20]。在此基础上, Zhong
等 [ 21]设计了扩增片段长度更长的 CPS3, CPS4和
CPS8。分析表明海洋噬藻体有很广泛的基因多样
性,与 p sbA、p sbD基因不同, 噬藻体 g20基因同源相
关性在地理分布上并无明显差异, 在微生物基因多
样性方面有着十分重要的作用 [ 21 ]。 Short和 Sut
t le
[ 22]也针对噬藻体 g20基因设计了新引物 G202,
同时结合变性梯度凝胶电泳技术对 PCR产物进行
快速分析。相比形态学研究,用分子生物学方法研
究得知的噬藻体有更为广泛的多样性, 群落结构受
到坡度、光、营养盐以及宿主群落结构影响。然而,
在温度和盐度差别很大的海域中发现有高于 99%
的相似序列,在深海中也发现了扩增产物,这些结果
说明宿主和病毒在海洋环境中的广泛分布是由于基
因在不同环境之间发生了水平转移 [ 23]。W ilhelm
等 [ 24]经 g20基因分析证明了聚球藻噬藻体在加拿
大 Laurentian湖的东、中和西部均有广泛分布, 证明
了噬藻体在淡水微食物网 ( m icrobia l food w ebs)中的
重要作用。Dorigo等 [ 25]用 g20基因 PCR扩增和变
性梯度凝胶电泳 ( DGGE )技术对法国 Bourget湖中
噬藻体的研究结果充分显示了此水域噬藻体的多样
性,甚至一些噬藻体与海洋噬藻体有很高的同源性,
与其它淡水噬藻体相差甚远。另外, 此水域噬藻体
种群分布有十分明显的季节变化性。
23 g91基因
Takash ima等根据感染有毒铜绿微囊藻的 Ma
LMM01尾鞘蛋白编码基因 g91 设计实时定量 PCR
引物, 对铜绿微囊藻水华发生前后水体中的 Ma
LMM01进行定量分析,并得到以下推论: ( 1)噬藻体
对宿主有复杂的专一性; ( 2)缺陷型噬藻体在自然
环境中占绝对优势; ( 3)一些噬藻体在感染过程会
形成溶源性。此方法为研究噬藻体对铜绿微藻水华
的生态影响提供了新思路 [ 26]。Y oshida等 [ 27 ]通过
此方法还检测到日本 M ika ta湖中铜绿微囊藻消退
时噬藻体数量有明显增加, 而且噬藻体对产毒铜绿
微藻和非产铜绿微藻数量有调节作用。
24 MazG基因
MazG是细菌中的焦磷核苷酸水解酶,起到调节
营养压力应激的作用, 是细胞程序性死亡的调控
子 [ 28]。噬藻体 SPM 2是 Bryan等 [ 29]从英吉利海峡
中分离得到的对海洋聚球藻有感染作用的肌病毒科
噬藻体。基因组约 196 kb, 239个 ORFs中有 20个
与聚球藻基因同源, 其中包括 MazG编码基因。为
了检测 mazG基因在不同水域和不同噬藻体中的存
在情况, B ryan设计了 mazG基因简并 PCR引物。结
果发现 mazG基因在不同水域的聚球藻肌病毒科和
短尾病毒科噬藻体中都有存在,且高度保守。噬藻
体 mazG基因检测证明噬藻体呈全球性分布, 噬藻
体间频繁的进行横向基因转移, 且比对分析显示聚
球藻和绿球藻噬藻体 mazG与其宿主 mazG不聚在
同一簇, 说明噬藻体的 mazG基因并不一定来自其
主要宿主。
3 分子检测技术
为了从分子生物学水平研究噬藻体总量、类群
构成及与宿主的关系,各种分子生物学手段已逐渐
运用到噬藻体研究中。目前, 人们初步建立了以
PCR为核心的分子检测技术。PCR方法通常是将
噬藻体浓缩后对其标志性 DNA片段进行扩增,再用
DNA杂交,变性凝胶梯度电泳 ( DGGE ) ,毛细管电泳
( CDCE60)等高灵敏度的检测方法加以检测, 或是
对 PCR产物基因测序后进行亲缘关系分析。此外,
脉冲场凝胶电泳也在噬藻体基因组分离中得到了应
用。最近,有关对噬藻体实时定量 PCR研究也已有
报道。
31 PCR方法扩增噬藻体保守序列
PCR技术在噬藻体检测中已显示出了巨大的
潜力及广阔的应用前景。 PCR技术现已用于噬藻
体与宿主进化关系,噬藻体种类分布和噬藻体分子
进化图谱等方面。相对其他方法, PCR技术无需对
宿主和病毒进行纯化培养,且灵敏度高、准确性好,
33
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 5期
还能够检测溶原性病毒,通过此方法,人们已经获得
了一些以前用常规方法所不能得到的病毒种群结构
的相关数据。随着研究的深入和噬藻体基因库的不
断丰富,利用 PCR技术对噬藻体进行研究的方法将
日渐完善。
32 脉冲场凝胶电泳 ( PFGE )
水体浮游病毒基因组大小分布范围很广, 基因
组分布情况在一定程度上反应了病毒群落结构的多
样性。脉冲电场凝胶电泳是一项全基因组指纹图谱
分析技术,能根据可识别条带揭示浮游病毒基因组
的大小、丰度以及浮游病毒与环境因素间的相互关
系。W ommack等 [ 30]将 PFGE分离出的不同大小噬
藻体基因组用于 PCR检测,获得了海洋噬藻体种群
结构随季节和地点变化的重要数据。同时还可将分
离获得的条带用特异探针进行杂交分析。 2005年,
刘艳鸣等 [ 11]利用 PFGE对中国武汉东湖浮游病毒
进行了检测。
33 PCR与变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )相结合的
方法
PCR和 PCR结合 DGGE的方法,通常用于分析
特定类群浮游病毒的多样性和动态变化。首先采用
PCR方法扩增某类浮游病毒,包括噬藻体的保守序
列,然后利用 DGGE把不同碱基组成的序列分开,
进而测定浮游病毒的分布的多样性和动态变化。
34 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术是基于核酸链间互补碱基对
的特异性结合,测定核酸碱基顺序同源性的一种现
代技术。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方
法的灵敏性,已使它成为分子生物学中最常用的基
本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选,酶切图谱的
制作, 基因序列的定量和定性分析及基因突变的检
测等。杂交的双方是待测核酸序列及探针 ( probe) ,
待测核酸序列可以是克隆的基因片段, 也可以是未
克隆化的基因组 DNA和细胞总 RNA。近年来, 该
方法己用于噬藻体的检测。
4 展望
自上世纪 90年代,人们发现噬藻体丰富存在于
海洋中,并且其在水生态系统中具有重要作用。由
于各种现代实验技术的运用,如今在噬藻体的生态、
分子生物学以及与蓝藻水华关系的研究上已取得一
些阶段性成果。但是噬藻体的研究范围非常广泛,
从宏观的生态学到分子生物学多个学科都有涉及,
且有待解决的问题也很多, 比如噬藻体数量及其时
空分布、分子进化与遗传多样性、噬藻体的生物学功
能基因 (特别是感染和裂解宿主的功能 )等。未来
将着重于对噬藻体分布、丰度和遗传多样性、与宿主
在分子水平上存在何种依存或制约关系、对初级生
产力和水华的种群结构的调节作用以及实时定量检
测的研究,并将噬藻体作为防治蓝藻类水华的有效
生物调控因子加以利用。在加强噬藻体各方面基础
研究的同时,着重研究其在水华形成与消退过程中
所起的作用。
随着我国经济的发展,人类活动增加,水体富营
养化程度和蓝藻水华发生日益严重, 因此水华生物
防治工作十分紧迫。相对国外而言, 我国对噬藻体
的研究显得十分薄弱,需要研究人员不断努力,把我
国藻类病毒学研究逐步提高到国际水平。我国各海
域及湖泊中噬藻体的时空分布,种群动态,与环境因
子的依存关系以及与各水生生物的相互作用等工作
也已展开,在将来应当是一个研究成果倍出的领域。
参 考 文 献
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