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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
不同寄主来源白假丝酵母菌多态性与耐药性分析
陆合1 黄伟2 罗雪莲2
(1重庆医科大学病原生物学教研室，重庆 400016;2重庆市第三人民医院，重庆 400016)
摘 要: 为研究白色假丝酵母菌的分子多样性情况，探讨 RAPD基因多态性与药物敏感性的关系，在获得病菌分离物的
基础上，应用经筛选的 10 条 10 bp随机引物，对 18 株病菌分离物进行 RAPD分析，利用 UPGMA对结果进行聚类。RAPD扩增
的指纹图谱清晰，带型稳定，多态性丰富，可以作为白假丝酵母菌分型方法，18 株不同来源的菌株可大致分为 6 种亲缘关系。
药敏结果显示导致出现耐药的机制可能并不相同。所以利用 RAPD标记技术在基因水平上对白色假丝酵母菌进行分子分型
和鉴定是可行的。
关键词: 白假丝酵母 RAPD 分子多态性 耐药性
Analysis of Molecular Diversity and Drug Resistance in
Populations of Different Candida albicans
Lu He1 Huang Wei2 Luo Xuelian2
(1Department of Pathobiology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016;2 The Third Peoples Hospital of Chongqing，Chongqing 400016)
Abstract: It was to study molecular diversity of of Candida albicans，and possible relationship between RAPD patterns and anti-
fungal test results. 18 C． albicans isolates were obtained from Chongqing． On the basis of isolation of single spore and the acquisition of
series of the isolates，10 random primers of 10 bp were occupied in analysis of genetic diversity by random amplified polymorphic DNA
(RAPD)． Cluster analysis was performed by Neighbor Joining method． RAPD fingerprints amplified clear bands patterns polymorphisms
can be used as Candida albicans genotyping method，and Dendrogram of UPGMA cluster analysis revealed that 18 isolates of Candida
albicans were divided into 6 groups． The drug susceptibility results showed that the mechanism may not be the same． These results sug-
gest the possibility of using RAPD to genotype and character Candida albicans at genomic level．
Key words: Candida albicans RAPD Molecular diversity Drug resistance
收稿日期:2011-01-06
基金项目:重庆市科委攻关项目(2009AB1077)
作者简介:陆合，硕士，讲师，研究方向:分子微生物;E-mail:yuxufei@ 126． com
传统的病原性真菌诊断分型主要是依靠其形
态、生理生化、细胞学等特征为依据，从实际应用的
角度上看，传统的诊断分型方法容易受外界环境的
影响，满足不了临床的实际需要。近年由于免疫抑
制剂、广谱抗菌药、导管和插管等在临床治疗中的应
用，深部真菌的感染率逐年上升，同时病原菌的变异
和耐药又给临床诊断和治疗带来了困难。分子标记
的出现为快速对病原真菌进行诊断、分型、治疗提供
了依据，且还可以对疾病的分子流行形式、同一患者
反复感染病原菌的来源等进行研究［1 － 3］。
白假丝酵母菌(Candida albicans)属于念珠菌
属，是存在于正常人体皮肤黏膜处的条件致病菌，当
机体免疫能力下降时容易引起机会性感染，也是目
前深部真菌感染最为普遍的病原菌之一［4 － 6］。长期
的进化压力，特别是广谱抗菌药的选择，使白假丝酵
母出现了不同的型别，甚至原来表型相同的也出现
了变异。因此，如何迅速确定白假丝酵母菌的型别，
特别是与耐药性相关的型别，对确定病原株的临床
相关性、掌握其特殊的致病机理，增加对白假丝酵母
菌流行特征的认识具有重要作用。分子分型的方法
有很多，如 RFLP、AFLP、ISSR 等［7 － 9］。本研究在获
得系列病原菌分离物的基础上，借助 RAPD技术，对
来自重庆市不同区县的 18 株白假丝酵母菌分离物
的 DNA多态性与耐药性之间的关系进行研究，了解
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
这些不同来源分离物的遗传分化情况，对丰富白假
丝酵母菌的遗传多样性和耐药性的认识，为病原菌
的鉴定方法选择提供依据。
1 材料与方法
1. 1 分离物来源
供试真菌分别分离自重庆市 11 个区县医院不
同科室所送检的标本，质控菌株为 ATCC10231，所
有的标本经过显色培养基初筛后，利用法国生物梅
里埃公司的 VITEK2-YST 酵母菌鉴定卡进行确认。
分离鉴定为白假丝酵母(Candida albicans)的 18 株
分离物，编号并保存于 － 20℃冰箱中待用。
1. 2 药敏试验
两性霉素 B(AMB)、咪康唑(MIC)、酮康唑
(KET)、氟康唑(FLU)4 种抗真菌药敏纸片从浙江
康泰生物科技公司购买，纸片直径 9. 2 mm，所用平
板为 NCCLS推荐的 RPMI-1640 平板，其他操作方法
和测定严格按公司的药片使用说明进行。
1. 3 白假丝酵母总 DNA的提取
将 18 株分离鉴定的供试菌株接种在萨布罗培
养基上进行复苏，30℃培养 24 h 后，挑取菌落到
YPD液体培养基中进行培养。培养液经 12 000
r /min离心 8 min 后，采用改进过的碱性异硫氰酸胍
沸腾法提取白假丝酵母菌基因组 DNA，－ 80℃保存
备用，具体操作步骤见参考文献［10］。1%的琼脂
糖凝胶上进行电泳检测判断质量。
1. 4 RAPD反应
参照国内外有关病原菌的 RAPD 研究［11，12］通
过预备试验从 120 条引物中筛选出 10 条 RAPD 引
物，它们都具有较好的多态性。120 条 RAPD 引物
由北京三博公司合成，引物序列见表 2。PCR 所用
的 Taq酶购自上海生工，反应总体积为 20 μL，各组
成成分如下:10 × Buffer 2. 0 μL，dNTPs 0. 3 μL，Taq
酶 3 U，随机引物 1. 0 μL 和 40 ng 模板 DNA。PCR
反应程序:95℃预变性 5 min;95℃变性 1 min，36℃
退火 1 min，72℃延伸 1. 5 min;最后在 72℃延伸 8
min，40 个循环。PCR 反应结束后，1%琼脂糖凝胶
电泳，用 VILBER LOVERMLAT 公司凝胶成像系统
照相。所有 RAPD图谱均重复 2 次。
1. 5 数据处理
将琼脂糖凝胶电泳后得到的 RAPD条带看作是
生物的一个性状，将电泳中出现的 DNA条带在样品
中赋值“1”，不出现赋值“0”，组成“0-1”数据表。将
所获得数据输入 DPS 数据处理系统，采用 Nei-Li
(Czekanows)聚类距离中的类平均法(UPGMA)进行
聚类，自动生成各供试样品菌株的遗传聚类图。
2 结果
2. 1 药敏分析
所分离鉴定的 18 株白假丝酵母菌来自重庆市
11 个区县的不同医院科室，其中呼吸内科 5 株、神
经外科 4 株、泌尿内科 4 株、普外 3 株、心内科 2 株。
共获得耐药菌株 6 株，其中 3 株来自呼吸内科、神经
外科、泌尿内科、心内科各一株，4 类抗生素均出现
了耐药菌株。各病株对抗真菌药物的药敏分析见
表 1。
表 1 18 株白假丝酵母菌的药敏试验结果
药物
白假丝酵母菌
敏感(S) 中介(I) 耐药(R)
两性霉素 B(AMB) 16 1 1
咪康唑(MIC) 15 1 2
酮康唑(KET) 16 0 2
氟康唑(FLU) 17 0 1
2. 2 引物筛选和基因组 RAPD分析
预备试验阶段以来自呼吸内科的 5 株白假丝酵
母菌病菌分离物基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩
增，对合成的 120 个随机引物进行筛选，并从中筛选
出 10 条多态性好，扩增条带清晰的引物，用于不同
来源白假丝酵母菌病菌分离物的遗传多样性分析。
引物编号和序列见表 2。
表 2 RAPD所用引物及其序列
引物 核苷酸顺序 引物 核苷酸顺序
S9 TTCCGCCACC O24 TGGACCGGTG
S16 GTTTCCGGCC O46 AAGCCCGAGG
S25 AGTCGTCCCC O101 CTGACCAGCC
S32 GTTTCCGCCA O113 AGGGTCGTTC
S46 GGTGGTCAAG O116 AACGAGTCGG
用筛选出的 10 个引物对分离鉴定出的 18 株白
假丝酵母菌病菌分离物的基因组 DNA 进行 RAPD
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2011 年第 7 期 陆合等:不同寄主来源白假丝酵母菌多态性与耐药性分析
扩增(重复 2 次) ，共扩增出 106 条较为清晰的 DNA
条带，10 条引物对单一分离物进行扩增所获得的条
带数在 2 － 6 条之间，平均每个分离物所扩增出的条
带数为 3，条带多态性丰富。在供试分离物中，不同
分离物所扩增条带数的大小和多少都不一样。同时
不同扩赠引物所扩增出的条带数和条带分布也不相
同，这说明在供试各分离物间存在差异的基础上，所
用的引物不同扩增出来的条带数和位置也会有差
异。图 1 是其中的一张 RAPD扩增产物电泳图谱。
图 1 引物 S16 对供试分离物的 RAPD扩增产物电泳图谱
2. 3 供试分离物间的聚类分析
数据信息处理结果显示，18 株分离物间的相异
系数在 0. 235 25 － 0. 873 61 之间不等，其中不同来
源分离物间的相异系数较大，而来自同一寄主分离
物间的相异系数较小，表明白假丝酵母菌分离物间
的相异程度与不同来源具有一定程度的相关性。
利用软件对扩增后的条带进行聚类分析，聚类
结果见图 2。在 0. 80 的相异系数水平上，18 株供试
分离物聚为 6 个群体，包括 4 个复合群体和两个单
一群体。类 I:包含 1、3、4、7、9、10、12 和 15 分离物;
类 II:包含 2、6、18 和 13;类 III:只有 1 个分离物 8;
类 IV:包含分离物 11、17;类 V:包含 5、16;类 VI:只
有 1 个分离物 14。
图 2 18 个白假丝酵母菌分离物的 UPGMA聚类分析图
从图 2 可以看到，一方面，相同来源的分离物并
没有完全同属一个遗传聚类群中，而是不同程度地
分布于不同的遗传聚类群中;另一方面，同一个遗传
聚类群中又包含了不同来源的分离物。
2. 4 RAPD分析耐药性
对所获得的 6 株耐药性菌株进行 RAPD 分析，
结果发现 RAPD 能将这 6 株耐药性菌株区分开，在
所扩增出的 DNA条带中，没有一条是 6 株耐药菌株
所共有的，条带多态率为 100%，其中耐咪康唑的两
株菌株和耐酮康唑的两株菌株间均出现明显不同的
条带。图 3是其中的一张 RAPD扩增产物电泳图谱，
说明白假丝酵母菌所出现的耐药性变化能够通过
RAPD分析。
图 3 引物 S32 对供试分离物的 RAPD扩增产物电泳图谱
3 讨论
免疫抑制剂、广谱抗菌药、插管等新型医疗技术
的发展给人类的生命健康带来了巨大保证，但同时
也使人类的深部真菌发病率不断增长。为防治深部
真菌病的发生，弄清病原性真菌的遗传标记和致病
机理尤为重要。目前研究病原性真菌遗传标记和致
病机理的方法主要有 3 种［13，14］，一种是形态标记，
第二种是生化标记，第三种是分子标记。前两种标
记方法至今虽仍在使用，但由于标记本身是对结果
的体现，容易出现表型相同也存在差异的情况，从而
导致标记的多态性差、结果不正确［15，16］。分子生物
的发展使得可以对生物的基本分子进行研究，由于
分子标记是对生物核酸物质遗传变异的直接表现，
使分子标记具有多态性高、稳定强等特点［17］。利用
RAPD对所分离的 18 株白假丝酵母菌进行分子标
记，发现 18 株白假丝酵母菌按遗传距离可以分为 6
个群体，这提示白假丝酵母菌存在着较大的基因多
态性，由于所分离的白假丝酵母菌来源于重庆的不
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
同科室的医院，也间接表明白假丝酵母菌的多态性
与菌株的来源有关系。所以利用分子标记不仅可以
研究白假丝酵母菌的型别，还可以监测疾病的分子
流行形式以及同一患者反复感染致病菌的来源。
基因决定表型，白假丝酵母菌出现耐药性的表
型主要是由于其基因出现了变异所致。6 株耐药性
的白假丝酵母菌进行的 RAPD分析表明产生不同耐
药性菌株的原因是因为其基因发生了较大的变异，
这也表明利用 RAPD能对菌株产生的耐药性进行迅
速的诊断［18］。6 株耐药株在 RAPD 中均获得了特
殊条带，同时对 MIC耐药的 2 株菌株也出现了不同
条带，这是否暗示这 2 株对 MIC 产生的耐药原理是
不同的。但由于总共只有 6 株产生耐药性，且耐药
性不尽相同，仅有 2 株同时对 KET耐药，2 株同时对
MIC 耐药，所以我们认为虽然在耐药菌株中发现了
特殊的条带，但是并不能证明那条带就是菌株耐药
的特殊条带，这暗示我们，如果要找到通过分子标记
找到代表不同耐药菌的特殊条带，在固定多态性引
物的同时还需要加大标本量来印证。
虽然 RAPD技术具有重复性差等缺点，但由于
利用一系列引物可使检测区域扩大到整个基因组，
且无须预先知道基因组序列信息等优点，特别是可
以采用相同试验流程提高重复性，所以 RAPD 技术
在许多生物的多态性研究仍然大量应用。
总之，由于对病原菌进行分子标记不仅能区分
病原菌的个体差异，同时还能监测病原菌的分子流
行趋势。随着分子技术的发展，更多简便的标记技
术将应用于微生物的分类中。
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(责任编辑 李楠)
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