全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 2期
QscR基因的调控对菌株M. sp. SDM11
产 L-丝氨酸的影响
孔庆胜 1 张向阳 1 韩晓琳 1 林强2 董全林 2
( 1济宁医学院,日照 276826; 2华中科技大学,武汉 430071)
摘 要: M. sp. SDM 11是一株能以甲醇为唯一碳源生长的细菌,初步发酵检测发现能转化甘氨酸为 L-丝氨酸。QscR基
因产物是甲基营养菌中丝氨酸循环的一个转录调控关键因子, 根据在 GenBank中已报道的 QscR基因序列 (登录号: NC _
012988. 1)设计引物,以 M. sp. SDM 11的染色体 DNA为模板, 利用 PCR扩增得到一大小为 987 bp的 Q scR基因,将该基因克隆
到广泛宿主载体 pLAFR3上, 在帮助质粒 pRK2013的介导下, 利用三亲本结合使其导入到菌株 SDM11中构建重组菌株
SDM12。对 SDM12进一步研究发现,重组菌株中与 L-丝氨酸合成相关的关键酶丝氨酸羟甲基还原酶 ( SHMT)的酶活比野生
型菌株 SDM 11要低,约为野生型菌株的 70%左右, 另一个酶 羟基丙酮酸还原酶 ( HPR )的酶活力也只有野生型的 75%。
进一步将菌株进行产 L-丝氨酸研究,结果表明, 重组菌的产 L-丝氨酸能力也明显降低,约为野生型菌株的 67%左右。
关键词: QscR基因 重组菌 L-丝氨酸
The Influence of QscR Gene Regulation on the Production of
L-serine by the Bacterial StrainM. sp. SDM11
Kong Q ingsheng
1 Zhang X iangyang1 H an X iaolin1 L in Q iang2 DongQuanlin2
(
1
J ining M ed ical University, Rizhao 276826;
2
Huazhong University of Science and T echnology, W uhan 430071)
Abstrac:t M. sp. SDM11 is a bacter ium liv ing on m ethano l as the so le carbon source. It is found th rough tenta tive ferm enta tion
inspections to be capab le o f transform ing g ly cine into L- ser ine. M. sp. SDM 11 is a key determ inant fo r transform ation regu lation in the
circu la tion o f g lyc ine in m ethy lotroph ic bacte ria. The research designed prim ers acco rd ing to the Q scR gene series reported in Gen-
Bank, took the chrom osom e DNA o fM. sp. SDM11 as the mo ld, acqu ired a 987 bp Q scR gene through PCR enlargem en t, cloned the
gene into the broad-host-range vector pLAFR3 and under the gu ide o f favorab le g ra in pRK2013 introduced it into the stra in SDM 11 by
comb in ing the three parent spec ies to recomb ine SDM12. A further study on SDM 12 show ed the enzyme activ ity o f SHMT, the key en-
zym e related to L- ser ine synthesis, w as lower than tha t in w ild-type stra in SDM11 w ith on ly 70% o f the la tters degree. The enzym e ac-
tiv ity of HPR w as also about 70% o f thew ild- type. The results of further studies on the stra ins production o f L-serine showed the re-
comb inant s ab ility to produce L-ser ine was obv iously low ered a t about 67% of the w ild-type stra in.
Key words: QscR gene Recomb inant L-ser ine
收稿日期: 2010-07-07
基金项目:山东省教育厅资助项目 ( J07YD16)
作者简介:孔庆胜,男,教授,博士,研究方向:分子酶学; E-m a i:l jnyxykqs@ 163. com
L-丝氨酸属生糖氨基酸,是组成蛋白质的 20种
基本氨基酸之一。 L-丝氨酸虽属于非必需氨基酸,
但具有许多重要的生理功能和作用。在世界氨基酸
生产行业中, L-丝氨酸是工业化生产难度较大的氨
基酸。由于技术原因, 我国目前还不能大规模的生
产 L-丝氨酸, 国内使用的 L-丝氨酸基本靠国外进
口。目前 L-丝氨酸的生产方法主要有蛋白质水解
法、化学法和微生物发酵法 3种方法。L-丝氨酸在
国内主要采用蛋白质水解法进行生产, 产量低、效率
低、成本高, 在国外生产 L-丝氨酸应用较多的方法
是利用微生物发酵生产 [ 1- 3 ]。
在已经报道的利用微生物发酵生产 L-丝氨酸
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
的系统中, 甲基营养型细菌产 L-丝氨酸的产量较
高,而且所用的甲醇和甘氨酸均为廉价原料,因此可
以获得更高的利润。今后的发展趋势是在现有的甲
基营养型细菌菌株发酵生产 L-丝氨酸的水平上,进
一步利用生物技术手段构建高产 L-丝氨酸基因工
程菌, 提高甲基营养型细菌产 L-丝氨酸的产量。
1 材料与方法
1. 1 菌株与质粒
菌株 M sp. SDM11为本实验室分离 [ 4] , 质粒
pRK2013、大肠杆菌 DH5以及质粒 pLAFR3均为本
实验室保存。
1. 2 培养基及生长条件
大肠杆菌生长用 LA、LB培养基,于 37 培养。
菌株 SDM 11参照文献 [ 4]中的培养基, 于 32 培
养。抗生素根据需要加入,使用浓度 ( g /mL)分别
为: Amp, 200; Cm, 10; Km, 50。
1. 3 酶及试剂
各种限制性内切酶、蛋白酶 K、T4 DNA连接酶
及其缓冲液、DNA纯化 /回收试剂盒购于大连宝生
物工程公司, PCR所用 DNA聚合酶及其缓冲液购自
TaKaRa和 MB I公司,其他普通试剂均为分析纯。
1. 4 方法
1. 4. 1 DNA操作及序列分析 质粒 DNA提取、限
制性内切酶、质粒去磷酸化、DNA片段回收、DNA连
接及转化、总 DNA提取、三亲接合试验等均按标准
程序进行; PCR引物由上海生物工程公司合成;
DNA序列测定由大连宝生物工程公司完成; DNA序
列分析由 NCBI中心提供软件在线完成。
1. 4. 2 Q scR基因的克隆 根据 NCB I中已报道的
M ethy lobacterium ex torquens DM4的 QscR基因序列
设计 PCR引物, 并在上游引物 5末端加入 BamH I
限制性酶切位点和 3个保护性碱基 CTG, 为调整 GC
含量与 Tm值,在酶切位点后增加 3个碱基 ATG,下
游引物 5末端加入限制性酶切位点 H ind 和 3个
保护性碱基 CGC。经 DNAStar软件分析,具有较好
的特异性。引物由大连宝生物工程公司合成, 引物
序列为: 正向引物 Pf为 5-CTGGATCCATGCGCAA-
TCTTTCGCTCA-3,下划线处为 BamH I酶切位点;
反向引物 Pr为 5-ATAAGCTTTCATTCGCCAGCCTC-
GGCC-3,下划线处为 H ind 酶切位点。以 SDM 11
的染色体 DNA为模板, PCR的反应程序为 96 , 3
m in; 95 40 s, 57 30 s, 72 1 m in, 30个循环;
72 延伸 5 m in。反应结束后, 取出反应混合液 10
L进行电泳,检测是否扩增到目的片段。电泳检
测正确后, 将该 DNA片段连接到 pGEM T-easy载
体上, 并送至大连宝生物工程公司进行测序验证。
1. 4. 3 重组菌株 SMD12的构建 将测序验证正确
的 Q scR基因用限制性内切酶 BamH I与H ind 从
克隆载体上切下来并回收纯化, 连接到同样用
BamH I与 H ind 消化后的 pLAFR3载体上 (命名
为 p-Q ) ,并导入到菌株 DH5中进行进一步验证。
将菌株 SDM 11、p-Q /DH5、2073 /BL21培养到对数
生长期后,按 211的比例混合离心, 生理盐水洗 3
次, 点到平板的滤膜上, 32 共培养 3 d,进行三亲本
结合,然后稀释涂布到含 Nm和 Tc的平板上进行筛
选, 得到重组菌株, 挑取任意几个单菌落接种到液
体培养基中摇床培养,并提取质粒进行 PCR扩增和
酶切验证,验证正确的重组菌命名为 SDM 12。
1. 4. 4 SHMT酶活检测 [ 5] 酶反应体系 ( 1 mL)中
含: 0. 05mmo l/L DL-苯基丝氨酸, 0. 05mmo l/L磷酸
吡哆醛, 0. 03% CTAB,适量的细胞裂解液, 50mmo l/L
磷酸钾 Buffer( pH 8. 0), 用水补足剩余体积。混匀后
在黑暗条件下,置于 37 振荡反应 4 h测量上清的
A279值。根据 A 279-苯甲醛浓度回归方程确定反应液
中苯甲醛浓度,酶活定义:在 37 下, 2 mL反应体系
中, 每小时产生 1 mo l苯甲醛的量为 1个酶活单位
( U )。
1. 4. 5 HPR的酶活检测 [ 6] 酶反应体系 ( 1 mL)中
含: 不同 pH值的 MOPS buffer, 2. 0 mmo l/L羟基丙
酮酸锂盐, 3. 0mmo l/L NADPH, 340 nm下测定初始
吸光值 A,加入适量的细胞裂解液后, 在一定条件下
反应,每隔 15 s测定 A值, 连续测定 3 m in, 以吸光
值 A对时间作图,取反应最初线性部分计算吸光值
减少值 A, 根据酶活定义算出酶活。得出最佳温
度与最佳 pH 值后, 定义酶活单位, 即在 28 ,
pH 55条件下 1 m in内氧化 1 mol NADPH所需要
的酶量定义为 1个酶活单位 (U )。
1. 4. 6 重组菌株产 L-丝氨酸检测 将菌株培养到
对数生长期时, 离心菌液, 收集细胞, 参照文献 [ 7]
进行静息细胞反应。反应体系中 L-丝氨酸的定量
170
2011年第 2期 孔庆胜等: Q scR基因的调控对菌株M. sp. SDM11产 L-丝氨酸的影响
采用日本日立公司的氨基酸自动分析仪 H itach i L-
8800,色谱条件:标准分析柱 4. 6 mm 60. 0 mm,反
应柱温度: 57. 0 ,反应器温度: 136. 0 。
2 结果
2. 1 SDM 11总 DNA的提取与 Q scR基因的克隆
利用碱裂解法提取菌株 SDM 11的染色体 DNA
(图 1) , 根据 NCB I中已报道的 M ethylobacterium ex-
torquens DM4的 QscR基因序列设计 PCR引物 ( P r、
Pf),以稀释好的染色体 DNA为模板, PCR扩增得到
一条 1. 0 kb左右大小的 DNA片段 (图 2) ,将该片段
利用试剂盒回收连接到 pGEM T-easy载体上, 送至
大连宝生物工程公司测序,经序列分析 (图 3)发现,
该片段中包含了一个完整的开放阅读框。经过
BLA ST 软件分析, 发现与已报道测序的 M ethyl-
obacterium ex torquens DM4的 Q scR基因在核苷酸水
平上同源性达到 98% , 在氨基酸水平上同源性
达 99%。
M. DNA M arker; 1.提取的
SDM11染色体 DNA
图 1 SDM 11染色
体 DNA
M. DNA M ark er;
1. Q scR基因片段
图 2 PCR扩增的 QscR
基因片段
2. 2 重组菌株 SMD12的构建
将连有 QscR基因的 pGEM T-easy载体经 BamH I
和H ind酶切后,回收 Q scR基因片段, 连接到经相
同酶切的表达载体 pLAFR3上, 利用电脉冲转化法
导入到大肠杆菌 DH5感受态细胞中,在含 Tc的平
板上筛选白色克隆子,进一步液体培养,并提取质粒
酶切 (图 4)及 PCR鉴定,连接正确的转化子命名为
p-Q /DH5。
将菌株 SDM 11、p-Q /DH5、2073 /BL21培养到
对数生长期后,进行三亲本结合, 在含双重抗生素的
平板上初步筛选重组菌株, 进一步以 PCR扩增
pLAFR3上的 Tc基因的办法,确认重组质粒 p-Q是
否转导至 SDM 11中, 验证正确的重组菌株命名
为 SDM 12。
2. 3 SHMT与 HPR的酶活检测
将野生型菌株 SDM 11和 SDM 12菌株均培养到
对数生长期时 (培养基中只含甲醇为唯一碳源 ), 收
集细胞,利用超声波分别破碎野生菌株和重组菌株
细胞, 14 000 r/m in下 4 离心, 后得到的上清液为
待测的粗酶液, 按照 1. 4. 4中表述的程序与反应
体系,重复 3次, 分别检测 SHMT、HPR的酶活力。
结果表明,重组菌株 SDM 12的 SHMT与 HPR酶活
力均比 SDM 11的有所下降, 在 SDM 11中 SHMT与
HPR酶活力分别为 (每 mg湿细胞 ) 25 U和 86U,而每
mg SDM 12湿细胞中 SHMT与 HPR酶活力只有 17. 4 U
和 64. 8 U。
2. 4 菌株产 L-丝氨酸检测
将菌株置于只含甲醇为唯一碳源的培养基上进
行摇床培养,达到对数生长期时收集细胞,加入到反
应体系中进行静息细胞反应。
收集氨基酸发酵液用氨基酸分析仪对 L-丝氨酸的
含量进行分析。菌株 SDM 11的反应液中 L-丝氨酸含
量为 4. 6 0. 2 mg /mL, 而 SDM 12中 L-丝氨酸含量为
2. 7 0. 3mg /mL,重组菌 SDM 12与原始菌株 SDM 11相
比, L-丝氨酸产量减少了 40%左右。
上述结果表明, 在增加调控基因 QscR的拷贝
数后,重组菌株 SDM 12的产 L-丝氨酸的能力明显比
野生型菌株 SDM 11的要低。
3 讨论
QscR是一个群传感调节基因, 在很多微生物中
都存在,是甲基营养菌的丝氨酸循环途径中的酶转录
调节因子,该基因表达量很低, 但对丝氨酸循环中的
关键基因簇的基因表达起到重要的负调节作用 [ 8, 9 ],
为研究 QscR基因的表达对菌株生产 L-丝氨酸是否
有影响,本研究采用低拷贝广泛宿主载体 pLAFR3[ 10]
作为表达载体以增加菌株的基因拷贝数。
丝氨酸羟甲基转移酶 ( SHMT)是含有丝氨酸碳
循环的大多数微生物体内的一个传统和关键酶,是甲
基营养微生物代谢所不可缺少的,它能催化丝氨酸和
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 2期
图 3 SDM 11中 Q scR基因的核苷酸序列
M. DNA Marker; 1. p-Q 质粒; 2. p-Q质粒经 B amH I和
H ind 双酶切产物
图 4 重组载体 p-Q的酶切验证
甘氨酸的相互转化 [ 11] ; 羟基丙酮酸还原酶基因
( hpr)编码的羟基丙酮酸还原酶能催化羟基丙酮酸
盐还原成甘油酸 ( React ion 1) ,甘油酸进一步代谢为
乙醛酸,在含丝氨酸循环的甲基营养菌中作为循环
中的第 3个酶基因 [ 12, 13 ]。所以本研究主要检测该
两个酶在重组菌中的酶活力情况,结果表明,酶活力
比野生型菌株都有不同程度的下降。对菌株进行产
L-丝氨酸能力检测发现, 重组菌株产 L-丝氨酸的能
力也只有野生型菌株的 67%。研究结果表明, Q scR
基因大量表达会抑制 L-丝氨酸的生产,下一步可以
将 Q scR基因进行突变, 减少对 L-丝氨酸生产的负
调控作用,以提高菌株产 L-丝氨酸的能力。
参 考 文 献
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