全 文 ：第4卷第1期
2006年2月
生物加工过程
ChineseJoumalofBi叩mcessEn舀neering
Feb．2006
·39·
产1，3．丙二醇基因工程菌发酵条件的研究
韦旭钦1’2，陈发忠2，罗兆飞2，韦宇拓1，周文广1，黄日波1’2
(1．广西大学 生命科学与技术学院，发酵与酶工程研究所，南宁530005；
2．广西南宁中诺生物工程有限责任公司，南宁530003)
摘要：利用途径工程的方法，将来源于克雷伯氏茵(地h据耽p聊啪砒)的甘油脱水酶基因如胡和1，3．丙二醇氧
化还原酶基因抛r构建成多顺反子重组质粒pSE一幽口吕讹r并在大肠杆菌JM109中进行表达，在大肠杆菌中构建
一条新的产1，3．丙二醇代谢途径。研究表明，重组菌株JM109／pSE一如出抛r在微好氧条件下，尝试用廉价的乳糖
为诱导物、维生素B。：为辅酶，可以将甘油转化为1，3．丙二醇，产量达15．34g／L，甘油转化率为35．7％，对低成本生
产1，3．丙二醇作了有益的探索。
关键词：1，3一丙二醇；重组菌；发酵条件
中图分类号：Q78；Q815 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2006)0l一0039一05
Study0fthefenmntati仰conditio璐forthere咖龇舱nt
IIlicroo理簪lllismprodllcing1，3一propanediol
WEIXu—qin，C皿NFa·zhong，LUOZha0-fei，WEIYu—tuo，ZHOUWen-guang，HUANGRi—bo
(1．I璐tituteofFeHnentationaJldEnzyInee画neeIingGuangⅪu面verS蚵，NaJln堍530005，C}li眦；
2．Sinoz)，IIleBiotechCo．LtdKeyllaIlAv，NaIlIling530004，China)
Abs柏ct：Basedonthepdncipleofthepathwayengineedng，anovelp t}1wayofproducing1，3一pIDp￡mediol
wasbuiltinE．c0如．ne妣廖geneencoding甜yceroldehydratase(DHAB)andme讹rgeneencoding1，
3一propanediolox doreductase(DHAT)wereclonedfrom觑夙玩如p聊删n池aJldt}leniIlsertedintoexpres—
sionvectorpSE380toobtainrec伽lbinantpolycistronplasmidpSE—d阮醪d阮丁．nispolycistmnwast瑚s—
fomledint0E．c0屁JMl09．Theresultshowedt}lattherecombinantmicmo曙anismJMl09／pSE一讲m吕d阮丁
couldconVertglycemlto1，3一pmpanedioldirectlyundert}lein也lcedconditionsoflactoseandVit锄inB12in
mefennentor，andmema)【imalconcentmtionof1，3-pIUpaJlediolwas15．34∥Lat60h，conversionmteof
glycerolwas35．7％underthmicroaembiccond tion．
K．eywords：1，3-pmpanediol；recombinantrniemo学 ism；fernlentconditions
1，3．丙二醇(1，3．pmpanedi01，简称1，3一PD)是一
种重要的化工原料，可用作溶剂、抗冻剂或保护剂、
精细化工原料以及新型聚酯——聚对苯二甲酸丙二
醇酯(阿)和聚氨酯的单体。最近研究表明，肿是
一种新型聚酯材料，可用于地毯、工程塑料、膜及服
装材料，因此全世界各大公司都竞相研发和试验以
探索成本更低的1，3一丙二醇工业化生产途径。目前
主要用化学方法合成1，3．PD，此方法需要在高温、
收稿日期：2006加1．10
基金项目：国家“863”高科技资助项目(2003AAool039)
作者简介：韦旭钦(1973一)，男，工程师，博士研究生，研究方向：微生物生物技术。
联系人：黄日波，教授，E．槲I：riboh@public．nn．野．cn．
万方数据
·40· 生物加工过程 第4卷第1期
高压及贵重催化剂存在的情况下才能实现。因此，
设备投资大，技术难度高，产品分离纯化困难，特别
是催化剂的制备较难，且产生c0等废气污染环境。
而微生物发酵法生产1，3．PD具有条件温和、操作简
单、副产物少、绿色环保等优点，所以这方面的研究
成为当前国内外研究的热点[1’2j。
传统的微生物发酵法通常是以克雷伯氏菌
(觑如据玩p珊“啪n池)、丁酸梭状芽孢杆菌(c20￡而d如
6Ⅲ俪“m)等天然菌进行甘油的厌氧发酵生成
1，3．PD。但该方法存在生产周期较长、甘油转化效
率低、原料成本高等问题，是实现大规模应用前需要
克服的障碍bj。利用基因工程的方法将甘油转化为
1，3．PD的相关酶即甘油脱水酶基因如以和1，3．丙
二醇氧化还原酶基因妣r在大肠杆菌中进行表达
的研究在国外早有报导14’5j。在此基础上结合代谢
工程的原理和方法，以丰富且廉价的碳水化合物资
源(如淀粉、葡萄糖等)为底物发酵生产1，3一PD的研
究取得很好的突破[6J。利用工程菌生产1，3一PD具
有生产工艺简单、成本低廉、副产物少、产物分离简
单等优点，近年来已越来越受到国内外研究人员的
重视‰]。
本实验室从2003年起先后在大肠杆菌中成功
地表达了d凇和妣丁基因一’8j，在利用基因工程菌
生物转化甘油生成l，3一PD的研究中取得良好的进
展。本实验侧重于重组菌株JM109／pSE．砒oB如or
在以甘油为底物生成1，3．PD发酵条件的探索，在微
好氧条件下尝试以廉价的乳糖代替I即G(异丙基硫
代．口一D．半乳糖苷)作为诱导物、以维生素B。：代替辅
酶B∽并对其工艺特点和发酵条件进行初步的研
究，为规模化生物合成1，3．PD作有意义的探索。
1材料和方法
1．1菌种与仪器
重组质粒pSE380．如柏和pSE380．讹r由本实
验室构建[78|，大肠杆菌JMl09为本实验室保存。
BeckⅡ姗Du640紫外可见分光光度器，用于600
啪处进行细胞浓度检测。
发酵罐采用全自动的德国产品，型号为B．Braun
BiotechBiosTATDL30。
1．2培养基
LB培养基(质量分数)：蛋白胨1．0％、酵母膏
0．5％、NaCll．O％，pH7．0，用于细菌培养；
种子培养基：蛋白胨1．6％、酵母膏1．0％、Nacl
1．0％，pH7．0，培养基中加入的氨苄青霉素(Amp)终
质量浓度为100腭／mL；
发酵培养基：参照参考文献[5]，每升含：甘油
5g，葡萄糖5g，乳糖5g，Na2m氇6g，KH2P03 g，
NH4cl2g，NaCl0．5g，M庐042mmoL，酵母粉5g，高压
蒸汽灭菌；氨苄青霉素100峭，采用微滤膜过滤除菌；
补料培养基：每升含甘油20％，葡萄糖2．O％，
乳糖2．O％，115℃灭菌15rnjn；
维生素B1’：添加量为发酵培养基终质量浓度
10mg／L，采用微滤膜过滤除菌；
微量元素组分见参考文献[9]，采用微滤膜过滤
除菌。
1．3含多顺反子的重组质粒的构建及产1。3．PD的
代谢途径
首先用PCR的方法从重组质粒pSE380—d阮r上
扩增出含RBs(核糖体结合部位)序列的砒。丁基因，
连接于重组质粒pSE380．抛君的多克隆位点中，构
建由单个启动子￡rc带动两个基因表达的多顺反子
(见图1)，重组质粒命名为psE．砌口吕抛，，酶切鉴
定含该多顺反子的重组质粒的正确性后，将它转化
到大肠杆菌JMl09中进行表达，尝试在大肠杆菌中
构建一条新的类似于克雷伯氏菌(K．p珊u釉凡池)代
谢甘油产生l，3一PD的代谢途径[1踟(见图2)。由于
在此多顺反子中d矗胡和d玩丁这两个外源基因含有
各自的RBs序列以及翻译起始和终止信号，所以能
独立翻译出甘油脱水酶(DHAB)和1，3．丙二醇氧化
还原酶(D}LAT)两个异源蛋白(实验结果没有公开发
表)。所运用的基因操作、质粒提取、大肠杆菌感受
态细胞制备和转化等操作按参考文献[11]进行。
RBS2
图1含妣B基因和妣r基因多顺反子构建图
Fig．1ConstmctionofreconlbinantplasIIlid
万方数据
万方数据
·42· 生物加工过程 第4卷第1期
赖辅酶B，：作为辅酶才能产生活性L4’5J。由于辅酶
Bl：价格昂贵而无法进行大规模应用，加上大肠杆菌
不能从头合成辅酶B∽只能在以钴啉醇酰胺物质作
为前体并在诱导条件下启动自身的c06调节子合成
辅酶B∞所以在用重组大肠杆菌表达甘油脱水酶发
酵生成1，3．PD过程中，在培养基中加入终浓度为10
nlg／L的维生素B∽可以作为合成辅酶B，：的前体，
使甘油脱水酶得以重新激活[10’1213]。本研究通过更
加廉价的维生素B。：代替辅酶B。：进行发酵，结果如
图4，有1，3一PD产生和积累，但产量比较低。
一·一P02；一一一∞‰；一◆一VBl2(m∥L)；
一‘～pH；一V—G1yceml(％)；一口一l，3一PD(∥L)
图4重组菌株在20L发酵罐中以37℃进行微好氧发酵产
生1，3一PD相关的培养条件。细胞生长以及产物形成的
曲线图
Fig．4Timecourse0fmecultureconditionS、ceUgro砒handpmd—
uctfoⅡnationn20一litermicroaembicfennentationof1。3-
pmpanediolbyt11erecombinaIltsⅡ伍nat37℃
2．4表达载体pSE380的￡rc启动子
在大肠杆菌中高效地表达异源蛋白，必须将相
关基因置于可诱导的强启动的控制之下¨4|。在表
达载体pSE380中，含有由启动子蹴改组而来并可
用InlG诱导的杂交型强启动子￡rc[15I。本实验将外
源妣B基因和妣r基因构建由单个启动子￡rc带
动的多顺反子表达质粒，它可以在大肠杆菌中进行
I唧诱导表达，并能独立翻译出具有很高生物活性
的DHAB和DHAT两种异源蛋白(实验结果没有发
表)。由于1wG对细胞具有毒性并且价格昂贵，限
制了它在工业化生产中的应用，Hsih等[161报导可以
用乳糖作为诱导物来代替1w．G对启动子￡僦和纰
进行诱导。本次发酵首次补加乳糖而不是唧作
为诱导物，对基因的诱导表达有一定的效果。从图
4可以看出，重组大肠杆菌培养10h后开始有
1，3．PD产生，并呈直线上升趋势，到60h时1，3一PD
产量达到最高值。
2．5氧对转化的影响
一般情况下，氧的存在不利于1，3．PD产生，因
为氧引起代谢途径中两个关键酶，也是本研究构建
重组质粒所表达的两个酶即DHAB和DHAT失
活n718]。但在厌氧条件下，并不利于大肠杆菌宿主
的生长。为了解决有氧对酶失活的影响和厌氧对宿
主生长不利的矛盾，我们在上罐发酵过程中于前期
供给少量的氧，可以得到较高的菌体生长密度，即发
酵24h时菌体OD咖为35．2，在发酵后期的转化阶
段，停止通人空气(也不补加H2和N2)，这样就可以
将溶氧控制在30％以下。研究表明在微氧条件下，
所采用的重组菌依然能转化甘油生成1，3．PD，如图
4。
2．6甘油浓度对转化的影响
甘油脱水酶不仅对氧敏感而容易失活，而且在
有甘油存在时，它也会发生自杀失活(suicideinacti．
vation)，当有激活蛋白、ATP、Mn2+或M孑+、辅酶等因
子共同作用下可以将失活甘油脱水酶重新激活¨刮；
也有研究表明，以含有克雷伯氏菌妣调节子的重
组大肠杆菌进行厌氧甘油发酵时，过高的甘油浓度
会增加3．磷酸甘油(G3P)的积聚从而明显抑制菌体
的生长和1，3．PD产生，当培养基中甘油质量分数达
到0．5％时，开始呈现出这种影响¨9。。由于甘油浓
度过低也不利于l，3．PD的生成㈨J，所以在发酵过
程的中后期通过匀速流加20％(质量分数)的甘油，
使甘油维持在1．0％(质量分数)左右，有利于l，3．
PD的生成。同时补加适量的葡萄糖作为菌体生长
的优先碳源，以提高甘油的转化率。
3结论
在大肠杆菌JMl09中成功地用克雷伯氏菌
(K．p聊啪n妇)的甘油脱水酶基因讹曰以及1，3．
丙二醇氧化还原酶基因砒r进行了共表达，所构
建的工程菌能转化甘油产生l，3．PD，使原来不产1，
3一PD的大肠杆菌能发酵甘油生成1，3．PD。对所构
建的重组菌JM109／psE．d玩口d玩r进行小体积发酵
研究，尝试在不添加IPI℃而是用廉价的乳糖作为诱
导物、以维生素B，：代替昂贵的辅酶B。：进行微好氧
发酵的探索。初步研究结果表明，l，3一PD产量为
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