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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
产异丁醇大肠杆菌工程菌的构建
林丽华 郭媛 庞浩 黄日波
(广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室 国家非粮生物质能源工程技术研究中心
广西生物炼制重点实验室，南宁 530007)
摘 要: 酮酸脱羧酶是异丁醇生物合成的关键酶，而大肠杆菌中没有此基因。将乳脂乳球菌 NIZO B1157 的 2-酮酸脱
羧酶基因 kdcA克隆到非生产菌株大肠杆菌中，同时串联表达与前体物质酮酸相关的 alsS、ilvC和 ilvD基因，构建了串联表达
质粒 pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA。大肠杆菌工程菌成功表达了 4 个基因，并能利用葡萄糖发酵产异丁醇，发酵 24 h 后最高产
量为 3 g /L。
关键词: 大肠杆菌 异丁醇 kdcA基因 重组菌
The Construction of Recombinant E． coli Producing Isobutanol
Lin Lihua Guo Yuan Pang Hao Huang Ribo
(State Key Laboratory of Non-food Biomass and Enzyme Technology，
National Engineering Research Center for Non-food Biorefinery，Guangxi
Academy of Sciences，Guangxi Key Laboratory of Biorefinery，Nanning 530007)
Abstract: Keto acid decarboxylase is the key enzyme of biosynthesis of isobutanol． The 2-keto acid decarboxylase gene kdcA from
L． lactis subsp． cremoris NIZO B1157 was cloned to non-native producer E． coli． The alsS，ilvC，ilvD genes were excessively expressed at
the same time to increase offer of precursor 2-keto acid． The recombinant plasmid pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA was transformed into E．
coli BW25113． The recombinant E． coli BW25113 was fermented in the M9 /glucose media and the maximal concentration of isobutanol
was 3 g /L at 24 h．
Key words: E． coli Isobutanol kdcA gene Recombinant strain
收稿日期:2011-03-29
基金项目:国家科技支撑计划课题(2007BAD75B05) ，桂科攻(0992022-1) ，广西科学院基本科研业务费(10YJ25SW09)
作者简介:林丽华，女，硕士，研究方向:微生物学;E-mail:linlihua@ gxas． cn
通讯作者:黄日波，教授，博士生导师;E-mail:rbhuang@ 163． com
近几年来，随着不可再生性能源的逐渐消耗，可
再生性能源成为各个国家甚至各个地区的研究热
点［1］。目前生物燃料以燃料乙醇为主，但乙醇并不
是一个理想的生物燃料，而高级醇(C4 和 C5)有接
近汽油的能量密度，不吸湿，而且具有低挥发性，其
腐蚀性也较乙醇低。与乙醇不同，异丁醇可完全取
代汽油，并且由于生物异丁醇与乙醇的生产工艺较
为相似，现有的燃料乙醇生产设施稍微改造便可转
而生产生物异丁醇，因此生物异丁醇的市场潜力较
为巨大，可作为一种新型生物燃料;此外，异丁醇的
下游市场也很广泛［2］。由于过去生产异丁醇主要
是依靠化学法，需要消耗大量的石油。随着石油价
格持续上涨和储量持续减少，以及石油化工所造成
的环境污染问题，使人们更加意识到生物合成异丁
醇具有良好的发展前景，能利用发酵法生产被视为
生物燃料替代汽油的可再生能源异丁醇是目前市场
及人们极为期待的［3］。发展生物异丁醇作为运输
动力系统燃料，有利于中国减少对进口石油的依赖，
帮助我国进行能源结构调整，是国家新能源战略的
组成部分。
将控制溶剂产生的代谢途径引入遗传操作成熟
的大肠杆菌，在一定范围内改变大肠杆菌的代谢途
2011 年第 8 期 林丽华等:产异丁醇大肠杆菌工程菌的构建
径，使大肠杆菌能够产生异丁醇，为构建高产异丁醇
基因工程菌提供了新的思路。2009 年，美国的 Liao
教授［4］利用代谢工程手段对大肠杆菌进行了改造，
使其能够利用非发酵途径生产长链醇类，如异丁醇
(图 1)。非发酵途径生产醇类的策略:2-酮酸是氨
基酸生物合成途径中的中间体，这些代谢物可被 2-
酮基酸脱羧酶(KDCs)通过广泛的底物范围转化为
醛，然后被醇脱氢酶(ADHs)转化为醇类。利用这
项策略，只需非母本宿主代谢的两个步骤，通过氨
基酸生物合成途径利用 2-酮酸作为中间体可以生
产出各种醇类生物燃料。而氨基酸生物合成途径
能够产生各种各样的 2-酮酸，如缬氨酸生物合成
途径产生的 2-酮异戊酸可以就作为生产异丁醇的
基材。
本研究将乳脂乳球菌 NIZO1157 的 2-酮酸脱
羧酶基因 kdcA 克隆到大肠杆菌中，同时串联表达
与前体物质酮酸相关的 alsS、ilvC、ilvD 基因(图
2) ，构建串联表达质粒 pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA，
旨在将非生产菌株大肠杆菌改造成产异丁醇的工
程菌。
图 1 在大肠杆菌中导入新的代谢途径
以酮酸途径合成异丁醇
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌种和质粒 乳脂乳球菌(Lactococcus lactis
cremoris NIZO1157)，购自荷兰 NIZO food research cen-
ter。大肠杆菌 BW25113 为基因缺失型突变株，本实
验室构建。枯草杆菌(B． subtilis) ，本实验室保藏。
质粒 pSTV29，购自宝生物公司。
图 2 相关表达基因
1． 1． 2 酶和试剂 限制性内切酶 SphⅠ、Sal I、
BamH I、Sac I，小牛肠碱性去磷酸化酶及 T4 DNA连
接酶为 MBI Fermentas产品;PCR 产物纯化试剂盒、
胶回收试剂盒为上海生物工程有限公司的产品;异
丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自 Calbiochem 公
司;酵母提取物和胰蛋白胨为 Oxoid 公司产品;其他
试剂为国产分析纯。
1． 1． 3 培养基和培养条件 大肠杆菌培养和转化
子筛选采用 LB培养基，发酵采用 M9 培养基［M9 +
0． 2 mol /L glucose + 0． 5% (W/W)yeast extract +
0． 1%(V /V)Trace Metal Mix A5］［4］，培养条件为
37℃、250 r /min。
1． 1． 4 引物 根据 GenBank 报道的基因序列设计
PCR反应引物(表 1，引物 1、2、3 和 4 分别用于扩增
带有不同长度 SD 序列的基因片段，下划线部分为
酶切位点)。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
表 1 PCR反应引物
引物 基因 序列(5→3) 限制性内切酶 来源
1-s
1-as
2-s
2-as
3-s
3-as
4-s
4-as
alsS
ilvC
ilvD
kdcA
GCCTGCGCATGCCACAAAAGCAACAAAAGA
ACGCAGTCGACCTAGAGAGCTTTCG
ACGCAGTCGACAGGAAACAGACCATGGCTAACTACTTCAAT
CGGGATCCTTAACCCGCAACAGCAATAC
CGGGATCCAGGAGATATACCATGCCTAAGTACCGTTC
GCCGAGCTCTTAACCCCCCAGTTTCGATTTATC
GCGAGCTCAGGAAACAGCTATGTATACAGTAGGAG
GCCGAGCTCCTATTTATTTTGCTCAG
Sph I
Sal I
Sal I
BamH I
BamH I
Sac I
Sac I
Sac I
Bacillus subtilis
E． coli BW25113
E． coli BW25113
Lactococcus lactis cremoris
NIZO1157
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA的提取与质粒转化 参考文献
［5］进行操作;DNA 酶切、去磷酸化、连接，质粒酶
切、去磷酸化和连接参照产品说明进行。
1． 2． 2 目的基因的 PCR 扩增 反应程序:94℃ 2
min;94℃ 30 s，54 ℃ t1 min，72 ℃ t2 min，30 个循环;
72℃ 10 min。引物 1 － 4 的退火时间 t1和延伸时间
t2分别是 53℃ 1． 5 min，58℃ 1． 5 min，62℃ 2 min，
59℃ 1． 5 min。用 0． 8%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR
产物。
1． 2． 3 表达载体 pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA 的构
建 载体构建步骤如图 4 所示。
1． 2． 4 工程菌发酵 将过夜培养的种子液按 1%
接种量接种，37℃、250 r /min 培养，待长至 OD600为
0． 4 － 0． 6 时加入终浓度 1 mmol /L的 IPTG 诱导，在
30℃、250 r /min发酵 24 h。
1． 2． 5 产物测定 仪器:Agilent6890 气相色谱仪。
色谱条件:phenomen ZB-WAXplus 色谱柱;FID
(220℃)检测器;进样口压力为 16． 92 psi;柱箱温
度为 100℃;氢气流量为 30 mL /min;进样量0． 2 "L。
异丁醇出峰时间为 2． 80 min。内标:正丁醇，出峰时
间为 2． 87 min。
2 结果
2． 1 基因扩增
提取枯草杆菌的总 DNA为模板，用引物 1 进行
PCR扩增;提取大肠杆菌的总 DNA 为模板，分别用
引物 2、3 进行 PCR 扩增，提取乳脂乳球菌 NIZO
B1157 的总 DNA为模板，用引物 4 进行 PCR扩增。
用 0． 8%的琼脂糖凝胶电泳检测，分别在 1． 6、1． 7、
1． 5 和 1． 8 kb附近有特异的单一 DNA条带(图 3) ，
均与目的基因片段大小一致，即 alsS、ilvC、ilvD 和
kdcA基因。
M． DNA Marker DL2000;1． alsS基因片段 1． 6 kb;2，3． ilvD
基因片段 1． 5 kb;4，5． ilvC 基因片段 1． 75 kb;6． kdcA 基因
片段 1． 8 kb
图 3 PCR扩增基因片段
2． 2 表达质粒的构建
表达质粒 pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA的多顺反
子系统，按图 4 所示，分别逐步构建。先将 Sal Ⅰ、
BamHⅠ双酶切的 ilvC片段、BamHⅠ、SacⅠ 双酶切
的 ilvD基因片段与用 SalⅠ、SacⅠ双酶切的 pSTV29
进行 3 片段连接，构建表达质粒 pSTV29-ilvC-ilvD。
再将 SphⅠ、SalⅠ双酶切的 alsS基因片段与用 SphⅠ、
SalⅠ双酶切的质粒 pSTV29-ilvC-ilvD 进行连接，构
建表达质粒 pSTV29-alsS-ilvC-ilvD。最后将 SacⅠ酶
切的 kdcA基因片段与经 SacⅠ酶切的质粒 pSTV29-
alsS-ilvC-ilvD进行平端连接，构建表达载体 pSTV29-
alsS-ilvC-ilvD-kdcA。
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2011 年第 8 期 林丽华等:产异丁醇大肠杆菌工程菌的构建
图 4 表达载体 pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA的构建
2． 3 表达载体的鉴定
提取质粒 pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA，进行单
酶切验证，琼脂糖凝胶电泳检测大小正确，约为 9． 7
kb(图 5) ，最后测定序列，测序结果与预期一致，表
明表达载体构建成功。
2． 4 表达质粒的表达
将含表达质粒 pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA的大肠
杆菌菌株接种培养，收集 30℃诱导 20 h后的菌体进行
10%SDS-PAGE。alsS、ilvC、ilvD、kdcA的蛋白质理论分
子大小分别是 62． 1、54． 2、65． 6和 60 kD(图 6)。
2． 5 产物测定
发酵 24 h后，取发酵液上清用高效气相色谱测
定发酵产物，结果(图 7)在异丁醇出峰时间 2． 806
min处有产物峰出现(2． 876 min处为正丁醇标样) ，
表明大肠杆菌工程菌能发酵葡萄糖产异丁醇，产量
为 3 g /L。
M． DNA marker λHind Ⅲ;1． pSTV29-alsS-ilvC-ilvD-kdcA
酶切验证
图 5 表达载体 pSTV29-alsS-ilvC-
ilvD-kdcA的酶切验证
M．蛋白质分子量标准;1． E． coli BW25113;2，3． E． coli BW
25113 (pSTV29-alss-ilvC-ilvD-kdcA)
图 6 工程菌 SDS-PAGE分析
3 讨论
本研究以氨基酸合成途径中所产生的 2-酮酸
作为异丁醇的生物合成前体，在大肠杆菌中过量表
达源于乳脂乳球菌、枯草杆菌和大肠杆菌本身的 4
个基因，构建了新型的产异丁醇的大肠杆菌基因工
程菌，证明了乳脂乳球菌 NIZO1157 的 kdcA 基因能
代谢 2-酮戊酸产异丁醇。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
图 7 工程菌株发酵产物的高效气相色谱
该项研究为国内首次构建产异丁醇的大肠杆菌
基因工程菌，技术路线是对大肠杆菌的缬氨酸合成
途径加以改造，将氨基酸生产途径与 2-酮酸降解途
径相结合生产醇类，而并非采用典型发酵型分解代
谢途径，避免使用生物体中常用来合成醇类的辅酶
A及其中间产物，大规模合成更加“高级”和复杂的
醇类，为生物燃料的生产开辟了一个新的探索方向。
当然在微生物中转入一些原来没有的代谢途径的表
达可能导致代谢失衡，而且异源代谢的产物及中间
产物的积累，可能会导致细胞毒性反应［6 － 8］。利用
基因工程和代谢工程技术，解除了代谢过程中可能
存在的产物或者中间产物等的抑制，提高菌种对异
丁醇的耐受性，并强化异丁醇生产中的关键酶，切断
丙酮、乙醇的生物合成代谢途径，以提高异丁醇在溶
剂中的比例，这些探索必将成为今后研究高产异丁
醇发展的一个方向。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)
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