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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(8):174-179
1，3-二羟基丙酮（DHA）是一种重要的精细化
工产品，可作为农药合成中间体、精细化工原料和
医药前体，用途广泛。DHA 的生产方法主要有化学
合成法和微生物发酵法，当前的生产方法以化学合
成法为主，但从技术的经济型和环境的友好性来看，
微生物发酵法更具经济和社会效益。自从 1898 年
Bertrand 发现利用细菌可以将甘油转化为 DHA 后，
各国科研人员对微生物发酵甘油生产 DHA 进行了多
方面的研究［1］。
氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans）是
一种严格好氧菌，经常被用于氧化甘油生成二羟基
丙酮［2-6］。许多科研人员通过优化工艺参数［7］，培
养 基 组 成［8］、 溶 氧［9］、 培 养 方 式［10］、 反 应 器 类
型［11，12］等方式来达到提高 DHA 产量的目的。也有
收稿日期 ：2014-12-09
基金项目 ：天津市应用基础与前沿技术研究计划（天津市自然科学基金）重点项目（10JCZDJC16600）
作者简介 ：许晓菁，女，博士，高级工程师，研究方向 ：工业微生物发酵及检测方法开发 ；E-mail ：xxjmiss@163.com
高产二羟基丙酮重组菌株的构建
许晓菁1，2 赵琼2 王祥河2
（1. 天津市产品质量监督检测技术研究院，天津 300380 ；2. 天津市工业微生物研究所，天津 300462）
摘 要 ： 旨在构建一株过量表达编码膜系甘油脱氢酶的 sldAB 基因的重组菌株，以提高二羟基丙酮产量。以氧化葡萄糖
酸杆菌 ATCC621H 的基因组 DNA 为模板，运用 PCR 方法扩增得到基因 sldAB，并连接到 pBBR1MCS-2 质粒上，构建表达载体
pBBR1MCS-2-sldAB。通过电转化将载体 pBBR1MCS-2-sldAB 转化进入氧化葡萄糖酸杆菌 ATCC621H 内，得到重组菌株 GOX205。
结果显示，重组菌株构建成功，其甘油脱氢酶的酶活力较之于出发菌株提高了 26%。在甘油初始浓度 100 g/L 的甘油发酵培养基中，
较之于出发菌株，GOX205 的生长状况良好，发酵 52 h 时 DHA 浓度达到 94.1 g/L，较之于出发菌株提高了 19.7%，甘油残量降低
了 15.1 g/L。
关键词 ： 1，3- 二羟基丙酮 ；重组菌株 ；甘油 ；过量表达
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.08.025
Construction of a Recombinant Strain Producing High-yield
Dihydroxyacetone
Xu Xiaojing1，2 Zhao Qiong1 Wang Xianghe1
（1. Industrial Microbe Research Institute of Tianjin，Tianjin 300462 ；2. Tianjin Product Quality Inspection Technology Research Institute，
Tianjin 300380）
Abstract ： This work aims to construct a recombinant strain containing gene sldAB over-expressing membrane-bound glycerol
dehydrogenase for raising the yield of dihydroxyacetone（DHA）. Firstly, using genomic DNA of Gluconobacter oxydans ATCC621H as a
template, sldAB amplified by PCR was ligated to the plasmid pBBR1MCS-2 and the expression vector pBBR1MCS-2-sldAB was constructed ；
subsequently the plasmid pBBR1MCS-2-sldAB was transformed into the G. oxydans ATCC621H by electrotransfer, and the recombinant strain
GOX205 was obtained. Results showed that the recombinant strain was constructed successfully, and the activity of glycerol dehydrogenase
increased by 26% compared with the original strain. When initial concentration 100 g/L of glycerol as carbon source, the growth of GOX205 was
significantly improved compared with the original strain, the final DHA concentration was 94.1 g/L and increased by 19.7%, and the residue of
glycerol decreased 15.1 g/L. Therefore, this study provides a basis for further improving the biotransformation process of DHA production.
Key words ： 1, 3-dihydroxyacetone ；recombinant strain ；glycerol ；over-expression
2015,31(8) 175许晓菁等：高产二羟基丙酮重组菌株的构建
人针对高产菌株的选育开展研究，例如从自然界筛
选高产菌株［13］或者通过激光诱变［14］获得高产菌株，
华东理工大学的魏东芝等［15］申请的专利中公布了
一种用重组基因工程质粒 pET-gdh 和 pET-ndh 转化
大肠杆菌，从而构建得到 DHA 产量提高的工程菌的
方法，Li 等［16］通过在乙醇脱氢酶缺失菌株中过量
表达甘油脱氢酶提高了 G. oxydans 的 DHA 产量。
在 G. oxydans 菌中存在两条甘油氧化的途径，
一条是甘油直接氧化成 DHA，由不依赖于 NAD 的
膜系甘油脱氢酶催化，最佳 pH 为 6.0，然后 DHA
被激酶磷酸化成为磷酸二羟丙酮 ；另一条途径是甘
油被激酶催化成为甘油 -3-磷酸，最佳 pH 为 8.5，然
后被依赖于 NAD 的脱氢酶氧化成为磷酸二羟丙酮，
磷酸二羟丙酮通过 PPP 途径分解代谢［17］。甘油发
酵生产二羟基丙酮的过程便是利用了不依赖于 NAD
的膜系甘油脱氢酶（以下简称 GDH）的催化作用。
该酶以氧气作为最终的电子受体，催化中心定位于
周质空间，所以底物运输不必透过细胞膜进入细胞
内［18］。已有研究表明，甘油脱氢酶 GDH 是二羟基
丙酮合成过程中的关键酶，提高甘油脱氢酶的表达
量将提高底物转化的效率［19，20］。本研究通过 PCR
方法获得编码甘油脱氢酶的基因 sldAB，构建载体
pBBR1MCS-2-sldAB，通过电转化将载体 pBBR1MCS-
2-sldAB 转化进入宿主 ATCC621H 内，旨在得到过
量表达甘油脱氢酶的重组菌株 GOX205，为用于工
业生产的二羟基丙酮重组菌株的构建进行有益探索。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 本实验所用的菌株为 G. oxydans
ATCC621H，购自 ATCC，由本实验室保藏。大肠杆
菌 DH5α 由本实验室保藏。质粒 pBBR1MCS-2 由中
国农业大学惠赠，该质粒具有卡那霉素抗性，可以
在大肠杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌中进行转化。
1.1.2 酶与化学试剂 基因片段回收试剂盒、质粒
提取试剂盒、限制性内切酶、T4 连接酶、蛋白酶 K、
Pfu DNA 聚合酶和 dNTP 均购自 TaKaRa 公司。
甘露醇、甘油、NaCl、MgSO4·7H2O、酵母抽提物、
蛋白胨、化学试剂均为分析纯。
1.1.3 引物设计与合成 根据 G. oxydans 染色体中
sldAB 基因序列设计引物，上游引物命名为 sldab-fw、
下游引物命名为 sldab-re，分别在上下游引物两端
添加 Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ限制性内切酶酶切位点。引
物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列
见表 1。
表 1 引物序列
名称 引物序列（5-3） 酶切位点
sldab-fw CATAAGCTTCAGAGCAAACTGGCG Hind Ⅲ
sldab-re CATGAATTCATGACGGTCGGAGGTG EcoR Ⅰ
1.1.4 培养基 甘露醇液体培养基（g/L）：酵母抽
提物 5.0，蛋白胨 3.0，甘露醇 25.0。
甘露醇固体培养基 ：在上述甘露醇液体培养基
中加入 1.5%（w/v）琼脂粉。
甘露醇 - 卡那霉素固体培养基 ：上述甘露醇固
体培养基经高温灭菌并冷却至室温后加入卡那霉素
至终浓度为 50 μg/mL，混匀后倒入灭菌培养皿中。
LB-卡那霉素固体培养基 ：LB 固体培养基（胰
蛋白胨 10 g/L，酵母抽提物 5 g/L，NaCl 10 g/L，琼
脂 15 g/L，pH7.5）经高温灭菌并冷却至室温后加入
卡那霉素至终浓度为 50 μg/mL，混匀后倒入灭菌培
养皿中。
电转化培养基（g/L）：甘露醇 80，酵母抽提物
15，MgSO4·7H2O 2.5，甘油 0.5，CaCl2 1.5。
种子培养基（g/L）：甘油 10，酵母抽提物 20，
KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 0.5。
发酵培养基（g/L）：甘油 30-200，酵母抽提物
5，CaCO3 7。
1.2 方法
1.2.1 sldAB 基因的扩增 利用细菌染色体提取试
剂盒，提取氧化葡萄糖酸杆菌 ATCC621H 的染色
体 DNA，以其为模板用高保真 Pfu DNA 聚合酶进行
PCR 扩增，反应条件 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性
30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 3 min 。PCR 产物按
照 PCR 产物回收试剂盒说明书要求进行纯化回收。
1.2.2 质粒 pBBR1MCS-2-sldAB 的构建 将扩增得
到 的 sldAB 基 因 片 段 4 μL 与 pBBR1MCS-2 质 粒 4
μL 分别加入限制性内切酶 Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ各 0.25
μL，10× 酶缓冲液 2 μL，用无菌水将总体积补充
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到 20 μL，放于 37℃条件下消化 1-2 h。用试剂盒对
酶切产物分别进行纯化回收。在 20 μL 连接体系中，
加入 2 μL 10×T4 连接酶缓冲液，1 μL T4 连接酶，
sldAB 基 因 片 段 3 μL， 根 据 pBBR1MCS-2 片 段 和
sldAB 基因片段的电泳条带亮度确定 pBBR1MCS-2 片
段的加入量，加水至 20 μL，在 16℃条件下连接 2-3
h 后，通过酶切验证得到 pBBR1MCS-2-sldAB 质粒。
1.2.3 电转化法构建重组菌株 GOX205 采用电转
化法将质粒 pBBR1MCS-2-sldAB 导入氧化葡萄糖酸
杆菌 ATCC621H 中，通过卡那霉素抗性压力进行筛
选，具体操作为 ：（1）制备电转化感受态细胞 ：将
氧化葡萄糖酸杆菌 ATCC621H 接种于装有 50 mL 电
转化培养基的 500 mL 摇瓶中，将摇瓶放于 30℃，
200 r/min 的摇床中培养至培养液在 600 nm 的吸光
度达到 0.4 ；将细胞通过在 4℃，6 000 r/min 条件下
离心 4 min 进行收获，并在 30 mL 的灭菌过的 10%
（v/v）甘油中重悬，细胞用冷的 10%（v/v）甘油洗
3 次，最后重悬于 2 mL 10%（v/v）甘油中，即为电
转化感受态细胞 ；（2）取 400 μL 电转化感受态细胞
用于电转化，每管感受态细胞加入 1 μL pBBR1MCS-
2-sldAB 质粒，用移液器轻轻吸打均匀，置于冰上 ；
（3）将要转化的混合物加入预冷的 1 mm 的电转化
杯中，立即按下按钮电击，脉冲电压 2 000 v ；（4）
立即加 800-1 000 μL 甘露醇培养基到转化杯中重悬
细胞 ；（5）将细胞转入合适的培养管中置于 30℃摇
床中培养 3-5 h ；（6）吸取 100-200 μL 的菌液涂布
到甘露醇 - 卡那霉素固体培养基平板上，30℃条件
下培养 3-5 d ；（7）挑选转化子 ：挑出在甘露醇 - 卡
那霉素固体培养基平板上生长的单菌落，提取质粒
后进行酶切实验验证，得到转化子 GOX205。
1.2.4 转化子的遗传稳定性实验 用传代的方法考
察转化子的遗传稳定性，将 GOX205 在不含卡那霉
素的甘露醇斜面上进行连续传代 20 代，并将第 1、
10、20 代转化子提取质粒后用 Pst Ⅰ进行酶切验证。
与此同时，进行摇瓶发酵实验，将 1、10、20 代的
转化子分别接种于 500 mL 摇瓶中，每个摇瓶中均
装有 150 mL 甘油初始浓度为 30 g/L 的发酵培养基，
30℃，200 r/min 摇床上进行发酵实验，发酵 16 h 达
到发酵终点。比较第 1、10、20 代转化子的甘油到
DHA 的转化率。转化率计算公式如下 ：
mDHA/90
m⭈⋩/92䖜ॆ⦷ % = ×100%
其中，m 为质量，90 为 DHA 的分子量，92 为甘油
的分子量。
1.2.5 分析方法
1.2.5.1 生物量测定 利用分光光度计测定发酵液
在 600 nm 处的吸光度，以 OD600 表示。
1.2.5.2 甘油和 DHA 的测定 高效液相法，Agilent
1100 HPLC 仪，流动相为乙腈∶水（90∶10），色谱
柱为 Lichrospher 5-NH2（4.6 mm×250 mm），甘油采
用示差检测器，柱温 35℃，DHA 采用紫外检测器，
检测波长 ：271 nm［21］。
1.2.5.3 相对酶活力测定 发酵进入稳定期后分别
取重组菌株 GOX205 和出发菌株的发酵液 20 mL，
8 000 r/min 离心 10 min 收集细胞，将细胞洗涤两次
后用磷酸缓冲液（pH6.0）稀释成在 OD600 处吸光
度值相同的细胞悬浮液。在 250 mL 的三角瓶中加
入 1 mL 的细胞悬液和 30 mL 1 mol/L 的甘油，30℃，
200 r/min 反应 1 h，检测生成的 DHA 的量。将 1 mL
出发菌株的细胞悬液中 GDH 的酶活力设为 1，根
据 DHA 量计算 1 mL 重组菌株 GOX205 细胞悬液中
GDH 的相对酶活力。
2 结果
2.1 目的基因sldAB的获得
利用 PCR 方法扩增目的基因 sldAB，并将反应
产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果（图 1）显示，
扩增得到的片段大小为 3 000 bp 左右，经测序比对
与目的基因 sldAB 的同源性为 100%。
3000
bp
M
图 1 sldAB 基因的扩增
2.2 质粒pBBR1MCS-2-sldAB的构建
重组质粒 pBBR1MCS-2-sldAB 分别用 BamH Ⅰ
2015,31(8) 177许晓菁等：高产二羟基丙酮重组菌株的构建
和 EcoR Ⅰ酶切，经琼脂糖凝胶电泳上跑胶验证。若
质粒构建成功，则经过 BamH Ⅰ后应出现大小分别
为 2 181 bp 和 6 012 bp 的条带 ；用 EcoR Ⅰ酶切，应
出现一条 8 193 bp 的条带。结果（图 2）显示，重
组质粒构建成功。
酵液制备相同浓度的细胞悬液，测定 GDH 的活力。
结果（图 5）显示，相同细胞浓度条件下，重组菌
株 GOX205 的酶活力是出发菌株的 1.26 倍。说明通
过 sldAB 基因的过量表达，GDH 的表达量有了明显
的提高。
6000
bp
21 M
2000
1 ：BamH Ⅰ酶切 ；2 ：EcoR Ⅰ酶切 ；M ：DNA Marker
图 2 pBBR1MCS-2-sldAB 质粒酶切图谱
2.3 重组菌株的稳定性
第 1、10、20 代 转 化 子 在 提 取 质 粒 并 用
BamHⅠ酶切后，结果（图 3）显示，经过 20 次传代
后，并未发生质粒丢失或回复突变现象，说明该
重组菌株遗传性能稳定。同时，对 1、10、20 代的
转化子进行发酵性能实验，其 16 h 转化率分别为
88.6%、89.8% 和 88.4%。结果（图 4）表明，经过
20 次传代后，转化子的发酵性能无明显变化。
6000
bp
2 31M
2000
M ：DNA Marker ；1 ：第 1 代 ；2 ：第 10 代 ；3 ：第 20 代
图 3 转化子稳定性的验证
2.4 相对酶活力测定
将 GOX205 与出发菌株在相同的摇瓶培养条件
下（甘油初始浓度 100 g/L，30℃，200 r/min）发酵
至 40 h 时，两菌株均已进入稳定期，分别取两种发
90
88
86
84
82
80䖜ॆ⦷%
78
76
74 ሩ➗ ㅜ1ԓ ㅜ10ԓ ㅜ20ԓ
图 4 转化子稳定性的验证（发酵实验）
0
0.5
1
1.5 ࠪਁ㧼Ṛ GOX205ሩ䞦⍫
图 5 重组菌株 GOX205 的相对酶活
2.5 发酵性能考察
在 5 L 发酵罐中进行发酵实验考察重组菌株
GOX205 的发酵性能。发酵培养基中甘油初始浓度
为 100 g/L，发酵温度 30℃，通气量为 6 vvm，培养
时间为 52 h，跟踪测定发酵过程中发酵液吸光度变
化与甘油消耗及 DHA 生成情况。同时将出发菌株
ATCC621H 做平行对照。结果（图 6- 图 8）表明，
在 100 g/L 的甘油发酵液中，GOX205 的生长状况
良好，DHA 浓度达到 94.1 g/L，较之于 ATCC621H
提高了 19.7%，甘油残量较之于 ATCC621H 降低了
15.1 g/L。
3 讨论
底物抑制和产物抑制被认为是制约 G. oxydans
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.8178
转化甘油生成 DHA 的转化效率的重要因素。高浓度
的 DHA 会阻碍甘油的进一步氧化，这种抑制作用对
细胞产生不可逆的损害，以至于细胞的活力随时间
指数下降，其间 GDH 的活力也受到影响［22，23］。在
本研究中，当提高甘油初始浓度至 150 g/L 和 200
g/L 时，5 L 发酵罐间歇发酵时重组菌株 GOX205 的
DHA 产量分别达到 133 g/L 和 124 g/L，而出发菌株
的 DHA 产量分别为 96 g/L 和 90 g/L。这说明当 GDH
的表达量增大时底物抑制作用会降低，细胞活性能
够得以保持，这与 Gatgens 等［20］的研究结论一致。
同时 Gatgens 等［20］的研究表明，过量表达 sldAB 基
因时采用强启动子可以使得 sldB 基因的表达量显著
提高，并且采用强启动子表达的菌株在甘油初始浓
度提高时显示出更高的底物抑制消除作用。
在 G. oxydans 的 细 胞 内， 大 部 分 甘 油 被 GDH
氧化成为 DHA，同时一小部分被膜系乙醇脱氢酶
（ADH）氧化生成甘油醛，进而转化为甘油酸［24］，
Habe 等［25］构建了 adhA 基因敲除的突变菌株，在
甘油初始浓度 100 g/L 的间歇发酵中，G. oxydans 野
生菌在 2 d 内消耗完大部分甘油，DHA 产量为 54.3
g/L，而突变菌株在相同的时间内产生 DHA 74.8 g/L，
当甘油初始浓度进一步增加时，突变菌株的优势更
加明显。在本研究中，重组菌株的相对酶活力较之
于出发菌株提高了 26%，而 Li 等［16］的研究显示，
在 ADH 缺失的菌株中过量表达 sldAB 时，GDH 的
酶活力较之于出发菌株可提高 58%。与之类似的是，
Gatgens 等［20］在葡萄糖酸 -2- 脱氢酶缺失菌株中过
量表达 sldAB 时，DHA 的产量也高于在野生型菌株
中过量表达。这提示我们，微生物的基因彼此之间
存在相互关联，要获得更高的 DHA 产量，除了在过
量表达 sldAB 时引入强启动子，还可以结合代谢工
程手段寻找与 DHA 生成相关的多个基因进行一系列
基因工程操作。
4 结论
本研究中，通过利用基因工程手段过量表达编
码 DHA 合成途径关键酶——甘油脱氢酶的 sldAB 基
因，构建了重组菌株 GOX205，该菌株具有稳定的
遗传性能，其发酵甘油生产 DHA 的性能较出发菌株
有明显的提高。
参 考 文 献
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0
1
2
3
4
5
6
0 10 20 30 40 50 60ᰦ䰤/hOD 600 ATCC621HGOX205
图 6 重组菌株 GOX205 与出发菌株生长性能比较
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60ᰦ䰤/h⭈⋩ g·L-1 ATCC621HGOX205
图 7 重组菌株 GOX205 与出发菌株甘油消耗性能比较
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60ᰦ䰤/hDHA g·L-1 ATCC621HGOX205
图 8 重组菌株 GOX205 与出发菌株 DHA 产量比较
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（责任编辑 马鑫）