全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
小分子 RNA表达载体构建的新方法———
MicroRNA前体 PCR置换法
陈锐 胡正 张辉
(中国农业科学院作物科学研究所 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程，北京 100081)
摘 要: MicroRNA(miRNA)基因的终产物是进化上高度保守的、具有基因表达调控功能的非编码小分子 RNA。miRNA
的特征性发卡环前体(pre-miRNAs)在体内经数步加工后，与 AGO蛋白构成沉默复合体(RISC)以行使其功能。如将已知 pre-
miRNAs上的 miRNA成熟链和互补链(miRNA* )分别置换为有待研究的小分子 RNA，并构建表达载体转化植株，利用转化株
内源的 miRNA成熟加工体系，可以产生预设的小分子 RNA。利用已知拟南芥 miRNA 前体为模板，使用替换 PCR 的方法，人
工构建了 gso8-ap-miRNA-pBI121 表达载体。利用农杆菌介导法转化拟南芥，多数 T1代植株表现出提早开花的突变表型。该
方法是一种简便、高效的构建小分子 RNA表达载体的方法。
关键词: 小分子 RNA MicroRNA PCR置换法
A Novel Method for Constructing Small RNA Expression
Vector———Artificial pre-MircoRNA
Chen Rui Hu Zheng Zhang Hui
(Crop Sciences Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Key Facility for Crop
Gene Resources and Genetic Improvement，Beijing 100081)
Abstract: The end products of MicroRNA genes(MIRs)are small non-coding RNAs，which are part of an evolutionarily highly
conserved intracellular mechanism to regulate gene expression in a sequence-specific manner． Mature miRNAs were generated from
miRNA precursors(pre-miRNAs)with characteristic hairpin structures by sequential processing steps before they were loaded into the
RISC complex for exerting functions． If we replace the miRNA and miRNA* of the pre-miRNA and construct expression vector for
transformation，the artificial pre-miRNA would be processed by endogenous mechanisms and generate pre-designed small RNA after
transformation． Here，we used the known Arabidopsis pre-miRNA as template to preform replacement successfully by over-lap PCR meth-
od and constructed gso8-ap-miRNA-pBI121 expression vector． After Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana，most
transgenic plantlets exhibited early flowering mutant phenotype． This method was proved to be a simple and efficient approach for small
RNA expression vector construction by PCR detection．
Key words: Small RNA MicroRNA Over-lap PCR
收稿日期:2009-12-24
基金项目:“863”计划(2007AA10Z139)
作者简介:陈锐，男，博士研究生，研究方向:植物抗逆分子生物学
通讯作者:张辉，研究员，研究方向:植物抗逆分子生物学;E-mail:zhang_hui@ mail． caas． net． cn
近年来，具有基因表达调控功能的小分子
RNA，由于其存在的普遍性和功能的多样性，已
逐渐引起科学家的广泛关注。但在生物体内持
续、有效地表达特异的小分子 RNA 一直是其功
能研究的主要技术瓶颈。MicroRNA(miRNA)作
为内源的、具有基因表达调控功能的非编码小分
子 RNA，可以介导具有同源序列的靶基因转录后
基因沉默。植物 miRNA 具备一套复杂的成熟加
工机制:miRNA 的单链前体(pre-miRNAs)具备特
征性的发卡环二级结构，pre-miRNAs 被核内
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
DCL1 蛋白识别经两步剪切反应后形成 miRNA:
miRNA* 二聚体，二聚体被 HEN1 蛋白甲基化后
再由 HASTY 转运到细胞质中。miRNA* 降解的
同时，miRNA 成熟链与 AGO 蛋白等构成沉默复
合体(RISC)行使功能［1］。
本研究利用分段重叠 PCR 的方法，将野生
大豆中发现的 miRNA(gso8)［2］与已知拟南芥
miR319 前体上的成熟链及其互补链(miRNA
* )成功置换，使之形成携带预设小分子 RNA
的人工 miRNA 前体(Artificial pre-miRNA，ap-
miRNA)gso8-ap-miRNA。后续的测序验证、定
向插入 pBI121 载体以及转化拟南芥等试验结
果均表明，此方法构建的小分子 RNA 表达载体
可以利用植物内源的 miRNA 成熟加工机制产
生了具有活性的小分子 RNA(gso8)。该方法为
小分子 RNA 的功能研究提供了便捷、有效的
途径。
1 材料与方法
1. 1 材料与试剂
pGEM-T vector购自 Promega 公司;限制性内切
酶购自 NEB公司产品;Taq DNA 聚合酶、琼脂糖凝
胶回收试剂盒购自 TaKaRa 公司;引物合成及测
序反应由北京华大基因有限公司完成。用于农
杆菌转化的野生型拟南芥种子、pT-pre319 质粒
(含有拟南芥 miR319 前体)、双元质粒 pBI121、
大肠杆菌 DH10β 和农杆菌 GV3101 均为本实验
室保存。
1. 2 引物设计
置换 PCR反应针对三段重叠片段(a、b、c)共设
计 3 对引物(表 1)。在两端引物 miR 319A 和 miR
319B 的 5，3端分别加入限制性内切酶切位点
BamHⅠ和 SacⅠ，用于定向克隆。另外四个引物(a-
miR1-4)分别在 5端加入了替换的 gso8、gso8* 及其
互补序列(图 1 中虚线表示)。
表 1 替换 PCR所需引物
引物 序列(5 － 3) 长度(bp)
amiR1 GATGCGAGTGTCTTCGCCTCTGATCTCTCTTTTGTATTCC 40
amiR2 GATCAGAGGCGAAGACACTCGCATCAAAGAGAATCAATGA 40
amiR3 GATCGGAGGCGTAGATACTCACATCACAGGTCGTGATATG 40
amiR4 GATGTGAGTATCTACGCCTCCGATCTACATATATATTCCT 40
miR319 A CGGGATCCCAAACACACGCTCGGACGCAT 29
miR319 B ACGAGCTCCATGGCGATGCCTTAAATAAA 29
1. 3 置换 PCR
置换 PCR反应针对 3 段重叠片段(a、b、c)共设
计 3 对引物(表 1)。在两端引物 miR 319A 和 miR
319B 的 5，3端分别加入限制性内切酶切位点
BamH I和 Sac I，用于定向克隆。另外 4 个引物(a-
miR 1-4)分别在 5端加入了替换的 gso8、gso8* 及
其互补序列(图 1 中虚线)。分别用 3 对 PCR 引物
扩增 pT-pre-miR319 质粒，再利用 a、b、c扩增片段的
重叠区域，以 3 段 PCR产物为模板进行混合 PCR扩
增，最终可以获得将 miR319 成熟链及星号链的替
换为 gso8 及 gso8* 的发卡环前体结构 artificail pre-
miRNA(gso8-ap-miRNA)。
图 1 置换 PCR示意图
1. 4 PCR扩增体系
1. 4. 1 a、b、c片段的 PCR 扩增体系 50 μL PCR
201
2010 年第 7 期 陈锐等:小分子 RNA表达载体构建的新方法———MicroRNA前体 PCR置换法
反应体系，质粒模板 50 ng ，引物 20 pmol，dNTPs 200
μmol /μL，高保真 Taq 酶 5 U，ddH2O补至 50 μL。扩
增反应条件:94℃预变性 3 min;94℃，30 s;55℃，30
s;72℃，40 s，25 个循环;72℃延伸 10 min。
1. 4. 2 重叠 PCR 扩增体系 50 μL PCR 反应体
系，a、b、c 3 种模板各加1 μL，引物 miR319A 和 miR-
NA319B 各 20 pmol，dNTPs 200 μmol /μL，Taq 酶 5 U，
ddH2O补至 50 μL。扩增反应程序:94℃预变性 3 min;
94℃，30 s;55℃，30 s;72℃，1. 5 min，25 个循环;
72℃延伸 10 min。
1. 5 gso8-ap-miRNA的克隆测序
以琼脂糖凝胶电泳回收的 a、b、c 片段为模板，
重叠 PCR 扩增得 gso8-ap-miRNA。将重叠 PCR 产
物电泳回收后与 pGEM-T vector 4℃连接过夜，热激
转化大肠杆菌 DH10β 后，挑选氨苄(Ampr)抗性克
隆 PCR检测并测序，获得重组质粒 pT-gso8-ap-miR-
NA。大肠杆菌感受态的制备与转化方法参照《分子
克隆实验指南》［3］。
1. 6 gso8-ap-miRNA-pBI121 表达载体的构建
限制性内切酶 BamH I 和 Sac I 消化 pT-gso8-
ap-miRNA与 pBI121 质粒后，琼脂糖电泳回收目的
条带。经 T4 DNA 连接酶连接后，得到植物表达载
体 gso8-ap-miRNA-pBI121。植物表达载体 gso8-ap-
miRNA-pBI121 包括 NPTⅡ基因、CaMV 35S 启动子、
人工构建的 miRNA前体序列 gso8-ap-miRNA 和 nos
终止子。
1. 7 农杆菌介导法转染拟南芥
农杆菌 GV3101 感受态细胞的制备与转化方法
参照文献［4］。采用花序浸泡法侵染拟南芥，拟南
芥的转化方法见文献［5］。将收获的 T1代种子播种
于含有卡那霉素(35 mg / L)的MS培养基上，4℃ 诱
导 2 d后转移至人工培养箱中(22℃，光照时间为 8
h /d) ，20 d后把抗性苗单株移栽，并针对表型突变
的个体进行 PCR检测。
1. 8 突变转化株的 PCR检测
CTAB法提取拟南芥基因组 DNA 参照《精编分
子生物学实验指南》［6］。扩增 NPTⅡ基因特异引物
序列:K-F(5-GATCTGGATCGTTTCGCATG-3)和 K-
R(5-AAGGCGATAGAAGGCGATGC-3) ，扩增产物
长度 794 bp。扩增程序:94℃预变性 5 min;94℃，1
min;60℃，30 s;72℃，1 min，30 个循环;72℃延伸
10 min。
2 结果与分析
2. 1 置换 PCR与 ap-miRNA的克隆测序
以拟南芥 miR319 前体为模板，分 3 段扩增并替
换 miRNA319 的成熟链和星号链，电泳检测分别获
得符合预计的 118 bp、176 bp和 178 bp大小的 a、b、
c片段(图 2-A)。切胶回收后，利用 a、b、c片段彼此
存在的重叠区混合扩增，最终获得全长 422 bp 的人
工构建 miRNA发卡环前体 ap-miR319(图 2-B)。经
TA克隆、测序验证，miR319 的成熟链和星号链的
21 个碱基均被成功替换，其他任何位置均没有碱基
突变，并且两端成功的加入了 BamH I 与 Sac I 的酶
切位点(图 3)。二级结构预测显示，其前体的最低
自由能与结构和 miR319 几乎没有任何区别［7］。
M． DL 2000;1． a片段;2． b片段;3． c片段;4． ap-miRNA
图 2 置换 PCR电泳结果
2. 2 ap-miRNA-pBI121 表达载体的检测
分别提取上述人工构建的 pT-ap-miRNA和 pBI121
的质粒 DNA，BamH I 和 Sac I 双酶切，回收相应片
段后 T4酶连接，将构建的 ap-miRNA-pBI121 重组质
粒转化大肠杆菌 DH10β，挑取阳性克隆并保存菌
种。对重组质粒的双酶切检测可以看到约 11 kb 的
301
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
pBI121 载体片段和约 420 bp 的 ap-miRNA 片段(图
4)。在转化农杆菌之前，再次通过 PCR 检测证明，
重组质粒均携带 420 bp的 ap-miRNA片段(图 5)。
2. 3 拟南芥阳性株的筛选与 PCR鉴定
将重组质粒导入农杆菌 GV3101 并侵染拟南芥
后，T1代种子在卡那 MS 培养基上筛选阳性株。20 d
后移栽，对阳性转化株的生长观察发现，gso8 转染的
拟南芥多数表现出早开花的突变型，这与过表达
miR319造成叶片弯曲并呈锯齿状的表型不同。对
gso8的靶基因与潜在的功能进行生物信息学分析发
现，过表达 gso8 很有可能导致植株加速从营养生长
阶段过渡到生殖生长阶段。由此证明，此方法构建的
gso8-ap-miRNA小分子 RNA表达载体成功的在转化
株体内表达了具有活性的 gso8。此外，对转化阳性株
提取基因组 DNA并 PCR扩增 NPT II基因片段，结果
(图 6)显示发生突变的植株均含有外源片段。
斜体部分．拟南芥 miR319 前体序列;方框部分． gso8 与 gso8* 序列;双划线部分． T载体序列;下划线酶切位点
图 3 ap-miRNA测序结果
M． λHind Ⅲ Marker;1． pBI121 质粒;2．重组质粒 ap-miR-
NA-pBI121 的双酶切产物
图 4 重组质粒 ap-miRNA-pBI121 的双酶切
检测(BamHⅠ和 SacⅠ)
M． DL 2000 Marker;1-8． pBI121-ap-miRNA;9．阴性对照，
模板为 pBI121;10． H2O
图 5 重组子 PCR检测
M． DL 2000 Marker;1-6． 转化植株;7． 质粒 ap-miRNA-
pBI121;8．阴性对照
图 6 PCR检测转基因植株卡那霉素抗性基因 NPT Ⅱ
3 讨论
小分子 RNA是目前生命科学领域的研究热点，
其功能研究使用的方法主要有直接导入法和构建载
体基因敲除法(RNAi)。与上述方法相比，本研究探
讨的方法具有以下优点。
3. 1 持续性和精确性
直接导入法是通过化学合成并修饰后直接导入
机体内 21 － 24 nt的小分子 RNA，以研究其功能，但
是直接导入的小分子 RNA发挥的作用并不持久，属
于瞬时表达［8］。相对直接导入法，通过构建表达载
体可以持续、有效的表达外源小分子 RNA。通常使
用的 RNAi基因敲除法是构建数百 bp 长的回文序
401
2010 年第 7 期 陈锐等:小分子 RNA表达载体构建的新方法———MicroRNA前体 PCR置换法
列，转录后可以形成长的双链 RNA，利用内源的
RNA干扰机制可以产生具有功能的小分子 RNA
(siRNA) ，从而抑制同源的内源基因表达。但是，从
长的双链 RNA加工生成 siRNA 的具体过程并不清
楚，也就是说，不能确定具体发挥功能的小分子
RNA，具有一定的盲目性。本文介绍的方法不仅可
以持续有效的表达外源小分子 RNA，而且此法利用
内源的 miRNA成熟加工机制，可以精确的产生21 －
24 nt大小的特异小分子 RNA，增加了研究的针对性
和精确性。
3. 2 通用性
miRNA作为一种古老的基因表达调控机制，几
乎存在于所有生物中。按照最新的 miRNA 数据库
显示(miRBase release13. 0，http:/ /microrna． sanger．
ac． uk /sequences /) ，目前已有来自 103 个物种的(包
括动物、植物、微生物)近万条 miRNA 前体被发现。
理论上，本文介绍的方法可以在所有具备 miRNA的
物种中构建并表达小分子 RNA。此外，诸多数据表
明 miRNA在进化上从未停止，许多物种中都存在着
进化上年轻的或者是物种特异的 miRNA［9］。在依
照此法构建人工 miRNA 前体时，选择物种特异的
miRNA 作为骨架，可以更有效的表达外源小分
子 RNA。
3. 3 操作简便
本研究的方法在构建过程中，只需要设计三对
引物和进行两步 PCR反应，即可以得到用于定向克
隆的人工 miRNA 前体。操作过程简便、高效，省去
了诸如酶切、连接、以及多次转化等步骤，节省了大
量的时间和成本。本方法的理论基础是内源的
miRNA成熟加工机制，但是目前一些 miRNA 代谢
通路上的生成机制尚不清楚，这使此方法在应用上
具有一定的局限性。例如，预设的小分子 RNA 长
度、碱基组成、星号互补链(miRNA* )等，都有可能
会影响其表达，针对不同的小分子 RNA还需摸索相
应的试验条件。
综上所述，此方法是一种精确、通用、简便的小
分子 RNA表达载体构建方法。
参 考 文 献
［1］Chen X． MicroRNA metabolism in plants． Curr Top Microbiol Immu-
nol，2008，320:117-136．
［2］Palatnik JF，Allen E，Wu X，et al． Control of leaf morphogenesis by
microRNAs． Nature，2003，425:257-263．
［3］萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW，等，黄培堂，等译．分子克隆实验指南
(第 3 版) ［M］．北京:科学出版社，2002．
［4］崔武，刘炜，吴光耀．高效、快速地将外源 DNA 导入根癌土壤杆
菌．生物工程学报，1995，11(4) :350-355．
［5］王关林． 植物基因工程原理与技术［M］． 北京:科学出版
社，1998．
［6］奥斯伯 F，布伦特 R，金斯顿 RE，等，颜子颖，王海林译． 精编分
子生物学实验指南［M］．北京:科学出版社，1998，37-38．
［7］Zuker M． Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization
prediction． Nucleic Acids Res，2003，31:3406-3415．
［8］Castanotto D，Rossi JJ． The promises and pitfalls of RNA-interfer-
ence-based therapeutics． Nature，2009，457(7228) :426-433．
［9］Willmann MR，Poethig RS． Conservation and evolution of miRNA
regulatory programs in plant development． Curr Opin Plant Biol，
2007，10(5) :503-511．
501