全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 2期·研究报告·
收稿日期：2008-12-26
基金项目：国家 863 计划重大专项“新型植酸酶分子设计技术”（2006AA020202），国家 863 计划重点项目“特殊环境微生物资源的开发利用
技术”（2007AA021304）
作者简介：马鑫（1982-），女，硕士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学
通讯作者：平淑珍，研究员，E-mail：pingsz55@hotmail.com
β-甘露聚糖酶 （β-1，4-mannanase，EC 3.2.1.78）
又称为 β-1，4-D-甘露聚糖酶 ， 是一类能降解 β-
1，4-甘露糖苷键的甘露寡糖和甘露多糖（包括甘露
聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等）的内切水解
酶。甘露聚糖及其衍生物是构成半纤维素的第二大
组分，广泛存在于植物细胞壁、种子的胚乳、植物胶
（角豆胶、槐豆胶、瓜儿胶）中 [1]，β-甘露聚糖酶能将
甘露聚糖等多糖降解为葡萄糖 、 甘露寡糖等低聚
糖。因此，作为一种新型酶制剂，β-甘露聚糖酶在食
品、医药、造纸、石油开采和生物漂白等行业均有广
泛应用。
在食品行业，β-甘露聚糖酶降解甘露聚糖酶生
成甘露低聚糖，具有保肝、抗肿瘤、增强免疫力等生
理特性，还可作为甜味剂 [2]；在造纸业中，使用 β-甘
露聚糖酶一方面可以得到比单纯用氯漂白、碱提取
更好的纸浆特性，还可减少氯和碱的用量，降低环
芽孢杆菌 β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达
马鑫 1 赵仲麟 1，2 李亮 1 陈明 1 林敏 1 平淑珍 1
（1中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081；2中国农业大学生物学院，北京 100193）
摘 要： 从新疆极端干燥环境土壤样品中筛选到具有高β-甘露聚糖酶活性的芽孢杆菌（Bacillus sp.MX）。运用
PCR技术从该菌基因组中克隆得到β-甘露聚糖酶基因，连接到表达载体pET-28a上，在大肠杆菌BL21中高效表达
的基因产物经亲和层析纯化，SDS-PAGE凝胶电泳分析显示该蛋白的相对分子质量为41 kD。酶学性质分析表明该酶
在25~95℃，pH3.0~9.6范围内均具有酶活。最适作用温度55℃和pH值5.0，酶比活力为4572U/mg。在最适pH5.0，高
温85℃和95℃分别处理10min后，该酶相对酶活力仍保持51%和34%，显示β-甘露聚糖酶具有较好的耐酸性和热稳
定性。
关键词： 芽孢杆菌 β-甘露聚糖酶 表达 酶活
The Cloning and Expression of Bacillus sp. MX
β-mannanase Gene
Ma Xin1 Zhao Zhonglin1，2 Li Liang1 Chen Ming1 Lin Min1 Ping Shuzhen1
（1Biotechology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081；2College of Biology Science，
China Agricultural University，Beijing 100193）
Abstract： A strain ofBacillus sp. MX that have a high activity ofβ-mannanase was isolated from the soil
sample of extremely dry environment in Xinjiang province. The complete gene sequece ofβ-mannanase was amplified
by PCR and inserted into the plasmid pET-28a. The t rget rotein was expressed efficiently after transformed intoE.
coli BL21 and induced with IPTG. The molecular mass of the purified protein was determined to be approximately 41
kD by SDS-PAGE. The analysis of enzymatic properties showed that the specific activity ofβ-mannanas was 4 572
U/mg，and the optimal reaction temperature were 55℃ and pH5.0，resp ctively. The enzyme activity of the purified
protein remained 51% and 34% of the initial activity at pH 4.0，85℃ and 95℃ tre ted for 10 min，respectively，suggesting
that theβ-mannanase fromBacillus sp MX presented good acid resistance and thermal stability.
Key words： Bacillus sp.β-mannanase Expression Enzyme activity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
境污染； 在石油开采方面，β-甘露聚糖酶是油井石
油压裂液的优质生物破胶剂，具有高效、价廉、适用
范围广、对低层伤害小等特点 [3]。
甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道
内大量吸水后，增加了消化道内容物的黏度 ，抵抗
胃肠蠕动， 直接影响动物对营养物质的消化吸收。
β-甘露聚糖酶不仅具有一般非淀粉多糖 （NSP）酶
类的作用——降解 NSP，降低肠道粘度 ，促进营养
物质的消化和吸收，而且具有促进类胰岛素生长因
子 IGF-I 的分泌 ，促进蛋白质的合成 ，提高瘦肉率
的作用。因此，β-甘露聚糖酶作为饲料添加剂，可降
解甘露聚糖为易被动物吸收的低聚糖，有助动物对
营养物质的消化和吸收，大大提高了饲料的利用率[4]。
β-甘露聚糖酶广泛存在于动物、植物和微生物
中。由于微生物较动植物有易培养、产量高等优势，
商业化生产的 β-甘露聚糖酶大多都来源于微生
物。 目前 β-甘露聚糖酶的研究主要集中在产酶菌
种的筛选以及酶的分离纯化等方面，但在工业应用
上仍缺少高质量的酶源 ，特别是在饲料业中，不仅
需要高活力的酶，还需要酶在酸性环境和高温条件
下保持酶学特性。
本研究从新疆极端干燥环境下采集土壤样品
中筛得含有较高 β-甘露聚糖酶活性的芽孢杆菌 。
并从该菌基因组中克隆得到 β-甘露聚糖酶基因 ，
在大肠杆菌中得到高效表达，其表达产物在酸性环
境和高温条件下具有较好的生物学活性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 芽孢杆菌（Bacillus sp. MX）为
本实验室分离保藏；大肠杆菌感受态细胞 BL21（D-
E3）购自 TransGen Biotech 公司 ；表达载体 pET-28a
购自 Novagen 公司。
1.1.2 酶和试剂 限制性核酸内切酶 、T4 DNA 连
接酶均购于 NEB（北京）公司；槐豆角购自 Sigma 公
司；其它试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基 大肠杆菌培养基 LB； 富集培养基
（% ）：魔芋精粉 2.0，酵母膏 0.5，蛋白胨 0.3，NaCl
0.5； 固体分离培养基 （%）： 魔芋精粉 1.0，NaNO3
0.3，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，K2HPO4 0.1，FeSO4·
7H2O 0.001，琼脂 1.0，pH6.0；发酵培养基（%）：魔芋
精粉 1.0，酵母膏 0.5，蛋白胨 0.3，NaNO3 0.3，MgSO4·
7H2O 0.5，KCl 0.5，K2HPO4 0.1，FeSO4·7H2O 0.001，
pH6.0[5]。
1.2 方法
1.2.1 菌株筛选 从新疆极端环境中采集土样经
过富集培养基得到大量丰富的菌种，随后将菌液涂
布于含有魔芋的固体培养集中培养。 含有 β-甘露
聚糖酶可将以魔芋为底物的培养基形成水解圈。选
取菌落小而水解圈相对大的菌株进行后续实验。
1.2.2 菌株的总 DNA 的分离 菌株在 LB 培养基
中 30℃摇床培养 16 h，取 50 ml 培养液离心沉淀菌
体，沉淀重悬于 25 ml（1.0 mol/L）的 NaCl 中 ，4℃下
剧烈振荡，离心后沉淀用 25 ml 预冷的 TES 缓冲液
（0.01 mol/L Tris，pH8.0；0.025 mol/L EDTA；0.15 mol/L
NaCl）洗一次，沉淀再悬浮于 5 ml TE 缓冲液（不含
NaCl 的 TES）中 ，加入 0.5 ml （2 mg/ml）的溶菌酶 ，
37℃保温 15 min， 再加入 0.6 ml 的肌氨酰-蛋白酶
溶液（10%肌氨酰和 5 mg/ml 的蛋白酶溶于 TE 中），
37℃保温 1 h，细胞裂解液用苯酚、苯酚-氯仿、氯仿
依次抽提， 酒精沉淀 DNA 后溶于 pH8.0 的水中备
用。
1.2.3 β-甘露聚糖酶基因 （man）的克隆 根据已
报道的 β-甘露聚糖酶基因序列设计引物， 分别加
入位点 BamHI 和 HindIII（下划线部分）。 引物由上
海生物工程有限公司合成，分别为 F：5＇-CGGATCC-
ATGGAGGAGTTGCATTTGTTTAAG-3，R：5＇-CAAGC-
TTCTCAACGATTGGCGTTAAA-3＇。 以所提基因组为
模板，PCR 扩增出全长的 β-甘露聚糖酶基因。
1.2.4 重组质粒的构建与转化 将 PCR 产物经琼
脂凝胶电泳纯化回收，用 BamHI、HindⅢ双酶切，同
时将质粒 pET-28a 酶切。 用 T4 DNA连接酶将已双酶
切的 pET28a和 man 在 4℃过夜连接。 将连接产物转
化大肠杆菌 BL21（DE3），涂布在 LB 平板上，37℃培
养 12 h，得到重组质粒 pET28a-man。
1.2.5 重组 β-甘露聚糖酶的诱导表达纯化与酶活
检测 将 PCR 验证为正确的阳性转化子接种于 LB
液体培养基，37℃ 200 r/min 过夜培养后， 按 1%接
种量转接入 100 ml LB 培养基中 ，37℃培养 。 当
OD600=0.6 时，采用不同诱导物浓度（终浓度达 0.1～
0.6 mmol/L）、不同诱导时间 （3～24 h）、不同诱导温
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度进行表达（15~37℃）。经过条件优化组合，确定最
佳方案：加入 IPTG 使终浓度达到 0.5 mmol/L，30℃
200 r/min 培养 5 h[6]。 离心收集菌体，用超声波破碎
细胞后离心收集上清， 得到含有 β-甘露聚糖酶的
粗酶液。 取粗酶液进行 SDS-PAGE 凝胶电泳检测。
重组蛋白末端带有的 His-Tag 标签，通过 NTA 树脂
柱进行纯化。
β-甘露聚糖酶活力测定是在槐豆胶为底物的
5 ml 反应体系中 ， 加入 2 ml 不同 pH 值的缓冲液
（pH3.0～4.0，0.2 mol/L 甘氨酸-HCl 缓冲液 ；pH5.0～
7.0，0.2 mol/L 柠檬酸三钠缓冲液 ；pH8.0～9.6，0.2
mol/L 甘氨酸-NaOH 缓冲液）， 加入 1 ml 适当稀释
的酶液 ，55℃水浴 10 min， 加入 2 ml 终止液 ，用
3，5-二硝基水杨酸（DNS）法 [7]测定反应产生的还原
糖。 酶活力单位定义为在上述反应条件下，每分钟
释放 1 μmol 还原糖（甘露糖）所需酶量为 1 U。
2 结果与分析
2.1 菌株筛选
采集土样经过富集培养基得到大量丰富的菌
种， 将菌液涂布于含有魔芋的固体培养集中培养。
从众多单菌落中挑选出 3 株菌落小而水解圈相对
大的菌，经 16S rDNA 的鉴定分别为芽孢杆菌（Baci-
llus sp.）、柠檬酸杆菌 （Citrobacter sp.）、多粘芽孢杆
菌（Paenibacillus sp.）。而与其他两株菌相比，芽孢杆
菌生长速度快，菌体较小，但分泌出的甘露聚糖酶
水解底物形成的水解圈最大， 初步判断该菌 β-甘
露聚糖酶具有较高的酶活。因此，选用芽孢杆菌（命
名为 MX）为研究对象 ，进一步开展 β-甘露聚糖酶
基因的表达及酶学性质的研究。
2.2 β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达载体的构建
根据已报道的芽孢杆菌中 β-甘露聚糖酶基因
序列设计引物，以芽孢杆菌 MX 的总 DNA 为模板，
扩增出长度约为 1.0 kb 的基因片段（图 1），经测序
基因片段长度为 1 077 bp，包含完整的 β-甘露聚糖
酶基因编码序列 ，推测编码 359 个氨基酸 （图 2），
预测大小为 40.4 kD。加上表达载体上的 His-Tag 标
签序列，表达出来的融合蛋白大小约为 41 kD。 将
PCR 产物与表达载体 pET-28a 链接，转入大肠杆菌
BL21（DE3）感受态细胞 。 通过 Kan 抗性筛选转化
子、碱法提取质粒、双酶切验证，结果表明已成功将
该基因连接到 pET-28a 载体上。
2.3 β-甘露聚糖酶的诱导表达及纯化
将重组的 pET28a-man 单菌落接入 LB 液体培
养基，37℃培养。 当 OD600=0.8 时，加入诱导物 IPTG
使终浓度达到 0.5 mmol/L，30℃培养 4～6 h。 诱导后
菌液离心 ，收集菌体 ，破碎细胞收集上清 ，即为 β-
甘露聚糖酶的粗酶液。利用表达载体多克隆位点前
后的 His-Tag，使重组蛋白末端带有 His 标签。 粗酶
液中带有组氨酸尾的 β-甘露聚糖酶吸附在 Ni-NTA
树脂柱上，再用不同浓度的咪唑将目的蛋白洗脱下
来，从而实现目标蛋白的分离纯化。 经聚丙烯酰胺
凝胶电泳分析 ， 目标蛋白分子质量大小约为 41
kD，与推断出的理论分子量 （41 kD）吻合 。 不同浓
度咪唑洗脱下的蛋白条带清晰而唯一，且在咪唑浓
度为 20 mM、40 mM 条件下洗脱的蛋白量较大 （图
3）。
图 1 β-甘露聚糖酶基因 PCR 扩增
图 2 枯草芽孢杆菌 MX 的 β-甘露聚糖酶的基因序列
及推导出的氨基酸序列
马鑫等：芽孢杆菌 β-甘露聚糖酶基因的克隆及表达 79
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 2期
2.4 β-甘露聚糖酶的生物学测定
经 DNS 法测定， 表达纯化的 β-甘露聚糖酶在
最适 pH 值和最佳温度的条件下最高比活力为 4
572 U/mg（图 4）。 热稳定性试验表明，β-甘露聚糖
酶的最佳温度为 55℃。 酶活力在 25～95℃水浴中反
应 10 min 均有酶活， 并随温度的升高酶活有所上
升 ，在 35℃时酶的比活力为 3 658 U/mg，在 55℃时
达到最高 （图 4A）， 之后酶活随温度升高而降低。
85℃处理 10 min 后 ， 相对酶活为 51% ， 处理 30
min，相对酶活保持 21%；95℃处理 10 min 后的相对
酶活仍能维持 34% ，100℃沸水处理 30 min 后 ，酶
活力完全丧失。
pH 值试验表明，在温度为 55℃的条件下，β-甘
露聚糖酶在 pH3.0～9.6 的范围内都具有酶活 ，pH
值为 5.0 时酶活为最高。 而值得注意的是：pH 值在
3.0 时也具有一定酶活，为最高值的 27%，即 1 234
U/mg（图 4B）。
作为动物饲料添加剂，β-甘露聚糖酶在酸性条
件下酶活以及其热稳定性越高， 则越有使用价值，
本研究的结果表明所分离的 β-甘露聚糖酶具有较
好的耐酸性和热稳定性。
3 讨论
与其他芽孢杆菌相比 ， 该菌株所产 β-甘露聚
糖酶活性较高。通过基因工程手段将该基因转入大
肠杆菌，采用不同温度 、诱导物浓度以及诱导时间
的组合方式进行诱导表达， 均会产生大量包涵体，
可溶性的目标蛋白很少。 经过条件优化组合发现：
在菌体生长到浓度为 OD600=0.6 时 ， 加入诱导物
IPTG 使终浓度达到 0.5 mmol/L，30℃诱导 5 h 后的
产物虽仍有部分包涵体，但已能表达出大量可溶性
的 β-甘露聚糖酶。 经过 Ni-NTA 树脂柱层析，得到
纯化的酶液。经过纯化的酶液去除了表达时产生的
杂蛋白， 降低了其他物质对 β-甘露聚糖酶活性测
定的干扰，得到更为准确的研究数据。 在大肠杆菌
中表达的重组酶在最适条件下 ， 即温度 55℃、pH
5.0 时的最大比活力可达到 4 572 U/mg。目前，据国
内外文献报道， 酶活最高的 β-甘露聚糖酶来源于
枯草芽孢杆菌 WY34[8]，可达 8 302.4 U/mg，；来源于
枯草芽孢杆菌 WL-3[9]的 β-甘露聚糖酶的比活力和
最适 pH 分别为 5 900 U/mg 和 6.0； 来源于环状芽
孢杆菌 CGMCC1554[10]的 β-甘露聚糖酶的比活力和
最适 pH 分别为 4 839 U/mg 和 7.6。 虽然本试验分
离的 β-甘露聚糖酶在酶活方面与以上 3 株菌有一
定差距 ，但却高于其他菌株 ，如芽孢杆菌 MANB48
（481.55 U/mg） [11]、 枯草芽孢杆菌 KU-1 （407.7 U/
mg） [12]、枯草芽孢杆菌 BM9602（687.1 U/mg） [13]、地衣
芽孢杆菌 B2004（2 826 U/mg） [14]等。 并且本试验的
β-甘露聚糖酶作用的最适 pH 为 5.0， 适合作用于
动物的肠道； 在 pH 为 3.0 的酸性环境中依然具有
1 234 U/mg 的比活力 ，适合作用于动物胃中 [15]；在
高温 85℃和 95℃、最适 pH5.0 的环境条件下 ，该酶
仍能保持一定的活力。 因此，本研究获得的 β-甘露
聚糖酶具有一定的优势，以期应用于生产中。
由于大肠杆菌中表达量低、蛋白表达时易形成
包涵体，影响后续的纯化等过程，阻碍了产业化生
产。因此可以考虑将该基因转入酵母表达系统进行
发酵培养。 与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物
的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对
表达产物的加工修饰能力；表达载体携带有外源蛋
白分泌序列， 能高效地将外源蛋白分泌到细胞外，
避免了包涵体等问题。 运用酵母表达系统产 β-甘
露聚糖酶，无论是在理论研究还是工业应用都具有
非常广阔的前景。 还可通过基因工程（如 DNA Sh-
图 3 诱导表达后 β-甘露聚糖酶在洗脱液中的分布情况
1.NTA20；2.NTA40；3.NTA60
图 4 温度和 pH 值对 β-甘露聚糖酶活力的影响
40
116
96
45
35
25
M 1 2 3kD kD
80
2009年第 2期
uffling、定点突变等）手段对酶进行分子改造 ，使其
具备更优良特性。
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