全 文 ：生物谈术通银
研究报告 刀示口r E C 阴叭刀刀暇Y 2(X 刃 年增 刊
甘蔗基因组 D NA 小t 提取与大 , 提取方法研究
吴转娣 替逢刚 赵丽宏 罗遵喜 张树珍
( 海南大学,海口571101 ;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海口571101 )
摘 , : 甘蔗的叶片中含有大圣的多粉 多盼类和 R N 人等物质 ,对甘蔗分于生物学实脸带来了极大的影响本研究利用
改良的c T AB 对甘蔗基因组D N A 进行小贵提取方法与大贵提取方法的研究,本方法操作简单.D N A 完整性好 产全高 此度
高可满足大娜分分子实脸的雷要
关. 询 : 甘蔗 D N A ,J1 提取 D N A 大黄提取 C T八B 法
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甘蔗 (加cch ~ 川玉cin ~ L ) 是我国最重要
的糖料作物和经济作物 ,同时也是一种重要的能源
植物 人类栽培甘蔗已有 2仪X) 多年的历史 ,甘蔗糖
业的发展 ,依靠甘蔗生产的发展 ,甘蔗生产的发展
关键又在于甘蔗种质改良和高产高糖新品种的育
成和推广 随着甘蔗的育种工作和植物基因工程研
究的不断发展 ,分子辅助育种已经成为甘蔗育种工
作中的重要辅助工具 ,转基因工程研究也已经成为
了甘蔗遗传改良工作中一个快捷而有效的新技术
获得高质t 高纯度的 DN A 是甘蔗转基因分子
生物学研究的基础 ,然而 ,采用常规 CT AB 和 SD S
法 l] 提取获得的甘蔗基因组 D N A 提取物中往往含
有大量的 RN A 蛋白质 多糖 单宁和色索等杂质 ,
这些杂质呈胶状 ,严重的影响了其后的分子实验结
果的获得 ,并进一步影响到甘蔗的育种进程 本方
法在前人工作的基础上对 CTA B 法进行了改进 ,建
立了快速 简单可行 , D NA 产量高 纯度高的甘蔗
总 D N A 小量提取和大量提取方法 本方法小t 提
取获得的甘蔗基因组 D NA 可用于 PC R SRA P 分子
标记等实验 ,而大量提取则可满足 sou the m blot 实
验的要求 , 同时也可推广应用于其它植物的 DN A
提取实验中
1 材料与试荆
转基因抗性甘蔗植株及多个甘蔗品种植株均
2 X为 年 t. 刊 吴转娣等:甘蔗基因组 DN A 小量提取与大量提取方法研究 17 3
为本实验室保存
Z xCTA B 提 取 缓 冲 液 A :l(X) m m ol/L Tri s一CI,
PH S.0 ;20 m m ol/L E D TA ,P H S .0 ;1.4 m ol/L N aC I;
2% CTA B ;1% PV P ;0.5% 日一琉基乙醇
Z xCTA B 提 取 缓 冲 液 B :l(X) nu ol/L Tri s 一CI,
PH S.0 ;20 m m ol/L E D TA ,P H S .0 ;1.4 m ol/L N aC I;
2% CTA B ;2% Pv P ;l% 日一琉基乙醇
TE 缓 冲液 :10 m m ol/L Tri s一CI, pH S.o ;1 m m ol/L
E D TA ,P H S .0 ;
2 方法
2.1 甘蔗基 因组 D N A 的小童提取方法
取 巧 株转化抗性甘蔗植株及 12 份甘蔗种质
材料的新鲜幼嫩叶片约 0.1 9 , 去除叶脉 , 于液氮
中 ,研磨成粉末 ;将样品迅速转移至 2.0 耐 离心管
中 , 加人 80 闪 经 65 预热的ZxCTA B 提取缓冲
液 A ,混匀后 65 保温 30 m in ,其间轻柔摇动 2一3
次 ;取出离心管 ,冷却至室温 ,加人等体积的抓仿/
异戊醇 , 颠倒混匀至乳白色 , 室温静置 10 m in ;10
仪刃 rl m in ,离心 ro m in ;用枪头缓慢地吸出上清液 ,
转移约 6(X) 闪 至另一 2. 0 耐 无菌离心管中 , 加人
2 倍体积的无水乙醇 , 轻缓颠倒混匀 ,一20 放置
30一印而n ;12 以力 r/m in ,离心 10 m in ,弃上清液 ;用
Inil 70% 乙醇洗沉淀两次 , 吹干 , 溶于 80 闪 几
(pH 8.0)中;加人 2 闪 10 m gz ln 的 R N ase , 37 ,温
育 30 m in ;加人等体积的抓仿/异戊醇进行抽提 1-
2 次 , 10 仪洲) r/而n 离心 10 m in ;吸取上清液 ,加人
1210 体积的 N认 C(3 m ol/L pH 5.2)和 2 倍体积的无
水乙醇一20 放置 l h 左右 ;4 , 12 仪K) rl m in 离心
10 而n ;弃上清 ,用 70 % 乙醇洗沉淀三次 ,可于 70%
乙醇过夜 ; 吹干 , 溶于 10 闪 d H ZO 中 ,一20 保
存
2. 2 甘蔗基 因组 D N A 的大量提取方法
取 7 株转化抗性甘蔗植株的新鲜幼嫩叶片约
2 9 ,去除叶脉 ,于液氮中 ,加人少许石英砂 ,研磨成
粉末 ; 于研钵中加人 15 nil 经 65 预热的 ZxCTA B
提取缓冲液 B ,继续研磨 ,使植物细胞充分裂解 将
样品转移至 50 耐 离心管中加人 ,混匀后 65 保温
l h ,其间轻柔摇动 2一3 次 ;取出离心管 ,冷却至室
温 ,加人等体积的氯仿/异戊醇 ,轻缓颠倒 ,充分混
匀至乳白色 ,室温静置 10 m in ;10 X旧 r/m in ,离心
ro m in ;用 sm l枪头缓慢地吸出上清液 ,转移 上清
至另一 50 m l 无菌离心管中 ,加入 2 倍体积的无水
乙醇 ,轻缓颠倒混匀 ,一20 放置 30 一60 m in ;以剪去
尖端的灭菌 l m l枪头吸出絮状物于 2.o m L 离心
管中 ;用 l m l 7o% 乙醇洗沉淀两次 ,吹干 ,再加人
Z xCTA B 提取缓冲液 B 80 闪 , 于 37 溶解 30
m in ; 加入等体积的氯仿/异戊醇进行抽提两次 , 10
以X) r/m in 离心 10 m in ;加人 2 倍体积的无水乙醇 ,
轻缓颠倒混匀 ,一20 放置 so 一 60 m in ; 以剪去尖端
的灭菌 lm l枪头吸出絮状物于 2.o ml 离心管中 ,用
1 m 1 70% 乙醇洗涤沉淀两次 ,吹干 ,溶于 80 闪 rE
(pH 8.0)中 ;加人 5 林1 10 m gz耐 的 R N ase , 37 ,温
育 lh ;加人等体积的氯仿/异戊醇进行抽提 1 次 , ro
以X) r/m in 离心 10 m in ;吸取上清液 ,加人 1八0 体积
的 N aA e(3 m ol/L pH 5.2)和 2 倍体积的无水乙醇 , -
20 放置 l h 左右 ;4 , 12 X ) :/m in 离心 10 m in ;
弃上清 ,用 70% 乙醇洗涤沉淀三次 ,第二次洗涤过
夜 ;吹干 ,溶于 50 闪 d H必 中 ,一20 保存
2. 3 基 因组 D N A 的检 测方法
2. 3.1 基因组 D N A 的纯度及浓度的测定 取小量
提取和大量提取的甘蔗基 因组 D NA I 闪 与 295
闪 花 混合 ,以兀 为空白对照 ,分别测定其在 230
nm 260 nm 和 280 nm 的 O D 值 记录O D蒯O D ,
O D澎 O D加和 DN A 浓度值
2. 3. 2 琼脂糖凝胶电泳 取小量提取和大量提取
的甘蔗基因组 D N A , 0 .8% 琼脂糖凝胶中电脉 , D NA
样品 l 卜l ,加人 l 林 1 10x助ading Bufe ; 混匀 ,电压
lo V ,电泳 巧 m in ,于凝胶成像系统下检测 D NA
降解情况及 R N A 消化情况
2. 3. 3 P C R 检测 以小量提取获得 的转化甘蔗基
因组 D N A 为模板 , 以外源基因的 3 端和 5 端引
物 , 扩增外源基因的 78 0b p 的片段 反应体系 25
林 l:10 xPC R Bufe r 2.5 林l, M gC I: (25 m M ) 0.5卜l,
dNTps(2.5 m M ) 2.0 卜l,上游引物 p l(l(X) pm ol乍l)
1.5林l, 下游引物 P2 (l(X) pm ol单l) l.sul, Taq D N A
Po lym eras e (3 U单l) 0.2ul, 模板 D N A (50一 10 ng)
1.0协l, 加 ddH Zo 定容至 25林I
混匀 ,稍离心后 ,置于 PCR 仪上扩增 , 程序如
下:预变性94 ,s min;循环参数为:94 ,沙丽n,
1 74 性物技术通银 B勿te ehnoto 盯 2 (X 旧 年 增 刊
转化抗性甘蔗植株基因组 D N A 大量提取的电泳
分析结果如图 3 , 获得的甘蔗基因组 D NA 条带均
匀 , 表明基因组 DN A 完整性较好 , 拖尾现象不明
显 , RN A 去除效果好 ,蛋白质和多糖等杂质较少且
D N A 的产量高 可满足 So ut he m bl ot 酶切实验的需
要
图 3 转化抗性甘蔗植株大t 提取电泳分析
3 .3 PC R 检 测 结 果
小 量提取 巧 株转化 的甘 蔗抗 性植 株基 因组
DN A 为模 板 ,通过 PC R 扩增 ,有 14 株 能扩增到与
对照质粒扩增的 目的基因大小一致的条带 ,且条带
单一清晰 ,无非特异性扩增条带 证明该实验获得
的基因组 D N A 适合用于转基因甘蔗植株的 PC R
检测
6127015哪
56 , Z m in, 72 , l m in, 35eyeles, 最 后 72 , 10
m in , 4 保存 其中以转化载体质粒 D N A 作正对
照 ,以未转化甘蔗的 DN A 为负对照 , PCR 产物进行
l% 琼脂糖凝胶电泳分析并照相
2.3.4 SR AP 多态性扩增检测
以通用 引物 em l 和 m eZ 对 12 份甘蔗 种质材 料
小量提取的基因组 DN A 扩增多态性条带 , PCR 反
应体系和反应参数同参考文献12
2. 3. 5 酶切检测 以 Hi nd l 对大量提取的甘蔗基
因组 D NA 进行酶切 , 37 保温过夜 ,电泳分析
3 结果
3.1 紫外分光光度法检验
通过紫外分光光度法检测小量提取的 巧株转
化抗性 甘蔗植株和十二份甘蔗种质的基因组 D NA
的纯度及浓度 结果显示 :小量提取的甘蔗基因组
D NA O D 澎O D , 的值在 1.989 一2.106 O D耐O D , 的
值 在 1.781 一1.953 大 量 提 取 的 甘 蔗 基 因 组
DN A O D澎 O D , 的值在 1.959 一2.071 O D澎O D , 的
值在 1.60 1一1.971 表明小量和大量提取获得的甘
蔗基因组 D N A 中 R NA 小分子物质和盐等杂质去
除较好 小量提取获得的甘蔗 D N A 浓 度在 30 -
40 ng /闪 之间 , 大量提取获得的甘蔗基因组 D NA
浓度在 1.5一2.0 林g单l之laJ
3 .2 琼脂糖凝胶 电泳
巧 株转化抗性甘蔗植株及 12 份甘蔗种质基
因组 D NA 小量 提取 的电泳 分析 结果 如图 l 和图
2 ,获得的甘蔗基因组 D N A 条带平整均匀 ,清浙 ,表
明基因组 DN A 拖 尾现象不明显 , 完整性好 , RN A
去 除效果较好 ,蛋白质和多糖等杂质少 ,且在不同
种质间的总 D NA 提取都能获得很好的效果 , 适用
于 PC R 及分子标记等实验
M :中x l74一 H ine 1 di罗st;+ek:对照质粒 ;一k:未转化植株 ; l一15:转
化甘蔗植株
图 4 转 化植株的 P C R 鉴 定
圈 1 转化抗性甘蔗植株基因组 O N A 小 . 提取 电泳分析
3 .4 S R A P 多态性扩增结果
以参考文献l2] 中的通用引物 em l 和 m eZ ,对十
二份甘蔗种质材料小量提取 的基因组 DN A 进行扩
增 ,扩增获得清晰的具多态性的条带 ,表明利用本
方法小量提取获得的甘蔗基因组 D NA 符合分子标
记的 D N A 模板质量的要求(如图 5)
图 2 甘蔗种质墓因组 O N A 小 . 提取电泳分析
2 O( 珍 年 增 刊 吴转娣等:甘蔗基因组 DN A 小量提取与大量提取方法研究 175
圈 5 甘蔗不同种质小t 提取 O N A 的 S R A P 分析
3. 5 酶切检测
以 H in d ul 对 大量提取的甘蔗基因组 D N A 进
行酶切 ,酶切产物的电泳分析结果如图 6 ,甘蔗基
因组 D N A 酶切效果 良好 , 表明大量提取方法获得
的甘蔗基因组 D NA 适合用于 South ern blot
圈 6 大t 提取转化抗性甘蔗植株甚因组 O N A 的
醉切分析
4 讨论与结论
4 .1 关于取材
取材时间一般在早上为好 ,经过一夜的物质代
谢过程 ,甘蔗叶片中的糖类物质相对较少 取材部
位则以甘蔗的幼嫩叶片为好 ,因为幼嫩叶片中的杂
质较少而 D N A 含量较多 甘蔗叶片组织内的多酚
多糖和次生代谢产物含量较多 ,尤以较老的叶片中
的含量为多 , 因此取幼嫩叶片可减少 D N A 提取过
程中的杂质抽提的次数 ,减少工作量
4. 2 关于药品
本方法小量提取时用 1% PV P ;0.5% p一琉基乙
醇 , 这两种药品的用量可满足小量提取的需要 ,可
获得高质量基因组 DN A 而在大量提取时适当地
提高了用量 ,但不能多加 ,否则会产生该药品的污
染 ,影响后续反应 笔者曾用小量提取方法直接放
大用于大量提取 , 获得的甘蔗基因组 D N A 含大量
的多糖 ,沉淀物呈透明胶状 ,较难溶于水 本方法中
大量提取 D N A 时两次使用 2xCTA B 提取缓 冲液
B , 因为 CTA B 提取缓冲液能有较地去除多糖等杂
质 笔者在实验过程中比较了用酚与否对蛋白质抽
提的效果发现 ,无明显区别 ,所以在本方法中无需
用酚抽提 ,同时也减少了痕量酚残留对后续实验的
影响 用 70% 无水乙醇洗涤 DN A 过夜 ,则可以较有
效地去除 D NA 中残留的痕量药品污染
4. 3 关于实验操作
甘蔗基因组 D N A 的小量提取方法可以提取获
得高质量的 D N A ,本方法的特点 :l) 对样品的充分
研磨是获得高产量的基因组 D N A 的前提 2) 使用
无水乙醇沉淀 D N A , 因为无水乙醇能减少蛋白质
等多种杂质的释出;3) 抓仿/异戊醇进行抽提时 ,必
须充分混 匀 ,以两个 液相不容易分层为好 ,离心后
能见到中间层中出现白色杂质 4) 抽提时取上清液
必须缓慢地于液面上吸取 , 不能吸到中间层的杂
质 5) 大量提取过程中 ,两次以剪去尖端的灭菌 lml
枪头吸出絮状物 , 同样是为了减少杂质及药品残
留
对甘蔗基因组 DN A 进行了小量提取与大量提
取方法的研究 , 并应用于转化甘蔗植株的 PC R 检
测 SR A P 分子标记和酶切实验 , 实验结果表明 ,本
方法提取的 D A N 能满足大部分分子实验的要求
参考文献
1 王关林 ,方宏揭.植物基因工程原理与技术.北京:科学出版社,
19 8, 6.
2 陈涛 ,甘蔗突变体 SRAP 分子标记研究 ,广西大学硕士学位论
文 , 2(X) 7.