全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-06-03
基金项目：国家科技部 973 项目（2007CB106800），中国科学院知识创新工程前沿领域项目（KZCX3-SW-NA3-05），科技部支撑项目
（2006BAC01A08）
作者简介：孔祥军（1980-），男，博士研究生，研究方向：植物分子生物学；Tel：（0431）85542355，E-mail：kongxiangjun@neigae.ac.cn
通讯作者：梁正伟，男，研究员，研究方向：逆境生理生态和分子遗传学；E-mail：liangzw@neigae.ac.cn
羊草（Leymus chinensis）是多年生禾本科赖草属草本植物，广泛分布于我国东北、内蒙古和新疆等地。
由于其环境适应性较强，具有耐寒、耐旱和耐盐碱等优点而成为松嫩平原的优势建群种。 同时羊草也是一
种重要的牧草资源，蛋白质含量高，适口性好，耐践踏，在发展草原畜牧业方面具有重大的经济和社会效益 [1]。
以往研究表明，水分是众多生态因子中影响羊草生长发育的一个关键因子和限制因子 [2]。 植物种内的变异
分为 2 个层次： 即植物性状随环境梯度发生变化的大尺度变异和因微环境或基因漂变作用产生的小尺度
变异 [3]。羊草属异花授粉植物，种群间具有丰富的遗传多样性 [4]。为了筛选中国大安碱地生态试验站（45°35′
N～45°36′N，123°50′E～123°51′E)[5]的羊草种质资源，明确实验材料的遗传基础，探索同一生境内因基因漂
变而产生的小尺度变异，选取试验站内采集的羊草种子进行单株培养，根据表型性状筛选出 30 个典型羊
草植株，通过无性繁殖的方式获得其无性株系，并利用 RAPD技术分析所有株系的遗传结构及遗传分化程度。
羊草种质资源筛选及 RAPD遗传多样性分析
孔祥军 1，2 梁正伟 1，3 刘淼 1，2 马红媛 1，2
（1中国科学院东北地理与农业生态研究所，长春 130012；2中国科学院研究生院，北京100039；
3中国大安碱地生态试验站，大安 131317）
摘 要： 利用大安碱地生态试验站采集的天然羊草种子进行单株培养筛选具有典型表型特征的羊草（Leymus
chinensis)个体，通过无性繁殖建立了30个无性株系。RAPD分析结果表明，13个随机引物在30个羊草无性系中共扩增
出98条带，其中多态位点为88个，多态位点百分率为89.79%，平均每个引物可扩增出7条带。运用Nei和Shannon多样
性指数计算30个羊草无性系的遗传相似性系数，其平均遗传距离为0.3355。应用软件NTSYS对其做聚类分析，以0.65
为阈值可将其分为2个类群。
关键词： 羊草 种质资源 RAPD 遗传多样性
Selection of Germplasm and Genetic Polymorphism of Leymus
chinensis by RAPD
Kong Xiangjun1，2 Liang Zhengwei1，3 Liu Miao1，2 Ma Hongyuan1，2
（1Northeast Institute of Geography and Agricultural Ecology，Chinese Academy of Sciences，Changchun 130012；
2Graduate School of the Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039；3Daan Sodic Land Experiment
Station of China，Daan 131317）
Abstract： Leymus chinensis that feature typical phenotype，were selected by cultivating individuals using seeds
collected from Da′an S dic Land Experimental Station of China，and 30 strains were obtained by vegetative propagation.
The genetic polymorphism of thirtyLeymus chinensis strains was analyzed by RAPD. 13 RAPD primers generated 98
bands，with polymorphism of 88，and average 7 bands were generated by every primer. Genetic similarity was calculated
with Neis and Shannon index，and the mean genetic distance was 0.3355.Clustering analysis was performed with NTSYS
and thirty clones were divided into two groups with 0.65 threshold.
Key words： Leymus chinensis Germplasm RAPD Genetic polymorphism
2008年第 6期
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 供试羊草种子为 2007 年 7 月采自中国大安碱地生态试验站， 在可控玻璃温室中育苗，
单株移栽至花盆中生长，共 300 株。根据株高（最大伸长高度)、叶片宽度（叶片中部)、叶角度（第 2 叶与主茎
间 )、株型、叶片颜色（有无灰色蜡质 )等表型性状，筛选出 30 株具有典型特征的羊草，通过无性繁殖的方式
得到 30 个无性系（表 1)。 每个株系取约 100mg 叶片组织提取 DNA。
(cm) (°) (cm)
L01
4.0±0.7 26.6±5.7 49.8±7.1
L02
2.4±0.5 31.6±11.5 29.1±8.1
L03
5.0±0.7 23.3±2.8 49.1±6.81
L04
2.6±0.5 31.6±7.6 37.5±3.7 。。。。。
L05
5.2±0.4 25.0±8.6 43.2±6.3
L06
2.2±0.4 30.0±5.0 28.0±9.0
L07
4.4±0.5 43.3±12.5 41.2±8.7 。。。。。。
L08
3.4±1.1 41.6±2.8 34.9±8.1
L09
4.4±0.5 28.3±14.4 44.1±3.4
L10
4.2±1.3 38.3±15.2 37.7±12.9 。。。。。
L11
3.6±0.8 28.3±10.4 29.7±11.2 。。
L12
4.6±0.5 60.0±36.0 40.1±6.9
L13
4.6±0.8 76.6±15.2 57.1±1.4
L14
5.2±0.4 78.3±5.7 38.2±1.2
L15
5.8±0.8 53.3±5.7 47.3±6.8
L16
6.0±1.0 68.3±43.1 43.1±6.7
L17
3.0±0.2 23.3±5.7 32.3±3.8
L18
3.0±0.4 35.0±5.0 36.3±10.1
L19
2.8±0.4 58.3±16.0 36.2±3.1
L20
2.8±0.4 65.0±10.0 43.2±10.4
L21
3.0±0.6 26.6±5.7 39.3±6.8
L22
4.0±0.3 11.0±1.7 42.1±5.1 。。
L23
4.8±0.4 17.3±2.5 37.1±4.1 。。
L24
3.0±0.3 19.3±8.1 31.4±4.6 。。
L25
3.6±0.9 11.6±2.8 40.5±6.4 。。
L26
5.1±0.7 15.0±5.0 37.2±3.7
L27
3.3±0.4 13.3±1.5 33.8±5.6
L28
2.3±0.4 14.6±13.6 24.5±3.9
L29
3.9±0.5 42.6±10.0 20.3±3.7
L30
2.0±0.2 23.3±9.4 17.2±2.9
表 1 羊草 L1～L30 形态学观察结果
1.1.2 试剂 Taq 酶、dNTPs、RNase 购自 MBI 公司，随机引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成 ，琼脂糖
购自英国 Oxoid 公司，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 DNA 的提取及浓度测定 参照 Puchooa[6]的方法进行并稍作改进。 取供试羊草叶片 100mg 左右置于
预冷的 50ml 离心管中， 加入液氮用玻璃棒研磨成粉末状后加入 65℃预热的 CTAB （十六烷基三甲基溴化
铵 )提取液 600μl（含有 5%的 β-巯基乙醇和 2%的聚乙烯吡咯烷酮 )，混匀后于 65℃保温 10min，期间混匀 3
次。 加入等量的氯仿：异戊醇（24：1)并混匀后 12 000r/min 离心 5min，取上相重复操作 1 次。 加入 2/3 体积
的异丙醇室温静置 10min，12 000r/min 离心 10min，75%乙醇洗涤沉淀， 用 50μl 含有 RNase （终浓度 50μg/
孔祥军等：羊草种质资源筛选及 RAPD遗传多样性分析 111
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
ml)的 TE 缓冲液溶解沉淀。 50 倍稀释后于 260nm 测其吸光度，计算浓度后-20℃保存备用。
1.2.2 引物筛选及 PCR 扩增 从 30 个随机引物中筛选出 13 个扩增产物稳定、重复性好的引物，对所有
样本的基因组 DNA 进行扩增（表 2)。 经预试验优化条件后确定反应体系：总体积 25μl，其中 10×PCR 缓冲
液 （100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，0.8% Nonidet P40)2.5μl，MgCl2 2μl（25mmol/L)，引物 0.2μl（10μmol/
L)，模板 1μl（80ng)，Taq 酶 0.2μl（5U/μl)。 扩增条件：94℃ 180s 预变性；94℃ 30s，38℃ 30s，72℃ 60s，40 个循
环；72℃延伸 10min。 反应在 GenAmp PCR System 9700（Applied Biosystems)上进行，扩增产物经 1.5%琼脂糖
凝胶电泳检测，EB 染色后于 ChampGel1000（北京赛智创业有限公司)记录拍照。 分子量标准为 200bp Marker。
表 2 随机引物筛选结果
(53)
S1 GGGAAGACGG 7 7 1.000
S2 ACACTCTGCC 9 9 1.000
S5 CTCACAGCAC 9 9 1.000
S7 GGGTCGGCTT 7 7 1.000
S8 GGATCGTCGG 9 8 0.889
S12 TGGGGCTGTC 7 5 0.714
S16 GTGAATGCGG 3 2 0.667
S17 CCAGGAGAAG 7 5 0.714
S19 CACCTGCTGA 8 6 0.750
S22 CGGACTATGT 11 10 0.909
S23 CCGCCCAAAC 8 8 1.000
S25 GTGATAAGCC 6 5 0.8333
S26 CTCACGTTGG 7 7 1.000
7.385 6.618 0.883
1.3 数据分析
1.3.1 多态位点比率 在某一特定位点上，若扩增片段出现的频率小于 0.99，则此位点称为多态位点。 多
态位点比率即在所有检测位点中多态位点所占的比例。
1.3.2 Shannon 表型多样性指数 Shannon 遗传多样性指数计算公式 ：H=Σπilnπii 式中，πii 为表型频率，即
某一扩增带在第 i 个种群中出现的频率。
1.3.3 根据 Nei 公式 [7]计算遗传相似性系数和遗传距离 F=2Nxy/（Nx+Ny）式中 ，F 代表遗传相似性系数 ，
Nx，Ny 分别代表样本 x 和 y 所扩增的条带数，Nxy 代表 2 者共有的条带数。 根据遗传相似度计算遗传距离
（D=1-F）。
1.3.4 UPGMA（Unweighted pair group method using arithmetic average）聚类分析 采用 NTSYSpc 2.1 软件 [8]
构建 30 个羊草株系的系统树。
2 结果与分析
2.1 RAPD 扩增带的多态性
13 个引物共扩增出 98 条带，其中多态性的带有 88 条，多态位点百分率为 89.79%，平均每个 RAPD 引
物可获得 7 个多态位点，分子量从 200bp 到 2 500bp（图 1）。
2.2 羊草个体间的遗传多样性
2.2.1 Shannon 多样性指数 在 Shannon 信息指数的基础上，用 13 个引物所检测到的 30 个株系表型频率
计算各株系遗传多样性（表 3）。 30 个羊草株系中，L25 的遗传多样性最高（0.222），其次为 L28（0.204），而
L4、L10 和 L21 的遗传多样性最低（分别为 0.045、0.065 和 0.050），明显低于其余株系。
112
2008年第 6期
2.2.2 Nei 基因多样性指数 由 Nei 指数估算的 30 个株系基因多样性结果列于表 3， 其中以 L27 最高
（0.162），L21 最低（0.042）。
图 1 引物 S8 对单株总 DNA 的扩增结果
注：M 为 200bp 分子量标记，1～30 表示模板为 L1～L30（编号与表 1 同）
Shannon Nei
L1 32 22 0.688 0.114 0.112
L2 42 32 0.762 0.120 0.115
L3 40 30 0.750 0.133 0.128
L4 55 45 0.818 0.045 0.107
L5 39 29 0.744 0.142 0.137
L6 39 29 0.744 0.115 0.106
L7 45 35 0.778 0.163 0.148
L8 51 41 0.804 0.144 0.139
L9 46 36 0.783 0.127 0.114
L10 41 31 0.756 0.065 0.122
L11 42 32 0.762 0.115 0.110
L12 35 25 0.714 0.123 0.084
L13 43 33 0.767 0.173 0.111
L14 45 35 0.778 0.120 0.079
L15 42 32 0.762 0.127 0.119
L16 40 30 0.750 0.132 0.114
L17 39 29 0.744 0.131 0.123
L18 40 30 0.750 0.117 0.113
L19 43 33 0.767 0.128 0.135
L20 36 26 0.722 0.186 0.158
L21 51 41 0.804 0.050 0.042
L22 50 40 0.800 0.089 0.081
L23 46 36 0.783 0.115 0.075
L24 44 34 0.773 0.166 0.144
L25 53 43 0.811 0.222 0.143
L26 41 31 0.756 0.153 0.149
L27 46 36 0.783 0.172 0.162
L28 53 43 0.811 0.204 0.145
L29 41 31 0.756 0.117 0.108
L30 46 36 0.783 0.142 0.131
43.5 33.5 0.767 0.132 0.118
表 3 30 个羊草株系 RAPD 位点数和遗传多样性
2.3 遗传变异与聚类分析
30 个羊草株系遗传相似性系数 F 变异范围较大，为 0.3950～0.9000，平均遗传相似性系数为 0.6645。相
应地遗传距离 D 变化范围为 0.1000～0.6050，平均遗传距离为 0.3355。 变异最大的为 L3 与 L27，变异最小
的为 L12 与 L14。
孔祥军等：羊草种质资源筛选及 RAPD遗传多样性分析 113
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
根据遗传相似性系数用 UPGMA 法进行聚类分析
（图 2)。 30 个羊草株系在遗传相似性系数 0.65（遗传距
离为 0.35) 处大致可分为 2 个聚类群 ：L1、L3、L2、L5、
L9、L15、L4、L6、L27、L30、L20 归为一个类群 ， 其余株系
归为一个类群。
3 讨论
3.1 羊草种群内的遗传变异
一个物种种群内的个体基因水平互有差异，通常表
现出各种遗传变异，进而反映物种的进化潜力及对环境
的适应性。 羊草属风媒异交植物，无论在种间还是种内
都表现出较高的遗传多样性，且大部分变异存在于种群内 [4，9]。 即使是同一生态型的羊草如果其生境不同，
也会产生不同的表型分化，也就是说羊草会由于其生长环境比如土质、气候、施肥、水分等因素的改变而产
生不同的生态型。比如叶色属于最直观最基本的形态指标，但羊草叶色变化并不是羊草种群深度分化的标
志 [10]。 多态位点比率、Shannon 多样性指数和 Nei 基因多样性指数是衡量种群遗传变异的主要指标。 从上述
3 个指标来看，30 个羊草株系存在较丰富的遗传变异，多态位点百分率为 89.79%，高于钱吉等 [2]对不同种
群羊草的 RAPD 分析（71.9%)及和胡宝忠等 [11]对松嫩平原灰绿型和黄绿型羊草 7 个种群的分析 （83.0%)。
一个物种的进化潜力和抵御不良环境的能力取决于其遗传多样性的高低 [12]，较高的遗传多样性是羊草耐
寒、耐旱、耐盐碱等的遗传基础。
3.2 羊草种质资源选育
羊草遗传多样性的研究为以后深入开展羊草优良性状的基因标记、 基因定位与克隆等工作奠定了基
础，对遗传距离较大的植株进行杂交育种，可预期获得较大的杂种优势。初步筛选出遗传多样性丰富、遗传
变异和遗传潜力较大及综合性状优良的羊草种质材料，为羊草野生种质资源的进一步搜集、评价、种质创
新和育种利用奠定科学基础。 针对所筛选出的 30 个羊草株系，在明确了其叶宽、株高、分蘖和生物量等指
标的基础上，对其进一步进行耐盐碱鉴定、挖掘耐盐碱基因和杂交育种等研究，以期阐明羊草耐盐碱的生
理机制，并丰富羊草种质资源库。
参考文献
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图 2 L1～L30 的 RAPD 聚类分析树状图
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