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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第4期
牦 牛（Bos grunniens） 是 分 布 于 海 拔 3 000-
5 500 m，以我国青藏高原为中心及其毗邻的高山、
亚高山地区的特有牛种之一。我国现有牦牛 1 470
余万头，占世界牦牛总数的 95%，占我国牛只总数
的 1/6，为当地牧民提供奶、肉、毛、役力、燃料等
生活生产必需品。其中牦牛毛是传统特产，产量大，
质量好，除供应国内需要外，是我国出口畅销的畜
产品之一，并以白牦牛毛最为驰名。牦牛毛、绒制
品深受喜爱，但是由于大多数牦牛为黑色、黑白色
和褐色等，颜色较深不易染色，导致牦牛毛制品出
现颜色单一，不能满足广大消费者的需求［1-3］。因此，
从基因水平探究控制牦牛毛色遗传的主效基因具有
重要的意义。
收稿日期 ：2013-11-13
基金项目 ：国家科技支撑计划课题（2012BAD13B06），中央高校基本科研业务费专项资金项目（11NZYTH03）
作者简介 ：陈思，女，硕士，研究方向 ：基因组学与生物信息学 ；E-mail ：swunyak2525@163.com
通讯作者 ：钟金城，男，博士，教授，研究方向 ：动物遗传学 ；E-mail ：zhongjincheng518@126.com
牦牛 MC1R 基因的多态性研究
陈思1  柴志欣1，2  王永1，2  钟金城1，2
（1. 西南民族大学 动物遗传育种学国家民委-教育部重点实验室，成都 610041 ；2. 西南民族大学青藏高原研究院，成都 610041）
摘 要 ： 旨在为探究牦牛 MC1R 基因多态性与毛色形成的相关性，利用 PCR-SSCP 和 DNA 测序技术，对 64 头牦牛（33 头
黑色九龙牦牛，31 头白色天祝白牦牛）的 MC1R 基因多态性进行检测。结果表明 ：天祝白牦牛和九龙牦牛均有 3 种基因型（AA、
BB、AB），但天祝白牦牛的多态性较低，而九龙牦牛表现为中度多态。经 χ2 适合性检验，2 个牦牛品种在该基因多态位点上均偏
离 Hardy-Weinberg 平衡。测序结果表明 BB 型与 AA 型在该片段的第 179 位碱基处存在 C → A 单碱基突变 ；第 214 位碱基处发生
T → C 突变。
关键词 ： 牦牛 MC1R 基因 PCR-SSCP 基因多态性
The Polymorphism of MC1R Gene in Yak
Chen Si1 Chai Zhixin1，2 Wang Yong1，2 Zhong Jincheng1，2
（1. Key Laboratory of Animal Genetics and Breeding，Southwest University for Nationalities，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of
Education，Chengdu 610041 ；2. Institute of Tibetan Plateau Research，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）
Abstract:  It was to explore the relationship between MC1R genotype and the coat color formation in yak, polymorphism of MC1R gene
was detected by PCR-SSCP and DNA sequencing techniques in 64 yaks（33 white coat color and 31 black coat color）. The results showed that
there were polymorphisms in the amplified region for the Tianzhu yak and Jiulong yak. In Tianzhu yak and Jiulong yak, three genotypes（AA,
BB and AB）were detected. The result of χ2, three yak breeds were not fit for Hardy-Weinberg law. Sequencing revealed on single nucleotide
mutation（C → A）at 179bp and（T → C）at 214 bp of the amplified region of Tianzhu yak and Jiulong yak.
Key words:  Yak MCIR gene PCR-SSCP Polymorphism
黑色素皮质素受体Ⅰ（melanoccortin receptor Ⅰ，
MC1R）在黑色素细胞中表达 MC1R，与天然配体 α-
促黑素细胞激素（α-MSH）相互作用，经由 G 蛋白
耦合的 CAMP 信号通路，调节黑色素细胞内的一系
列级联反应，最终经多巴或多巴胺合成各自的衍生
物——褐黑素或真黑色素，使动物呈现不同的毛色
或羽色［4］。目前，研究表明在人、马、牛、绵羊、猪、犬、
狐狸和鼠等哺乳动物中均发现了 MC1R 基因的突变
与黑色素性状变异或皮肤癌等疾病有关。且作为影
响动物黑色素的重要基因广泛用于相关研究。本研
究选择两个不同毛色的牦牛品种为研究对象，应用
PCR-SSCP 技术对牦牛 MC1R 基因进行多态性分析，
以期为牦牛毛色形成规律的研究提供一些参考资料。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期88
1 材料与方法
1.1 材料
选取健康成年的九龙牦牛、天祝白牦牛作为试
验动物（表 1），采集耳组织，75% 乙醇保存带回实
验室，-80℃保存备用。
表 1 试验动物、采样地点及毛色
试验动物 采样地点 样本数量（头） 毛色
九龙牦牛 四川省九龙县 33 黑色
天祝白牦牛 甘肃省天祝县 31 白色
1.2 方法
1.2.1 基因组 DNA 提取及检测 采用动物组织基
因组 DNA 提取试剂盒（Tiangen 生物技术有限公司）
提取基因组 DNA，用 10 g/L 的琼脂糖凝胶电泳和紫
外分光光度计双重检测 DNA 的纯度和浓度，-20℃
保存备用。
1.2.2 引物设计与 PCR 扩增 根据普通牛 MC1R 基
因组序列（GenBank Accession No ：NC_007316），综
合利用软件 primer5.0、Oligo6.0 设计引物，覆盖片
段长度为 268 bp。引物 ：PF ：5-GGAGAACGTGCT-
GGTAGTG-3，PF ：5-GGGCGTAGAAGATGGAGAT-
G-3，由上海英骏生物技术有限公司合成，去离子水
稀释（100 pmol/μL），-20℃保存备用。
PCR 反 应 采 用 25 μL 体 系 ：10×Taq Buffer 2.5
μL，dNTP Mixture（10 mmol/L）1.5 μL， 上 下 游 引
物 (10 pmol/mL) 1.0 μL，DNA Template (25 ng/μL) 1.5
μL，Taq Polymerase（5 U/μL）0.25 μL，ddH2O 17.25
μL。PCR 反应程序 ：94℃预变性 5 min ；94℃变性
45 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35 个循环 ；最
后 72℃延伸 3 min，8℃保存。
1.2.3 PCR 产 物 SSCP 分 析 采 用 0.1 g/mL（Arc∶
Bis 质量比为 29∶1，缓冲液为 1×TBE）的非变性丙
烯酰胺凝胶电泳检测 ：取 5 μL PCR 产物，加入 8 μL
上样缓冲液（φ=95% 去离子甲酰胺、0.25 g/L 二甲
苯青、2.5 g/L 溴酚蓝），98℃变性 10 min，立即置于
冰浴中放置 10 min。变性后的 PCR 产物，200 V 电
压电泳 10 min 后 140 V 恒压电泳 4 h，银染显带后，
观察结果。
1.2.4 测序分析 选取纯合基因型个体进行克隆测
序，运用 BioEdit、DNAMAN 软件对测序结果进行校
对分析。
1.2.5 统计分析
1.2.5.1 基因频率及基因型频率 一个基因座位上
具有两个等位基因的情况下，基因频率计算公式
如下［5］：
p=（2nAA+nBB）/[2（nAA+nAB+nBB）]
q=（2nAA+nBB）/[2（nAA+nAB+nBB）]
其中 ：p 是等位基因 A 的基因频率，q 是等位
基因 B 的基因频率，nAA、nAB、nBB 分别是群体中基
因型 AA、AB 和 BB 型的个体数。
1.2.5.2 群体杂合度（Heterozygosity，H） 杂合度，
即某一基因位点上等位基因间杂合的程度。平均杂
合度是衡量群体内遗传变异的有效指标。平均杂合
度越大，群体内遗传变异程度越大。杂合度计算公
式为 ：
Ho = ∑ Pi
2

m
i=1
He = 1  ∑ Pi2 mi=1
其中 ：m 为等位基因数，Pi 为第 i 个等位基因
频率。
1.2.5.3 多态信息含量（PIC） PIC 用于对标记基因
多态性的估计，是表示 DNA 变异程度的高低的一
个指标，PIC ＞ 0.5 为高度多态，0.25 ＜ PIC ＜ 0. 5
为中度多态，PIC ＜ 0.25 为低度多态。PIC 可根据
Bostein 等［6］的公式进行计算。
PIC = ∑ Pi
2
= ∑ ∑ 2Pi
2
Pj
2
m mm-1
其中 ：m 为等位基因数目，Pi 和 Pj 分别为第 i
个和第 j 个等位基因在群体中的频率。
1.2.5.4 Hardy-Weinberg 平衡检验［7，8］ 检验公式为：
H2 = ∑ df ı 2ni
Oi  Ei2
Ei
其中 ：Ei ：理论值，Oi ：实际观察值，n 为等
位基因数。
2 结果
2.1 PCR扩增结果
凝胶电泳检测结果（图 1，图 2）显示，扩增产
物片段大小 268 bp 左右，与设计的产物大小一致，
扩增结果良好，可用于 SSCP 分析。
2014年第4期 89陈思等 ：牦牛 MC1R 基因的多态性研究
268
bp
M
图 1 天祝白牦牛 PCR 扩增的琼脂糖凝胶电泳图
268
bp
M
图 2 九龙牦牛 PCR 扩增的琼脂糖凝胶电泳图
2.2 牦牛的PCR-SSCP多态性
对天祝白牦牛、九龙牦牛 MC1R 基因的扩增片
段进行单链构象多态性分析，银染后在凝胶成像系
统中的检测结果见图 3 和图 4。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1，2，4，5，7，8，9 ：AA 型 ；3，10 ：BB 型 ；6 ：AB 型
图 3 天祝白牦牛 PCR-SSCP 检测
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1，3，4，6，7，8 ：AA 型 ；2，9 ：BB 型 ；5，10 ：AB 型
图 4 九龙牦牛 PCR-SSCP 检测
170 180 190 200 210 220
ཙ⾍AAཙ⾍BBҍ嗉AAҍ嗉BB
图 5 天祝白牦牛与九龙牦牛 AA、BB 型比对图
2.4 牦牛品种的遗传多样性
在天祝白牦牛和九龙牦牛中均检测到 3 种基因
型，分别定义为 AA 型、BB 型、AB 型（图 3，图 4）。
在 31 头天祝白牦牛中检测到 15 头 AA 型、4 头 BB 型、
12 头 AB 型 ；在 33 头九龙牦牛中检测到 7 头 AA 型、
5 头 BB 型、21 头 AB 型。结果（表 2）显示，天祝
白牦牛 AA 型频率为 0.483 9、BB 型频率为 0.1290、
AB 型 频 率 为 0.387 1 ；九 龙 牦 牛 中 AA 型 频 率 为
0.212 1、BB 型频率为 0.151 5、AB 型频率为 0.636 4。
天祝白牦牛的杂合度为 0.321 2，多态信息含量
为 0.201 6 ；九龙牦牛的杂合度为 0.498 2，多态信息
含量为 0.374 1（表 2）。按 Bostein 等提出的衡量基
因变异程度高低的多态信息含量指标，天祝白牦牛
的多态信息含量为低度多态（PIC ＜ 0.25）；九龙牦
牛的多态信息含量为中度多态（0.25 ＜ PIC ＜ 0.5），
且杂合度较高，遗传变异较大。
Hardy-Weinberg 平衡的 χ2 适合性检验结果表明，
天祝白牦牛的 χ2 值为 6.04，差异显著，偏离 Hardy-
Weinberg 平 衡（P ＜ 0.01）；九 龙 牦 牛 的 χ2 值 为
11.33，差异极显著，也不符合 Hardy-Weinberg 平衡（P
＜ 0.01）。推测这 2 个牦牛品种在该位点上受到较大
选择、突变等因素的影响。
3 讨论
近年来，就 MC1R 基因遗传多态性对家畜毛色
影响方面，李洪涛等［9］利用 PCR-SSCP 和实时荧光
定量技术研究哈萨克绵羊 MC1R 和 ASIP 基因多态性
及表达量与被毛颜色表型的相关性，发现 MC1R 基
因的多态位点（P.M73K）与被毛颜色极显著的相关（P
＜ 0.01）且黑色被毛中 MC1R 基因的表达量与白色
被毛中差异极显著（P ＜ 0.01），与棕色被毛差异显
著（P ＜ 0.05）。姜俊兵等［10］通过对中国羊驼种群
MC1R 基因的 PCR-SSCP 检测发现 AA 和 AB 基因型，
且 AA 基因型均存在于有色被毛羊驼个体中。唐贺
等［11］研究发现在文山黄牛、昭通黄牛和短角牛中
发 现 E+ 和 e 2 种 等 位 基 因， 检 测 到 E+/E+、E+/e 和
2.3 PCR-SSCP结果的测序分析
将天祝白牦牛和九龙牦牛中 AA、BB 型个体的
PCR 产物进行克隆测序。序列比对结果发现 ：BB 型
与 AA 型相比在该片段的第 179 碱基处存在 C → A
的单碱基突变 ；在第 214 碱基处有一个 T → C 的单
碱基突变（图 5）。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第4期90
e/e 3 种基因型，而在迪庆黄牛中存在 E+/E+、ED/ED、
E+/ED、E+/e 和 ED/e 5 种基因型 ；与所研究个体的毛
色相联系发现，E+ 和 ED 等位基因与黑色表型有关，
而 e 等位基因与红色表型有关，但黄色、棕色和红
色表型还与其它座位基因相关联。
本研究通过 PCR-SSCP 分析方法显示，九龙牦
牛、天祝白牦牛的 MC1R 基因部分序列存在多态性。
其扩增片段均存在 AA、AB 和 BB 3 种基因型，其中
A 为优势等位基因。且该片段存在两个突变位点 ：
179 bp 处 C → A 突变，214 bp 处 T → C 突变，但这
些突变在黑色、白色牦牛中均出现。所以该基因的
核苷酸及相应蛋白水平上的差异是否导致牦牛毛色
的差异，有待进一步深入研究。
从群体遗传多态性角度分析，多态信息含量和
群体杂合度都是对群体内遗传变异大小的衡量指标。
本研究中九龙牦牛的杂合度为 0.498 2，多态信息含
量为 0.374 1，处于中度多态，遗传变异较丰富，且
杂合度较高，选择潜力大。天祝白牦牛的多态信息
含量、杂合度较九龙牦牛的低，说明两个牦牛品种
在 MC1R 基因该片段上有一定的多态性差异，但多
态性水平均较低，这与近年来对这两个品种在体态
外貌、生理生化、细胞（染色体）、分子等不同水
平和层次以及生产性能、产区地形地貌、水热条件
等自然和社会生态环境方面的综合研究和分析结果
相吻合，反映了其各自的遗传特性。卡方适合性检
验结果表明，两个牦牛品种在该突变区域均偏离
Hardy-Weinberg 平衡状态，说明经过长期的进化和
选择，目前这两个品种在该位点仍受选择、突变、
遗传漂变等因素的影响。进一步开展牦牛 MC1R 基
因的相关研究，对深入了解该基因的功能，寻找控
制牦牛毛色的深层机理有重要意义。
4 结论
九龙牦牛和天祝白牦牛 MC1R 基因部分序列存
在两个突变位点，第 179 位的 C → A 突变，第 214
位的 T → C 突变。群体遗传学分析显示九龙和天祝
白牦牛均存在遗传变异。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）
表 2 牦牛品种 MC1R 的基因频率和基因型频率及遗传分析
品种
等位基因频率
数量（头）
基因型频率
杂合度（He） 多态信息含量（PIC） 平衡检验 χ2 值
A B AA BB AB
天祝白牦牛 0.758 1 0.322 6 31 0.483 9 0.129 0 0.387 1 0.321 2 0.201 6 6.04
九龙毛牛 0.530 3 0.469 7 33 0.212 1 0.151 5 0.636 4 0.498 1 0.374 1 11.33
χ2（df=1，0.05）=3.84，χ2（df=1，0.01）=6.63