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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
黑素皮质素受体 1（melanocortin 1 receptor，MC-
1R）基因是控制动物黑色素合成的重要基因［1］，
在黑色素细胞、肾上腺皮质细胞、神经系统和免
疫系统中表现出不同的功能，将存在于黑色素细
胞中的黑色素皮质素受体称为“黑素皮质素受体
1（MC1R）”。MC1R 基因在哺乳动物中由 extension
位点编码，为 G 蛋白耦合受体 - 黑素皮质素受体
（melanocortin receptors，MCRs）家族成员之一，只
有一个编码区［2］，其编码的蛋白质有 7 个跨膜结构
域，主要表达于动物的黑色素细胞，为 G 蛋白耦合
受体中最小的一个。有报道称，MC1R 基因的一些
突变能影响动物体内色素的合成，进而改变动物的
收稿日期 : 2012-02-29
基金项目 : 国家科技支撑计划项目（2009BAC53B06）
作者简介 : 高旭东 , 男 , 硕士 , 研究方向 : 临床兽医学产科 ; E-mail: gxdong123@163.com
通讯作者 : 余四九 , 男 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 动物生殖生理 ; E-mail: sjyu@163.com
四个牦牛品种MC1R基因部分序列的多态性研究
高旭东1， 2 余四九1 王明亮1 陈鹏1 郝明超1 刘 1 王继卿2
（1 甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070 ；2 甘肃省草食动物生物技术重点实验室，兰州 730070）
摘 要： 为探索 4个牦牛品种 MC1R基因多态性的相关信息，选取甘南牦牛、天祝白牦牛、青海高原牦牛、大通牦牛 4个
品种共 408头个体为研究对象，采用 PCR-SSCP方法分析牦牛 MC1R基因部分序列的基因多态性。结果表明，与 GenBank中牛
MCIR基因序列（登录号：AF445641.1）比对发现，该扩增片段在 3 891 bp处发生 C → G的突变，在 3 912 bp处发生 T → C的突变，
共发现 CC、DD、EE、CD、CE和 DE 6种基因型。4个牦牛品种中 CD、CE和 DE 3种基因型在青海高原牦牛和大通牦牛中占主要
优势，这 3种基因型频率总和在青海高原牦牛和大通牦牛群体中分别是 0.778和 0.781。DD和 CD两基因型是甘南牦牛群里中的优
势基因型，其基因型频率分别是 0.351和 0.328。天祝白牦牛中优势基因型是 DD，其基因型频率是 0.500。D等位基因是 4个地方
品种牦牛中的优势等位基因。4个地方品种在该基因座上都处于 Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。青海高原牦牛和大通牦牛两
个群体处于高度多态（PIC>0.5），甘南牦牛和天祝白牦牛处于中度多态（0.25 关键词： 牦牛 MC1R基因 PCR-SSCP 基因多态性
Polymorphism in Part Sequence of MC1R Gene in Four Yak Breeds
Gao Xudong1， 2 Yu Sijiu1 Wang Mingliang1 Chen Peng1 Hao Mingchao1 Liu Ben1 Wang Jiqing2
（1College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2Gansu Province Key Laboratory of Grazing Animal
Biotechnology，Lanzhou 730070）
Abstract: To explore genetic polymorphisms of MC1R gene in yaks by PCR-SSCP technique, 408 yaks were selected which include
Gannan yak, Tianzhu White yak, Qinghai Highland yak and Datong yak. The sequencing result showed that there were a base transformarion
of C → G at the 3 891th bp and a base transformarion of T → C at the 3 912th bp contrasting with the AF445641.1 of cattle in MCIR gene. Six
genotypes CC, DD, EE, CD, CE and DE were detected. The genotypes CD, CE and DE were advantage genotypes in Qinghai Highland yak and
Datong yak, the genotype frequency were 0.778 and 0.781. The genotypes DD and CD were advantage genotypes in Gannan yak, the genotype
frequency were 0.351 and 0.328. The advantage genotypes in Tianzhu White yak were DD and the genotype frequency was 0.500. The frequency
of D allele was higher than other alleles in four breeds. The populations of yaks were Hardy-Weinberg equilibrium at these locus. Qinghai
Highland yak and Datong yak. Gannan yak and Tianzhu White yak, the polymorphisms information contents were moderate polymorphisms
（0.25 Key words: Yak MC1R gene PCR-SSCP Genetic polymorphism
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期142
毛发和皮肤的颜色［1-7］。
牛 MC1R 基因位于第 18 号染色体［5］，整个基
因 长 5 493 bp，cDNA 全 长 1 753 bp，CDS 序 列 共
954 bp，编码 318 个氨基酸［7］。Klungland 等［2］发现，
牛 MC1R 基因中一个显性等位基因的一个点突变，
导致黑色毛色 ；在纯合双隐性突变牛中，产生一个
未成熟便终止的 MC1R 蛋白，导致红色毛色 ；野生
型 MC1R 的等位基因，产生多样毛色，其可能调节
正常的 MC1R 受体。我国已经有人对猪［8］、犬［9］以
及鸡［10］MC1R 基因与毛色进行了分析，发现这几种
动物的毛色和 MC1R 基因存在显著的相关性，但国
内有关牦牛 MC1R 基因与毛色方面的研究工作开展
很少。本研究采用 PCR-SSCP 方法和 DNA 测序技术
首次研究青海高原牦牛、甘南牦牛、天祝白牦牛和
大通牦牛 4 个地方品种的 MC1R 基因，从分子水平
上阐明不同牦种群之间 MC1R 基因的多态性，旨在
为研究牦牛MC1R基因和毛色的相关性做铺垫工作。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集 本试验采集 403 头健康牦牛血样：
其中甘南牦牛 174 头，天祝白牦牛 120 头，青海牦
牛 54 头，大通牦牛 55 头，颈静脉采血 10 mL，ACD
（酸性柠檬酸葡萄糖）抗凝，-20℃保存备用。
1.1.2 主要试剂和仪器 蛋白酶 K、Tris 饱和酚、
Premix Taq Version 2.0、琼脂糖、丙烯酰胺、甲叉双
丙烯酰胺。
梯度 PCR 仪 ：美国 ABI 公司 ；PROTEAN Ⅱ xi
Cell 双垂直电泳槽、Powerpac Universal 电泳仪 ：美
国 BIO-RDA 公司 ；DYCP-31DN 水平电泳槽 ：北京
六一仪器厂；F32加热、制冷循环仪：德国Julabo公司。
1. 2 方法
1.2.1 DNA 的提取 采用常规的苯酚 - 氯仿抽提法
从冷冻血样中提取 DNA，用 ddH2O 溶解，-20℃冻存。
1.2.2 引物设计和 PCR 扩增 参照 GenBank 中牛
（登录号 ：AF445641.1）MC1R 基因序列，目的片段
是 3 783-4 052 bp，用 Primer5.0 软件设计引物，预
期片段是 270 bp，上游引物 ：5-GCTGGGCGTCTT-
CTTCCT-3，下游引物 ：5-GGATGACCTTGTGGTTG-
TAG-3，交由北京六合华大基因科技股份有限公司合
成。PCR 反应体系为 20 μL，包括 Premix Taq 10 μL，
ddH2O 8 μL，上游引物和下游引物各 0.5 μL（浓度为
10 μmol），DNA 模板 1 μL。反应程序 ：95℃预变性
5 min；95℃变性 30 s，58℃退火 40 s，72℃延伸 50 s，
共 35 个循环；最后 72℃延伸 7 min。PCR 产物用 1%
的琼脂糖凝胶电泳检测，确定扩增产物为预期的目
的条带并具有较好的特异性后，再进行 SSCP 分析。
1.2.3 SSCP 检测 取 2 μL PCR 产物置于 PCR 管
中，加 8 μL 变性缓冲液（98% 的去离子甲酰胺中
加入 EDTA（pH8.0）至终浓度 10 mmol/L，0.025%
溴酚兰，0.025% 二甲苯菁），离心混匀，98℃变性
10 min 后迅速放入冰中 10 min。将变性后的 PCR 产
物加入 120 g/L 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（其中
Acr Bis=39 1，胶浓度为 12%，电压 220 V，10℃
条件下电泳 19 h），最后用银染法显色并拍照。
1.2.4 测序 经 PCR-SSCP 分析后，将不同类型的
PCR 产物交由北京六合华大基因科技股份有限公司
测序。
2 结果
2.1 PCR扩增
经琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，得到一条约
270 bp 的目的条带，与预期的扩增片段长度相符，
且无拖尾或杂带现象出现（图 1），可直接用于 SSCP
分析。
2.2 SSCP检测
PCR 产物经 SSCP 检测，结果存在 6 种基因型 ：
CC、DD、EE、CD、CE 和 DE（图 2）。
2.3 不同基因型序列分析
将不同基因型的 PCR 产物测序，与 GenBank 中
牛（登录号 AF445641.1）MC1R 基因序列比对发现，
该扩增片段在 3 891 bp 处发生 C → G 的突变，在
3 912 bp 处发生 T → C 的突变（图 3）。
2.4 基因型频率和基因频率统计
采用群体遗传学方法，统计分析了本试验中两
个突变位点在 4 个地方品种牦牛群体中的基因型频
率和基因频率。结果（表 1）表明，青海高原牦牛
中 CD、CE 和 DE 3 种基因型所占比例较高，甘南牦
牛中 DD、CD 两种基因型占据的比例较高，天祝白
牦牛群体里 DD 基因型是优势基因型，大通牦牛中
2012年第8期 143高旭东等 ：四个牦牛品种 MC1R 基因部分序列的多态性研究
图 1 牦牛MC1R基因中 3783-4052 bp的 PCR扩增产物
M. DNA Marker 500 ；1-14. PCR 产物
图 2 牦牛MC1R基因中 3783-4052 bp的 PCR-SSCP检测
图 3 MC1R基因部分序列 6种不同基因型的序列比对
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期144
CD、CE、DE 3 种基因型占主要优势，CC 和 EE 基
因型频率在 4 个地方品种牦牛中都较低。4 个地方
品种中最高的等位基因频率都是 D 等位基因频率，
青海高原牦牛、甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛
群体中 D 等位基因频率分别是 0.398、0.583、0.683
和 0.382。
表 1 MC1R基因中 3783-4052 bp扩增片段的基因型频率和等位基因频率
品种 样本数 基因型频率 等位基因频率CC DD EE CD CE DE C D E
青海高原牦牛 54 0.037 0.130 0.056 0.278 0.241 0.259 0.296 0.398 0.306
甘南牦牛 174 0.080 0.351 0.023 0.328 0.080 0.138 0.285 0.583 0.132
天祝白牦牛 120 0.033 0.500 0.033 0.200 0.067 0.167 0.167 0.683 0.150
大通牦牛 55 0.073 0.109 0.036 0.218 0.236 0.327 0.300 0.382 0.318
2.5 遗传多态性指标和Hardy-Weinberg平衡分析
对 4 个地方品种牦牛做多态信息含量（PIC）、
纯合度（Hom）、杂合度（Het）、有效等位基因数
（Ne）和 Hardy-Weinberg 平衡分析。结果（表 2）表
明，4 个地方品种在该基因座上都处于 Hardy-
Weinberg 平衡状态（P>0.05）。青海高原牦牛和大通
牦牛两个群体处于高度多态（PIC>0.5），甘南牦牛
和天祝白牦牛处于中度多态（0.25表 2 牦牛MC1R基因中第 3783-4052 bp扩增片段的遗传多态性指标
品种 多态信息含量（PIC） 纯合度（Hom） 杂合度（Het） 有效等位基因数（Ne） χ2
青海高原牦牛 0.587 0.222 0.778 2.944 3.893
甘南牦牛 0.492 0.454 0.546 2.280 0.791
天祝白牦牛 0.435 0.567 0.433 1.933 3.145
大通牦牛 0.590 0.218 0.782 2.967 4.891
3 讨论
牦牛的毛和绒是高档的纺织原材料，尤其是白
牦牛的毛和绒，白牦牛毛色纯白，可染成各种颜色，
绒纤维细、强度大、光泽好、富有弹性、可纺性强，
是制作高档毛绒衣物的上好材料，具有较高的利用
价值。近几年，牦牛毛绒制品在我国的粗纺领域中
得到了充分的利用和开发，其产品集轻薄、柔软、
滑润、保温、美观于一体，成为人们追求的理想衣着，
在国内外市场享有很高的声誉。然而动物的毛色形
成是一个复杂的过程，除受后天环境的影响外，基
因是最主要因素。在哺乳动物中，皮肤与毛发的颜
色主要是由毛皮中的真黑色素（黑色与褐色）与脱
黑色素（红色与黄色）的相对数量与分布情况所决
定的。α-MSH 与 MC1R 结合引起环腺苷酸水平的提
高，并且激发酪氨酸酶水平的提高，导致真黑色素
的形成。鼠MC1R基因发生3个突变导致隐性黄色鼠、
黑色鼠和烟色鼠［11］。马 MC1R 基因的一个错义突变，
产生 Ser83Phe 替换，对应深棕色（栗色）毛性状［12］。
在 Holstein 牛中，一个功能失去性的突变导致红色
毛色［13］。Vage 等［14］分析了黑色绵羊的 MC1R 基
因，发现了两个突变 ：Asp121Asn 与 Met73Lys。引
进鼠的相对应的 MC1R 基因进行药理学分析后揭示，
Met73Lys 突变显示为组成型活性的 MC1R，其可能
导致绵羊的黑色毛色。邓素华等［15］发现，猪 MC1R
基因有诸多变异，其与众多毛色类型的对应关系研
究的也较为透彻。Evrets 等［16］发现，犬在第 916 位
核苷酸位置的一个点突变 C/T 使 305 位的 Arg 变成
一个终止密码子，编码一个缩短了的失去功能的
MC1R 蛋白，导致黄色毛色。
通过 PCR-SSCP 方法分析，青海高原牦牛、甘
南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛黑色素皮质素受体
1（MC1R）基因的部分序列存在多态性，且在该段
序列中存在两个突变 ：3 891 bp 处 C → G 的突变，
3 912 bp 处 T → C 的突变。至于这两个位点上的变
2012年第8期 145高旭东等 ：四个牦牛品种 MC1R 基因部分序列的多态性研究
异是否会导致牦牛毛色的差异，还有待进一步研究。
这两处突变产生了 6 个基因型，分别是 CC、DD、
EE、CD、CE 和 DE，这 6 种基因型在青海高原牦牛、
甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛中都有出现，可
见这 4 个牦牛地方品种（MC1R）基因都存在变异，
之后的多态信息含量分析也证实了这一点。4 种牦
牛地方品种中优势基因型存在差异，其中只有青海
高原牦牛和大通牦牛的优势基因型相同，这可能和
地域因素有关，天祝白牦牛的优势基因型 DD 的基
因型频率达到 0.500，这可能和长期种内繁殖有关。
进一步开展牦牛 MC1R 基因的研究，对深入了解该
基因的功能，寻找控制牦牛毛色的深层机理有重要
意义。
4 结论
本研究首先克隆得到了 4 个牦牛地方品种
（MC1R）基因部分序列，通过 PCR-SSCP 方法首次
发现 4 个牦牛地方品种 MC1R 基因的两个突变，与
GenBank 中牛（登录号 AF445641.1）MCIR 基因序
列比对分别是 3 891 bp 处 C → G 的突变和 3 912 bp
处 T → C 的突变。群体遗传学分析多态信息含量
（PIC）、基因纯合度（Hom）、基因杂合度（Het）、
有效等位基因数（Ne）的分析说明 MC1R 基因在牦
牛群体内存在遗传变异。
参 考 文 献
［1］ Russo V, Fontanesi L, Scotti E, et al. Analysis of melanocortin 1
receptor （MC1R） gene polymorphisms in some cattle breeds ：their
usefulnessand application for breed traceability and authentication
of Parmigiano Reggiano cheese. Italian Journal of Animal Science,
2007, 6（3）：257-272.
［2］ Flanagan N, Healy E, Ray A, et al. Pleiotropic effects of the melano-
cortin 1 receptor （MC1R） gene on human pigmentation. Hum Mol
Gene, 2000, 9（17）：2531-2537.
［3］ Miao YW, Wu GS, Wang L, et al. The role of MC1R gene in buffalo
coat color. Sci China Life Sci, 2010, 53（2）：267-272.
［4］ Chen SY, Huang Y, Zhu Q, et al. Sequence characterization of the
MC1R gene in yak （Poephagus grunniens） breeds with different coat
colors. J Biomed Biotechnol, 2009, 2009 ：1-6.
［5］ Shinji S. Allele frequencies of the extension locus encoding the
melanocort in-receptor in Japanese and Korean cattle. Animal
Science Journal, 2005, 76（2）：129-132.
［6］ 高莉 , 董常生 , 赫晓燕 , 等 . 羊驼酪氨酸酶基因家族在不同
毛色个体中的基因表达水平 . 畜牧兽医学报 , 2008, 39（7）：
895-899.
［7］ 甘海云 , 李建斌 , 王洪梅 , 等 . 牛黑素皮质素受 I（MC1R）基
因与毛色表型的研究 . 遗传 , 2007, 29（2）：195-200.
［8］ 唐贺 , 高英凯 , 苗永旺 . 4个黄牛群体黑素皮质素受体1（MC1R）
基因变异研究 . 畜牧兽医学报 , 2010, 41（6）：639-643.
［9］ 巴彩凤, 郭多, 苏玉虹, 朱宝芹.犬MC1R基因多态性的研究.中
国比较医学杂志 , 2003, 13（6）：325-328.
［10］ 杨永升 , 邓学梅 , 李宁 , 等 . MC1R是控制鸡黑色素形成的候选
主效基因 . 生物化学与生物物理进展 , 2004, 31（6）：500-505.
［11］ Robbins LS, Nadeau JH, Johnson KR, et al. Pigmentation
phenotypes of variant extension locus alleles result from point
mutations that alter MSH receptor function. Cell, 1993, 72（6）：
827-834.
［12］ Marklund L, Moller MJ, Sandberg K, Andersson L. A missense
mutation in the gene for melanocyte-stimulating hormone receptor
（MC1R） is associated with the chestnut coat color in horses. Mamm
Genome, 1996, 7（12）：895-899.
［13］ Joerg H, Fries HR, Meijerink E, Stranzinger GF. Red coat color
in Holstein cattle is associated with a deletion in the MSHR gene.
Mamm Genome, 1996, 7（4）：317-318.
［14］ Vage DI, Klungland H, Lu D, Cone RD. Molecular and pharmacolo-
gical characterization of dominant black coat color in sheep. Mamm
Genome, 1999, 10（1）：39-43.
［15］ 邓素华 , 黄路生 , 高军 , 等 . 黑素皮质素受体 1（MC1R）基因
与猪的毛色 . 遗传 , 2001, 23（1）：89-92.
［16］ Everts RE, Rothuizen J, van Oost BA. Identification of a premature
stop codon in the melanocyte-stimulating hormone receptor gene
（MC1R） in Labrador and Golden retrievers with yellowcoat colour.
Anim Genet, 2000, 31（3）：194-199.
（责任编辑 马鑫）