全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 3期·综述与专论·
收稿日期：2008-09-01
作者简介：汪华（1984-），男，硕士研究生，研究方向：生物化工；E-mail：fanye000@126.com
通讯作者：崔志峰（1956-），男，博士，副教授；Tel：0571-88320741，E-mail：zfcui@zjut.edu.cn
莽草酸（shikimic acid，SA），化学名为 3，4，5-三
羟基-1-环己烯-1-羧酸，其结构式，如图 1。 它是合
成许多生物碱、芳香氨基酸 、吲哚衍生物与手性药
物（如抗病毒药）的前体，其自身具有抗炎 、镇痛作
用，并可能通过影响花生四烯酸代谢 ，抑制血小板
聚集以及凝血系统而发挥抗血栓形成的作用 [1]。 此
外，莽草酸是合成目前在临床上惟一一种有效抗禽
流感药物-磷酸奥斯米韦（商品名为哒啡）的合成原
料 [2]。
获得莽草酸的方法有多种 ， 主要包括生物提
取、化学合成和生物合成。与动物细胞不同，植物和
微生物细胞普遍能合成莽草酸。木兰科植物八角茴
香的果实是工业上获得莽草酸的主要来源，其莽草
酸含量为 10％以上。由于八角茴香属于木兰科东方
小型树种结出的果实， 分布在全球极少数地区，产
量受气候等自然环境影响较大，严重限制了莽草酸
的产量。化学合成莽草酸有多种途径，但产率不高，
如 Diels-Alder 和逆 Diels-Alder 反应合成法的产率
都只有 15％左右，且工艺复杂。 生物合成法是利用
经过改造的微生物大规模发酵生产莽草酸的方法，
即以经过基因修饰得到的大肠杆菌为生产菌株，以
葡萄糖为原料大规模发酵合成莽草酸。大肠杆菌体
内莽草酸合成途径的关键酶与莽草酸产量的高低
关系密切，因此，对莽草酸合成过程中的关键酶及
其调控进行深入研究，有助于提高莽草酸的产量。
1 莽草酸生物合成途径
莽草酸途径是芳香族氨基酸合成过程中的一
段共同代谢途径（图 2）。 葡萄糖经糖酵解和磷酸戊
糖途径分别生成磷酸烯醇式丙酮酸 （PEP）和赤藓
糖-4-磷酸（E4P），两者在 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-
7-磷酸 （DAHP）合成酶的催化下进入莽草酸途径 ，
莽草酸生物合成途径的调控
汪华 崔志峰
（浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州 310032）
摘 要： 莽草酸是合成生物碱等许多其它物质的前体。近年来，莽草酸作为临床上惟一有效的抗禽流感药物——
达啡的原料而倍受关注。简述了莽草酸生物合成的途径，着重从基因工程角度分析了莽草酸合成过程中的关键酶及其对
莽草酸产量的影响，旨在为研究和开发微生物工程菌生产莽草酸提供参考。
关键词： 莽草酸 生物合成途径 遗传改造 工程菌
Regulation of Shikimic Acid Biosynthesis Pathway
Wang Hua Cui Zhifeng
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032）
Abstract： Shikimic acid as precursor for biosynthesis of alkaloid and other compounds，has been concerned recently
as the key material for the synthesis of tamiflus that is the only one effective clinic drug against avian influenza. In this
paper，functions of key enzymes in the biosynthesis pathway of shikimic acid were analyzed，and the breeding of
engineering bacterium by genetic improvements for high yield of shikimic acid was also discussed.
Key words： Shikimic acid Biosynthesis pathway Genetic improvement Genetically engineering bacterium
图 1 莽草酸结构式
2009年第 3期
经过一系列酶促反应合成莽草酸 ， 最终生成酪氨
酸、色氨酸、苯丙氨酸 3 种芳香族氨基酸。该途径中
有 3 个酶对莽草酸产量有重要影响：（1）3-脱氧-阿
拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶 ， 大肠杆菌中存在 3
种该酶的同工酶，且分别受终端产物 3 种氨基酸的
反馈抑制，限制了底物流入该途径合成莽草酸；（2）
脱氢圭尼酸合成酶， 该酶催化 3-脱氧-阿拉伯庚酮
糖酸-7-磷酸转化，当大量 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-
7-磷酸合成后，该酶不能及时将上游产物转化为 3-
脱氢圭尼酸而使其发生去磷酸化，降低了莽草酸的
产量 ；（3）莽草酸脱氢酶 ，该酶将 3-脱氢莽草酸还
原为莽草酸，同时受到莽草酸的反馈抑制。
2 莽草酸合成途径的分子生物学改造
在野生型菌株中，莽草酸是芳香族氨基酸合成
途径的中间代谢物，不会在细胞内累积 ，为了获得
大量的莽草酸 ， 必须切断或限制下游生化反应 。
Marco 等 [3]敲除 5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶
基因，使莽草酸-3-磷酸大量累积，后者去磷酸化后
就获得目标产物。敲除莽草酸激酶能阻断莽草酸磷
酸化反应，使莽草酸累积。 野生型菌株有两个莽草
酸激酶同工酶 ，包括激酶Ⅰ和激酶Ⅱ，分别由基因
aroK 和 aroL 编码， 激酶Ⅱ是转化过程中的主要催
化酶，而激酶Ⅰ的酶活力有限。 敲除 aroL 基因，保
留 aroK 基因， 使微生物细胞保留微弱的莽草酸激
酶活性以便累积莽草酸的同时还能自身合成芳香
族氨基酸和维生素等物质而无需额外添加 [4]。 此外，
利用 P1 噬菌体作介质，使 Tn10 和 CmR 基因分别插
入 aroL 的 478 位碱基对和 aroK 的 17 位碱基对，通
过完全缺失莽草酸激酶活力以切断下游生化反应，
使得合成的莽草酸无消耗而大量累积 [5]。
解除 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸 （DAHP）
合成酶的反馈抑制是增加莽草酸产量的另一关键
因素。 DAHP 的 3 个同工酶分别由 aroF、aroG、aroH
编码，其酶活力的比值大约为 25∶75∶<1。 用 3 种芳
香族氨基酸的类似物分别筛选到对特定氨基酸反
馈抑制不敏感的突变株。 研究表明，当突变株 DAHP
合成酶 aroF 基因的第 443 位碱基由 C 变成 T，酶的
148 号氨基酸残基由原来的 Pro 转变为 Leu 时 ，此
突变株对酪氨酸反馈抑制不敏感 [6]。 将该突变基因
导入菌株中，能够解除 DAHP 合成酶受酪氨酸反馈
抑制，引导更多的底物进入莽草酸合成途径。
Draths 等 [5]将对酪氨酸反馈抑制不敏感的 DAHP
合成酶基因（aroFFBR）导入莽草酸激酶活性完全缺失
的大肠杆菌细胞内，同时为了提高脱氢圭尼酸合成
酶 （基因 aroB 编码 ）活力及补偿莽草酸脱氢酶 （基
因 aroE 编码 ）活力 ，增加了 aroB 和 aroE 基因拷贝
数，构建了莽草酸生产菌株。结果表明，以葡萄糖为
原料，补料分批发酵培养 42 h，获得莽草酸 27.2 g/
L；圭尼酸 12.6 g/L；脱氢莽草酸 4.4 g/L，莽草酸有
明显的累积。
3 莽草酸合成过程中底物利用率的提高
上述工程菌的应用使莽草酸合成途径得到了
改良， 由于底物赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇式丙酮
酸能够有效的转变为产物，莽草酸产量得到了大幅
提升。 因此，进一步提高底物的流入量有可能促进
莽草酸产量达到进一步提高。
3.1 过量表达 tktA基因增加赤藓糖-4-磷酸的合成
基因 tktA 编码的转酮酶对赤藓糖-4-磷酸合成
量有重要影响。 李永辉等 [7]从大肠杆菌 K-12 株中
图 2 莽草酸生物合成途径
① 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶 （3-deoxy-d-arabino-
heptulosonate-7-phosphate synthase）； ②脱氢奎尼酸合成酶 （3-de-
hydroquinic acid synthase）；③脱氢奎尼酸脱水酶 （3-dehydroquinic
acid dehydratase）；④莽草酸脱氢酶 （shikimate dehydrogenase）；⑤
莽草酸激酶 (shikimate kinase)；⑥5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合
成酶 （5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase）；⑦脱氢圭尼酸
脱氢酶（dehydroquinate dehydrogenase）；⑧脱氢莽草酸脱水酶 （de-
hdroshikimate dehydratase）
汪华等：莽草酸生物合成途径的调控 51
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2009年第 3期
扩增了基因 tktA，该基因在工程菌中的高效表达使
转铜酶的活性提高了 3.9 倍 ，DAHP 的合成量提高
明显。 David 等 [8]通过增加 tktA 的拷贝数提高了转
酮酶的活力，使得赤藓糖-4-磷酸合成量增加，最终
进入莽草酸代谢途径的碳量增加为原来的两倍，莽
草酸合成途径的总产率由 20%上升到 29%， 副产
物圭尼酸和 3-脱氢莽草酸的产量分别由 8.1 g/L 提
高到 19 g/L 和 6.5 g/L 提高到 11 g/L， 但莽草酸的
产量仅由 26 g/L 上升为 28 g/L。 可以看出，tktA 基
因的过量表达增加了底物合成量，但副产物的过多
合成消耗了底物，使得莽草酸的合成量没有明显提
升。
3.2 提高磷酸烯醇式丙酮酸的利用率
磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）是一种高能化合物，
在葡萄糖转运 （PTS 系统 ）过程中提供能量而转变
成丙酮酸被消耗。 基因 ppsA 是 PEP 合成的关键酶
基因，利用 IPTG 诱导表达调控系统，调控表达基因
ppsA， 可以提高 PEP 的合成量。 通过破坏 aroE 基
因， 切断了 3-脱氢莽草酸转化为莽草酸的反应，使
3-脱氢莽草酸累积，其产量可以作为考察指标。 在
增加基因 tktA 拷贝数的同时，当 IPTG 的浓度为 12
mg/L、PEP 合成酶活力增加为原来的 7 倍时 ，3-脱
氢莽草酸产量上升到 69 g/L， 途径总产率为 51％
（mol / mol），比未增加拷贝前产量增加 17g/L，但副
产物 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸，3-脱氢圭尼酸，没食
子酸等也有合成； 当 IPTG 浓度为 48 mg/L、PEP 合
成酶活力增加为原来的 15 倍时 ，3-脱氢莽草酸产
量为 58 g/L， 产率为 29%（mol DHS / mol glucose）。
出现这种现象的原因可能是 PEP 合成酶的表达量
到达了细胞生化反应产能能力的临界状态所以降
低了丙酮酸的可利用率 [9]。
PTS 系统每转运一分子葡萄糖要消耗一分子
磷酸烯醇式丙酮酸，采用葡萄糖协助蛋白和葡萄糖
激酶组成的转运系统，以及半乳糖转运蛋白等非磷
酸烯醇式丙酮酸供能的葡萄糖转运系统代替 PTS
转运系统，能够节约磷酸烯醇式丙酮酸用于莽草酸
合成 [10]。 在增加基因 tktA 拷贝数同时，运动发酵单
胞菌 （Zymomonas mobills）葡萄糖协助蛋白基因 glf
和葡萄糖激酶基因 glk 被导入 PTS 系统缺失的大
肠杆菌。 发酵培养 48 h 后，3-脱氢莽草酸产量达到
60 g/L， 途径产物的总产率为 41％（mol / mol）；而
PTS 转运系统下， 相应的产量和产率分别为 49 g/L
和 33%（mol / mol）。 以半乳糖转运蛋白作为葡萄糖
转运载体时， 在发酵培养 60 h 后，3-脱氢莽草酸产
量为 60 g/L， 途径产物总产率为 43%（mol / mol）。
可以看出，利用非磷酸烯醇式丙酮酸供能的葡萄糖
转运系统， 节约了大量的 PEP 用于莽草酸合成，目
标产物和途径总产率都有明显提高，副产物合成较
少，是比较理想的增产方式 [10]。
4 降低副产物形成的措施
经过对莽草酸合成途径的一系列调控后，莽草
酸的产量有了明显的提升，但同时圭尼酸等副产物
的合成量也随之增加。副产物在发酵液中的累积对
后续莽草酸的分离提纯有较大影响，如圭尼酸会影
响莽草酸的结晶纯化。关于副产物的形成机制有不
同的观点，其一认为：当莽草酸积累到一定浓度时，
分泌到细胞外的莽草酸重新转运入胞质内，逆莽草
酸合成方向生成圭尼酸 [5，8]。 当培养基中的葡萄糖
浓度过低时，莽草酸转运系统的效率降低 ，莽草酸
不能及时转运到胞外，使其在胞内累积，促使反应
平衡逆方向进行，生成各种副产物 [4]。 目前，基于第
一种观点的降低副产物措施研究得较多。
4.1 利用代谢物抑制效应抑制圭尼酸合成
当培养基中葡萄糖被消耗殆尽时，莽草酸被视
为碳源而被转运回胞内利用 。 借助代谢物抑制效
应，提高培养基中葡萄糖的浓度可以抑制莽草酸的
重新被利用。 当提高培养基中葡萄糖浓度、发酵培
养 42 h 后， 圭尼酸合成量由原先的 12.6 g/L 下降
到 1.9 g/L，莽草酸与圭尼酸的摩尔比由原来的 2.4∶1
提高到 11.8∶1[5]。但是，高浓度葡萄糖培养条件下容
易产生副产物乙酸， 使得微生物的生长受影响，从
而降低产量。 葡萄糖类似物甲基-α-D-葡萄糖苷在
培养基中稳定，可以被转运至胞内且磷酸化 ，却不
参与其他代谢，因此可以用于抑制副产物的合成 [8]。
4.2 利用 shiA 基因的缺失阻止莽草酸进入胞内
基因 shiA 编码的蛋白是莽草酸转运蛋白 。
Knop 等 [8]构建了基因 shiA 缺失菌株 E.coli SP1.1s-
hiA/pKD12.138，该工程菌导入了基因 aroFFBR，增加
了基因 aroB、aroE、tktA 拷贝数 、 缺失了 aroL、aroK
基因。 发酵培养 48 h 后 ，合成莽草酸 23 g/L，圭尼
52
2009年第 3期
酸 22 g/L，3-脱氢莽草酸 9.6 g/L； 未缺失基因 shiA
前，莽草酸的合成量为 28 g/L，圭尼酸 19 g/L，3-脱
氢莽草酸 11 g/L。 可见，缺失基因 shiA 对降低圭尼
酸的合成效果不明显。 为了研究缺失基因 shiA 后
莽草酸是否发生逆向转运，构建了 DAHP 合成酶活
力及基因 shiA 缺失的菌株 E.coli SP1.1 shiA/pSC-
5.214A。接种 12 h 后，向培养基中添加莽草酸，40 h
培养后检测到圭尼酸 ，但合成速率下降明显 [8]。 说
明缺失 shiA 基因后，莽草酸仍然被转运入细胞内，
由此推测除了基因 shiA 编码的莽草酸转运蛋白
外，可能存在其他莽草酸转运机制。
4.3 AroD.E 酶替代 AroD 酶和 AroE 酶， 抑制 3-
脱氢莽草酸产生
副产物圭尼酸合成被抑制后，3-脱氢莽草酸成
为莽草酸的反馈抑制的主要副产物 ， 在烟草植株
中，3-脱氢圭尼酸脱水酶和莽草酸脱氢酶的活性集
合到一种酶中，该酶由 aroD.E 基因编码，催化 3-脱
氢圭尼酸直接转化为莽草酸，避免了中间物 3-脱氢
莽草酸。 将该基因转入了 aroD 和 aroE 缺陷的大肠
杆菌中， 但是 3-脱氢莽草酸的合成没有被抑制，圭
尼酸的合成却被抑制 [8]。 最近，有学者对拟南芥中
同样的双功能酶进行了研究，这将为莽草酸途径的
改造提供新材料 [12]。
5 展望
通过改造莽草酸合成途径或增加底物的流入
量，莽草酸的产量有了大幅提高，但是副产物产量
也随之增加。 研究表明，副产物的形成与莽草酸的
转运机制有密切联系，且转运机制复杂，但还有待
进一步的深入研究。莽草酸脱氢酶在副产物形成中
有重要作用。 第一，受莽草酸的反馈抑制使 3-脱氢
莽草酸滞留；第二，由于 3-脱氢圭尼酸与莽草酸结
构相似，莽草酸脱氢酶能将其还原为圭尼酸 [5]。 现
已发现大肠杆菌中莽草酸脱氢酶有两类 ， 包括
AroE 和 YdiB。 YdiB 是一种双供能酶，能够催化 3-
脱氢圭尼酸转化为圭尼酸，形成副产物；YdiB 的序
列及关键氨基酸 [15]都已阐明，并进行了定点突变的
研究 [16]。 这些研究对降低副产物合成，提升产量将
有重要意义。
最近，Ran 等 [13]利用 2-酮-3 脱氧-6-磷酸半乳糖
酸（KDPGal）醛缩酶催化丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸合
成 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸 。 通过易错
PCR、基因 “洗牌 ”、多位点定向进化等技术对大肠
杆菌中编码该酶的基因进行改造，最终使得该酶活
大幅度提升。在缺失 3 种 DAHP 合成酶酶活的菌株
中，只依靠改造后的醛缩酶的催化活力，使得 3-脱
氢莽草酸的产量从 2 g/L 提高到 13 g/L[14]。 这一合
成 3-脱氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸的辅助途径也
值得进一步研究。
莽草酸以其自身重要的药用价值以及作为合
成其他药物的良好前体物质 ， 具有广阔的市场前
景，并由此带来可观的经济收益。目前，抗禽流感药
物达啡产量不足主要原因之一是合成原料-莽草酸
产量不足。 以葡萄糖为原料，利用大肠杆菌工程菌
生产莽草酸具有周期短、成本低、污染少、对环境友
好、受地域环境影响小及产量稳定等优点，必将成
为莽草酸生产的主流。通过对大肠杆菌工程菌莽草
酸合成过程中关键酶的基因本质及其调控的深入
研究，有望进一步提高莽草酸的产量。
参考文献
1 尤永真，等.中华中医药学刊，2007，25（2）：386~387.
2 Osao A，Somboon T，Nozomi Y，et al. Biosci Biotechnol Biochem，
2003，67（10）：2124~2131.
3 Marco K，et al. Metab Eng，2003，5：277~283.
4 Johansson L，et al. Biotechnol Bioeng，2005，92（5）：541~552.
5 Draths KM，et al. J Am Chem Soc，1999，121（7）：1603~1604.
6 Weaver LM，et al. J Bacteriol，1990，172（11）：6581~6584.
7 李永辉，等.生物工程学报，2003，19（3）：301~305.
8 Knop DR，Draths KM，Sunil SC，et al. J Am Chem Soc，2001，123
（42）：10173~10182.
9 Yi J，Li K，Draths KM. Biotechnol Prog，2002，18（6）：1141~1148.
10 Yi J，et al. Biotechnol Prog，2003，19（5）：1450~1459.
11 Chandran SS，et al. Biotechnol Prog，2003，（19）：808~814.
12 Singh SA，Christendat D. Biochemistry，2006，45（25）：7787~7796.
13 Ran NQ，et al. J Am Chem Soc，2004，126（22）：6856~6857.
14 Ran NQ，Frost JW. J Am Chem Soc，2007，129（19）：6130~6139.
15 Michel G，et al. J Biol Chem，2003，278（21）：19463~19472.
16 Holger A，et al. J Biol Chem，2005，208（8）：7162~7169.
汪华等：莽草酸生物合成途径的调控 53