全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
收稿日期:2007-07-10
基金项目:国家自然科学基金项目(30471009)
作者简介:邹智(1982-),男,湖南娄底人,硕士,研究方向:植物基因工程
通讯作者:卢长明,Tel:027-86728186;E-mail:cmlu@oilcrops.cn
影响农杆菌介导遗传转化的植物因子研究进展
邹智 卢长明
(中国农业科学院油料作物研究所,农业部油料作物遗传改良重点开放实验室,武汉 430062)
摘 要: 农杆菌介导法是植物遗传转化中最常用的一种方法。越来越多的研究表明,植物遗传因子是决定农杆菌
遗传转化效率的重要因素,它们至少影响了转化过程的如下5个方面:1)受伤植物释放的酚类物质和糖分子等介导农杆
菌的趋化运动和毒性基因vir的诱导表达;2)农杆菌吸附到植物表面;3)T-DNA和毒性蛋白通过由VirB和VirD4蛋白组
成的IV型分泌系统从细菌转移到植物细胞质;4)T-复合体利用细胞质ACTIN骨架和输入蛋白进行核定位和核输入;5)
T-DNA利用植物的修复装置整合进宿主基因组。就以上5个方面涉及的植物因子研究进展予以综述。
关键词: 农杆菌 遗传转化 转化效率 遗传因素 植物因子
AnOverviewofPlantFactorsInfluencingAgrobacterium-
mediatedTransformation
ZouZhiLuChangming
(OilCropsResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences/Key
LaboratoryofOilCropsGeneticImprovement,MinistryofAgriculture,Wuhan430062)
Abstract: Agrobacterium-mediatedtransformationisthemethedmostcommonlyusedforgeneticmodificationof
plants,whichinvolvesacomplexinteractionbetweenthebacterium andthehostplant.Thiscomplexprocescanbe
separatedintofivesteps:(a)chemotaxisandinductionofbacterialvir(virulence)genesbyphenolicandsugarmolecules
releasedfrom woundedplants,(b)atachmentofthebacteriatotheplantsurface,(c)transferofT-DNAandvirulence
proteinsfromthebacteriumtotheplantcelviaaTypeIVsecretionsystem composedofVirBandVirD4proteins,(d)
cytoplasmictrafickingandnucleartargetingofT-DNA andvirulenceproteins,mostlikelyinvolvingtheplantactin
cytoskeletonandimportins,and(e)integrationofT-DNAintotheplantgenomebythehostrepairmechanism.Thispaper
givesanoverviewontheefectofplantfactorsontransformationeficiencyviaAgrobacterium.
Keywords: Agrobacterium Genetictransformation Transformationeficiency GeneticfactorsPlantfactors
·综述与专论·
农杆菌介导法是植物遗传转化中最常用的一
种方法。农杆菌介导的遗传转化是农杆菌、植物受
体及环境条件共同作用的结果。影响农杆菌遗传转
化效率的因素很多,大体可归为遗传和环境因素两
大类,其中遗传因素又可以分为由农杆菌方面决定
的所谓细菌因子以及由植物方面决定的所谓植物
因子。在过去的数十年里,人们对参与农杆菌遗传
转化的细菌因子研究的比较深入,而对植物因子的
研究则相对比较滞后[1～4]。研究表明,植物不同的物
种、同一物种的不同品种或生态型、甚至同一植物
的不同外植体在农杆菌的转化效率方面往往存在
显著性的差异[5,6],这些差异的产生与大量参与转
化过程的植物因子有关[7～9]。随着转化体系的优化,
农杆菌的宿主范围在日益扩大,其转化的物种从双
子叶植物延伸到单子叶植物,从被子植物延伸到裸
子植物,从细菌延伸到真菌,从酵母延伸到哺乳动
物[10]。但对于不同物种的植物来说,农杆菌介导的
转化效率差异很大。有的物种(如烟草)转化效率可
高达 90%,而大多数物种(特别是一些主要农作物
品种)的转化效率还普遍很低。对影响植物转化效
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
率的遗传因子开展深入研究对于了解转化的分子
机理、扩大农杆菌的宿主范围,对于提高植物的转
化效率都具有重要理论和实际意义。
近年来,人们利用酵母双杂交系统、突变体筛选、
反向遗传学鉴定以及基因组学研究等方法对影响转
化效率的植物因子进行研究,取得了显著进展[2]。研究
显示,植物因子至少影响了转化过程的以下 5个方
面:农杆菌毒性基因 vir的诱导表达、农杆菌向植物
细胞表面的附着、农杆菌 T-DNA跨膜由细菌向植物
细胞质的转移、T-复合体被转运进植物细胞的细胞
核以及 T-DNA稳定整合到宿主基因组等过程[1,9,11]。
现就以上 5个方面的研究进展予以综述。
1 植物信号分子在农杆菌趋化运动和毒性
基因 vir诱导表达中的作用
研究表明,农杆菌在距宿主很远的地方就能感
应宿主的存在,其中起介导作用的是一些分子量很
小的物质如酚类、糖类等(表 1),称为信号分子,它
们在植物受伤后大量释放[12]。这些小分子物质一方
表 1 在农杆菌趋化运动与 vir基因诱导表达中起作
面可作为化学源吸引农杆菌的趋化运动,另一方面
可诱导或抑制农杆菌 vir基因的表达。
目前已发现的酚类化合物种类很多,对于同一
菌株而言,不同的酚类物质的作用效果不同,其中
乙酰丁香酮(AS)和羟基乙酰丁香酮(OH-AS)较强,
在低浓度时仍可吸引农杆菌;儿茶酚、原儿茶酚、没
食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草醛和对
羟基酚等七种化合物单独作用时效果较弱;相同酚
类物质对不同菌株的诱导效果也不尽相同,如 4-羟
基苯乙酮、苯酚可激活 KU12菌株的毒性基因,但
它们对 A6菌株的诱导作用极其微弱。糖类物质包
括单糖如葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖
及含葡萄糖残基的二糖如纤维二糖等,在 AS或浓
度很低的情况下,它们可强烈诱导 vir基因的表达,
并且它们与 AS存在协同效应,可显著提高 AS诱
导效果。植物信号分子由农杆菌的 VirA/VirG“双组
分”(two-component)信号传导系统进行识别。作为
膜结合蛋白 VirA可直接感应酚类化合物(如 AS由
农杆菌染色体基因编码的 P10、P21蛋白介导)也可
以通过 ChvE间接感应糖类物质而发生自身磷酸
化,然后把不稳定的磷酸基团转移给 VirG蛋白,作
为转录因子的 VirG活化后可依次激活其它的 vir
基因,进而驱动农杆菌侵染受伤的植物组织。ChvE
蛋白对糖类表现出趋化性,糖类诱导的 ChvE大量
表达可引起 vir基因高水平的表达,并可扩大农杆
菌的寄主范围。ChvE通过结合一些单糖与 VirA蛋
白的跨膜区作用进而促进 vir基因的表达,另外
ChvE也可直接与 VirA蛋白的周质区作用,大大加
强 AS对 VirA的诱导。
当然,并非所有的植物分泌物都诱导 vir基因
的表达。酚类物质等在浓度高时会对农杆菌产生毒
害作用,另外某些植物的分泌物中还存在一些抑制
vir表达的物质,如玉米分泌的 DIMBOA(2,4-dihydr
oxy-7-methoxy-1,4-benzoxazin-3-one),它可抑制农杆
菌的生长和 vir基因的表达。
农杆菌的趋化运动是由染色体毒性基因(chro-
mosomalvirulencegenes如 atR,chvA,chvB,pscA和
cel等)所编码的蛋白质所介导,在鞭毛的引导下农
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杆菌以极性方式向植物的受伤部位运动,然后通过
细胞表面的乙酰化酸性荚膜多糖(atR编码)附着
到植物细胞壁上(即接触)[13],这种吸附作用不稳定,
很容易被水洗掉,在农杆菌附着蛋白的辅助下,附
上的农杆菌产生大量纤维素小纤丝和一些糖类化
合物将自身束缚(或“固定”)在植物细胞壁表面并
包裹成一个囊状结构,即所谓的成囊。
2 植物因子在农杆菌向植物细胞附着中的
作用
与宿主植物细胞上受体蛋白的结合是病原物
完成附着过程及进一步侵染的基础[3]。早在 1969年
Lippincot和 Lippincot就指出农杆菌向植物细胞的
附着是肿瘤发生的前提。在自然条件下,一般认为
野生型农杆菌对植物的附着能力与肿瘤诱导能力
成正比,所有不能附着的农杆菌突变体都是无毒
的。在农杆菌染色体上已鉴定出至少如下五个基因
座,它们是 chvA、chvB、pscA(exoC)、atR和 cel参与
附着过程,但它们的植物受体还不清楚。早前有人
发现共培前用不同的蛋白酶处理植物可阻止细菌
的附着,这表明植物细胞表面上含有附着有关的受
体,并且很可能就是蛋白质。经过多年的努力,人们
对影响农杆菌向植物细胞附着的植物因子有了较
深入的认识(表 2)。
Nam等发现拟南芥的某些生态型(Bl-1和 Pe-
表 2 在农杆菌向植物细胞附着中起作用的植物因子
tergof)和一些 T-DNA插入突变体不能为农杆菌所
附着,这就进一步证实植物因子参与了农杆菌的附
着过程[5,7]。经分析发现突变体 rat1、rat3(resistantto
Agrobacteriumtransformation)分别影响的是一个阿
拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactanprotein,AGP)和
一个潜在的细胞壁蛋白(一种类似于分泌到胞外的
小蛋白)[14]。有意思的是,虽然 rat1、rat3与生态型
Bl-1、Petergof的根切段不能为农杆菌所附着,但真
空渗入法表明它们的雌配子保持了正常的转化能
力[8],原因可能是植物不同组织中参与附着的表面
受体不同。另一突变体 rat4,虽然它的根具有野生
型几乎一样的结合能力,但附着能力明显下降[15],
不能被转化,该基因编码一种类纤维素合酶蛋白
CSLA9(acelulosesynthase-likeprotein),影响细胞
壁的结构如木聚糖合酶(xylansynthase)和 β-伸展
蛋白,因此它可能参与附着过程中的成囊作用及
T-DNA向宿主细胞质的转移[2]。融合GUS表达表明,
CSLA9主要表达于根的伸长区[15],即农杆菌的敏感
区[16],因此农杆菌可能倾向于感染特定发育时期的
宿主细胞或组织,而这与 S-期为矮牵牛同步细胞稳
定整合所必须的报道相吻合[17]。
另外两个潜在的受体蛋白是类玻连蛋白(vitron
ectin-likeprotein)[18]和根钙黏附蛋白 (rhicadhesin-
bindingprotein)[19]。类玻连蛋白属玻连蛋白家族,动
物细胞中,玻连蛋白存在于胞外基质,是许多病原
细菌结合的特异受体;因而在植物中,它极有可能
参与农杆菌的附着。事实也是如此,农杆菌向植物
组织的附着被人玻连蛋白或抗玻连蛋白的抗体所
邹智等:影响农杆菌介导遗传转化的植物因子研究进展 3
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抑制,且相应的农杆菌突变体不能附着植物细胞
[4],如 chvB、pscA和 at的突变菌株与玻连蛋白的结
合能力降低[20]。根钙黏附蛋白(RBP)是 Swart等从
豌豆根细胞壁中纯化的一个与黏附蛋白(rhicad-
hesin或 adhesionprotein)特异结合的蛋白[19],而黏
附蛋白是农杆菌和本科相关的根瘤菌(phytobac-
teriumRhizobium)所编码的一种结合蛋白,与许多
其它细胞附着蛋白(包括玻连蛋白)一样,根钙黏附
蛋白含有保守的 arginine-glycine-asparticacid细胞
附着结构 [19],虽然它在附着中的确切作用还不清
楚,但这种结合可促进农杆菌与宿主细胞的附着作
用。此外,Dit等用 cDNA-AFLP技术筛选到 2个为
农杆菌特异诱导表达的基因,其中一个编码类结瘤
素蛋白(nodulin-likeprotein),属于根瘤菌侵染后诱
导植物根瘤形成的一类蛋白,影响细胞的分裂与分
化,可能参与农杆菌与宿主细胞的识别及转运复合
体的激活;另一个编码类凝集素蛋白激酶(lectin-
likeproteinkinase),负责对寡糖信号作出反应,可
能参与农杆菌与宿主细胞的识别。
一般认为附着发生在受伤植物的细胞壁表面,
但 Firoozabady和 Galbraith的报道则认为侵染不需
要细胞壁,不过有人怀疑在他们的研究中细胞表面
可能还存在细胞壁碎片[9];Yusibov等[21]发现当农杆
菌与烟草接触时,细菌中的 T-DNA迅速消失,而在
植物中用 PCR可检测到 T-DNA。Escudero等[22]发现
AS诱导后的农杆菌(即使是附着缺陷的)微注射进
植物细胞后也能把 T-DNA转移进细胞核中,其中
VirB对于转化是必需的,他们推测 VirB可能锚定
在核膜上并被激活,如果真是那样的话,细胞膜可
能就能充当 VirB锚定和激活物,换句话说从理论
上原生质就能被农杆菌共培转化。
不同植物对同一病原物的吸附受体数目是不
一样的,这就能解释不同植物对同一病原物的敏感
性不同;同时某一特定植物对不同病原物吸附受体
及数目也是不一样的,例如根癌农杆菌与发根农杆
菌的受体蛋白就不一样,根癌农杆菌的吸附不影响
发根农杆菌的吸附;受体数目是有限的,不致瘤的
或受热死亡的致瘤农杆菌能抑制致瘤菌的吸附,这
主要是不致瘤的细菌占据了有限的结合位点。事实
上也是如此,每个悬浮培养的番茄或胡萝卜细胞约
附着 200个细菌就达到饱和,而每个番茄细胞只能
吸附不到 3个大肠杆菌。每个植物细胞可以同时附
着多种不同的农杆菌菌株,但只能被 1个或少数几
个菌株所转化。有研究表明只有在创伤部位生存了
8～16h之后的菌株才能诱发肿瘤,这段时间称为细
胞调节期,而成囊过程就发生在调节期后。
3 农杆菌 T-DNA向植物细胞跨膜转移所需
的植物因子
vir基因的表达导致 T-DNA的产生以及细菌与
宿主细胞间通道的形成,并最终将 T-DNA和一些
Vir蛋白如 VirE2(在 VirE1的协助下)、VirE3、VirD5
与 VirF等分泌到植物细胞中。T-DNA的产生和分
泌通道的形成并不受宿主细胞因子的直接影响[23]。
其中通道称为 IV型分泌系统[24],由 VirD4和 VirB
(VirB1-VirB11)[25]组成,包括线状的 T-纤毛(或毒性
纤毛)和一个转运复合体两个功能单位。几乎所有
的 virB(VirB1-VirB11,VirB1突变会严重削弱致病
能力)及 virD4突变体都是无毒的,深入研究表明
virB突变体影响的不是 T-DNA的加工而是阻断其
转移,VirD4和 VirB可能在 T链形成后的转移过程
起作用。T-纤毛和转运复合体的组装对于 T-复合体
的转运来说或许并不充分,因为有研究表明在缺少
受体植物细胞的情况下,T-链在 vir基因被激活的
农杆菌细胞中积累,但这一转运通道或许只有在与
宿主细胞表面受体相互作用后才会开放[26,27],也就
是说与受体植物细胞直接的物理接触也许对于转
运复合体的激活是必需的。事实上,VirB1的一剪接
体 VirB1*被分泌到农杆菌的细胞外,可能负责建
立农杆菌和宿主细胞之间的联系[25]。VirB2、VirB5和
VirB7是农杆菌 T-纤毛的组成成分[28],虽然 T-纤毛
表 3 在农杆菌 T-DNA向植物细胞跨膜转移中起作用的植物因子
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的准确功能还存在争议,但它可能直接与宿主细胞
壁和/或膜相互作用。Gelvin实验室用酵母双杂交
法筛选和鉴定了两类(表 3)与加工 VirB2特异作用
的拟南芥蛋白[29],虽然它们并不与参与农杆菌介导
遗传转 化的 VirB1、VirB1*、VirB5、VirD2、VirE2和
VirF作用,但它们都与自身和相互间进行作用[2]。
其中一类是由 3个成员组成的基因家族编码,即
VirB2互作蛋白 (VirB2interactors,BTIs)BTI1、BTI2
和 BTI3,它们都含有跨膜结构域,但其具体功能还
不清楚;另一类是膜相关蛋白 Rab-typeGTPase,A-
tRAB8[29]。表达 BTI1和 AtRAB8的反义或 RNAi构
件的转基因植物对农杆菌的敏感性降低,并且农杆
菌侵染后 BTI的表达瞬间提高[29]。
4 T-复合体核输入所需的植物因子
T-DNA一旦进入宿主细胞质就被 VirE2包装
成成熟的 T-复合体[30,31],而这一复合体必须进入细
胞核才可能进行瞬间及稳定表达[16,23]。那么 T-DNA
在细胞质中是如何运动?又是如何进入细胞核的
呢?表 4列出了相关研究的主要结果。
4.1 协助 T-复合体穿过植物细胞质中的植物因
子——植物动力蛋白
我们知道 T-DNA是以成熟 T-复合体的形式进
行运输[1,31],这个复合体很大,它包含一分子的 T-
DNA和一分子 VirD2以及成千上万的 VirE2,如
野生型胭脂碱菌株 22kb的 T-链约 3.6μm[32],外径
12.6~15.7nm[32,33],这就严重阻碍了其在由微管、肌
动蛋白、中间纤维等组成的稠密网状细胞质中的自
由扩散和进入到细胞核[33]。因此,T-复合体可能与
许多 DNA病毒一样利用宿主细胞的转运系统进行
胞质运动和入核[34,35]。
最近,Gelvin等实验室的研究结果表明细胞骨
架蛋白(并且是肌动蛋白而非微管蛋白)参与 T-复
合体的核定向运动,在他们的瞬间和稳定整合实验
中拟南芥肌动蛋白(actin,如 actin-2和 actin-7)和
肌球蛋白(myosin)的 T-DNA插入突变体表现为 rat
表型,而微管蛋白(tubulin)突变体则不同,肌动蛋
白和微管蛋白特异性药物的抑制实验进一步验证
了上述结果。Salman等在人工合成的非细胞系统中
用 生 物 物 理 颗 粒 追 踪 技 术 (biophysicalparticle
trackingmethods)追踪荧光标记的 VirE2-ssDNA复
合体也表明 T-复合体利用动力蛋白沿着微管网络
进行核定向运动[36],而这与微管以负端面向于细胞
核的现象是一致的[34,36]。但这是基于动物细胞实验
所得出的结论,在植物中这样的动力蛋白还不清
楚。一个与动力蛋白类似的拟南芥蛋白 DLC3
(dynein-likeArabidopsisprotein)可能与另一个介导
VirE2核输入的植物因子 VIP1作用,即它通过连接
VIP1-VirE2-T-DNA复合体和微管系统而参与 T-复
合体的胞内运输[34],但 DLC3作为一个潜在的新植
物动力蛋白家族还有待进一步的研究。
表 4 调控农杆菌 T-复合体进入植物细胞核的植物因子
4.2 协助 T-复合体进入植物细胞核的植物因
子——亲环素、PP2C、AtKAPα、VIP1
虽然 T-复合体的直径远超过了核孔允许的自
由扩散上限 9nm,但并没有超过核孔主动运输所允
许的范围 23~39nm。研究表明 T-复合体是由 VirD2
和VirE2介导进入细胞核的,这种核输入可被VirD2
与 VirE2专一性抑制剂所阻断[37]。VirD2和 VirE2都
含有核定位信号序列,其突变会导致核定位能力降
低或丧失,但二者的入核方式不同,VirD2在不同的
物种中都是保守的,VirE2则可能是植物特异性的,
这种差异可能和与它们作用的宿主因子有关,而研
究也证明了这一猜测[38～41]。
酵母双杂交显示植物的亲环素(cyclophilins)
Roc1、Roc2、Roc3、Roc4和 Roc5/CypA都参与了农
杆菌 VirD2蛋白的活动[39,41]。亲环素属于一含保守
的保守的肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl
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cis-transisomerases,PPIases)的分子伴侣家族。拟南
芥亲环素编码一谷胱甘肽 S-转移酶 (glutathioneS-
transferasefusion),体外实验表明它作用于 VirD2蛋
白的中央区域 [39],亲环素抑制剂 CyclosporinA可抑
制拟南芥根段和烟草悬浮细胞的转化。虽然抑制
VirD2-CypA间的相互作用会破坏农杆菌的致瘤性,
但是它们在农杆菌侵染过程中的确切功能还不清
楚。它们可能以分子伴侣的形式在复合体向细胞核
的转运以及向植物基因组的整合过程中维持
VirD2在宿主细胞质/核中的正确构象[39]。
在马铃薯中,一个 2C型的丝氨酸/苏氨酸蛋白
磷酸酶(type2Cserine/threonineproteinphosphatase,
PP2C)也参与VirD2的作用[2,9]。PP2C可能参与VirD2-
C端 NLS附近丝氨酸的磷酸化与去磷酸化。PP2C
和 VirD2-NLS与 GUS的融合基因在烟草 BY-2细
胞原生质体中的共表达导致 GUS在细胞核中的积
累急剧下降,表明去磷酸化对 VirD-NLS活性有负
效应[42],而拟南芥的 PP2C突变体(abi1)对农杆菌
的敏感性明显提高[9]。
在拟南芥中,拟南芥亲核素 importin-α(AtKAP)
家族成员 AtKAPα参与了 VirD2的作用[38,41],这一
家族至少含有 9个成员,它们可介导含 NLS的蛋
白向细胞核中的运输。importin-α7的 T-DNA插入
突变[43]和 importin-α1的反义抑制导致转化效率显
著降低[2],另外 α-与 β-importins的插入突变体阻断
于核输入[2]。因此 VirD2AtKAPα可能是 VirD2进入
细胞核的植物因子。。
另外酵母双杂交显示 AtKAPα并不与 VirE2蛋
白作用[38],而另外两个拟南芥蛋白——VIP1(VirE2-
interactingprotein1)和 VIP2(将下面讨论)特异地与
VirE2作用 [1,40]。其中 VIP1本身含有核定位信号,
在酵母和哺乳动物细胞中都能高效的核定位,并且
可介导 virE2在植物细胞、体外和永生的人类细胞
和(permeabilizedhumancels)的入核[40]。它通过 N
端的高碱性氨基酸区与 AtKAPα作用以 AtKAPα核
输入途径转运进酵母细胞核[44]。VIP1含有保守的亮
氨酸锌指结构域(由长的碱性氨基酸域及随后的亮
氨酸锌指组成的 bZIPmotif,七个亮氨酸重复甚至
被其他的六个氨基酸残基所隔开),但与已知的动物
或酵母含有 bZIP序列蛋白质没有明显的同源性[40],
它可能是一种与植物特异的 VirE2核输入有关的
植物因子。它在植物中表达量很低,属非丰富蛋白,
表达反义 VIP1cDNA的拟南芥和烟草都不能被农
杆菌所转化;而 VIP1的过量表达则可提高植物对
农杆菌的亲和性,并且最大瞬间表达量提前[44]。
VIP1的具体功能还不清楚,VIP1可在细胞质中特
异地识别与结合 VirE2,作为 VirE2和 AtKAPα间
的适配子,以背负方式将它转运到细胞核中[40,44]。
最后,在其它核输入系统中起作用的一种小
GTP酶 Ran[45]也可能参与了 T-链复合体向细胞核
的转运,因为非水溶性的 GTP类似物会通过抑制
Ran阻碍细胞核的转运,也阻碍 VirE2和 VirD2向
细胞核的运输[46]。
5 参与农杆菌 T-DNA整合到植物基因组所
需的植物因子
T-DNA整合进植物宿主基因组是转化中最后
也是最为关键的一步,最终导致冠瘿瘤的产生或目
的基因的表达,在整个转化过程中,它被认为是最
依赖于宿主细胞的步骤[47]。
T-复合体进入细胞核后,必须准确地定位到整
合位点并卸掉伴侣蛋白才能整合进宿主基因组中,
这个过程中的 T-复合体的染色质定位、包裹蛋白
的酶解、染色质的重塑、T-DNA互补链的合成、DNA
的修复等都需要宿主因子的参与(表 5)。
研究表明成熟 T-复合体是在许多宿主伴侣蛋
白的协助下通过 AtKAPα核输入途径[23,48]进入细胞
核的,这些伴侣蛋白包括 CAK2M(plantorthologof
cyclin-dependentkinase-activatingkinases)和 TATA
盒结合蛋白(TBP)、VIP1、VIP2等。CAK2M和 TBP
都与 VirD2蛋白结合[41],其中 CAK2M与 RNA聚合
酶 I的大亚基作用,而 RNA聚合酶 I不仅可募集
TBPs参与转录,还可调控转录相关的 DNA修复。
CAK2M和 TBP与 VirD2作用可能引导 T-复合体向
染色质的运动。
除辅助 VirE2蛋白和 T-复合体进入植物细胞
核外,转录因子 VIP1也参与了 T-DNA的整合过
程[40,48,49]。VIP1大体可分为两个活性区,一个位于
N-端,一个位于 C-端。N-端部分对于结合 VirE2是
必须的[49],它可能通过促进 T-DNA进入细胞核从
而提高其瞬间表达水平;C-端部分对于多聚体的形
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成是必需的[49],在这部分含有保守的亮氨酸拉链结
构域[41]。与其他 bZIP蛋白(如酵母 Kap114p蛋白)
类似,VIP1与核心组蛋白(如 H2A1、H3)作用进而
参与 T-DNA的整合与转录过程[48~50],从而最终影响
肿瘤的形成或稳定转化[8]。此外还有研究表明 VIP1
就是 T-复合体包裹蛋白泛素化降解[9,23,52,53]的底物
之一。我们知道成熟 T-复合体由 VirD2、VirE2及其
他伴侣蛋白紧密包裹着,卸掉包裹蛋白是单链 T-
DNA合成互补链及瞬间与稳定表达的前提。在泛
素化降解途径中,一些和酵母 Skp1蛋白同源的拟
南芥家族成员与含 F-box结构域的农杆菌 VirF(一
个独立于 T-DNA进入宿主的 Vir蛋白)作用,构成
SCF(Skp1-Culin-F-boxprotein)复合体中泛素连接
酶 E3亚基(E3ubiquitinligase)的保守部分[52],从而
介导 VIP1及与其相连的 VirE2等蛋白的降解。生
物学证据表明 VIP1能与 VirE2及 VirF形成三元复
合物,而这一复合体就作为 T-复合体包裹蛋白降
解的分子基础[53,54]。有意思的是,虽然有很多研究
表明 VirF对于转化是必需的,但并不包括所有物
种,这表明它的功能可被还尚未鉴定的宿主因子所
替代。
另一个与 VirE2蛋白作用的转录因子 VIP2,它
含有保守的 Not结构域(NegativeonTATA-less),其
编码基因的突变或抑制影响拟南芥和烟草的稳定
转化,但并不影响瞬间转化。它可能行使两种功能:
一是通过与 VirE2作用而参与 T-DNA的染色质定
位[49];二是促进组蛋白基因的表达从而有利于T-DNA
的整合对于所必须的[55]。
表 5 在农杆菌 T-DNA整合中起作用的植物因子
虽然 T-DNA是以单链(单链侵入模型)还是双
链(双链断裂模型)形式[47,55]参与整合至今还存在
争论。但达成共识的是 T-DNA在宿主细胞核中转
变成双链 DNA,并且 T-复合体的任何成分都不参
与 T-DNA的整合、修复功能。就连 VirD2的连接酶
活性至今也还存在着争议[56]。因此农杆菌可能利用
宿主的修复系统进行 T-DNA整合,事实也是如此,
现已在酵母和植物细胞中发现了不少参与 T-DNA
整合所必须的蛋白[58~60]。
研究表明,在酵母中 T-DNA可以同源重组(ho-
mologousrecombination,HR)[58]和非同源重组(non-
homologous(ilegitimate)recombination,NHR)[59]两种
形式进行整合。其中 Ku70,Rad50,Mre11,Xrs2,Lig4
和 Sir4参与非同源重组,Rad51和 Rad52(而非
Rad50,Mre11,Xrs2,Lig4和 Ku70)参与同源重组,
而 Ku70[58]和 Rad52[59]分别是同源重组或非同源重
组决定因子,Ku70和 Rad52的双突变体 T-DNA不
能整合[59],另一个酵母 DNA修复蛋白 Rad54可显
著提高转基因植物的 T-DNA整合能力。但在植物
中即使 T-DNA与宿主基因组具有较高的同源性,
也 以 非 同 源 重 组 (non-homologuesend-joining,
NHEJ)为主。一个参与 NHEJ的关键因子 KU80,通
邹智等:影响农杆菌介导遗传转化的植物因子研究进展 7
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
常情况下它与 KU70和 DNA蛋白激酶形成复合体
而起作用[31,47,61],其编码基因突变导致 T-DNA不能
整合进拟南芥的体细胞,但在生殖细胞中(germ-
linecels),KU80却是可有可无[60,62]。同样,另一个
参与 NHEJ的拟南芥基因 LIG4连接酶,在转化过
程中的作用也存在争议,它在拟南芥生殖细胞的转
化中必需[60],但在体细胞中却不是必需的[59]。导致
这样的结果有两种可能,一是自然和非自然条件存
在差异,因为自然条件下生殖细胞很难被转化,大
部分这样的转化实验是在非自然条件下进行的[63];
另一种可能是在体细胞和生殖细胞中参与 T-DNA
整合所需的宿主因子不同[43,63],因为研究表明许多
拟南芥突变体(ratmutants)的体细胞虽然不能被转
化[43],但其生殖细胞却保持有野生型相当的的转化
能力[8]。
6 展望
影响农杆菌介导的植物遗传转化效率的因素
很多。过去的研究主要集中在对农杆菌的改造和培
养条件的优化方面,这些研究并没有从本质上解决
不同植物的转化效率差异问题[64]。越来越多的研究
表明,在决定转化效率的因素中,植物的基因型(如
莴苣、马铃薯、葫芦、豌豆、大豆、拟南芥和葡萄等)
差异比菌种大,并且这些差异基本上是可遗传的,
但在不同植物中的遗传方式有些不同[2,5,6]。因此,
对植物因子的深入研究将有助于更深入的了解转
化的分子机理、扩大农杆菌的宿主范围和提高转化
效率[2]。
今后有两个方面的研究值得关注:(1)运用酵
母双杂交系统、突变体筛选、反向遗传学鉴定以及
基因组学等方法鉴定和分离更多地与转化效率相
关的植物因子;(2)克隆相关基因,对于单基因控制
的过程 (如核输入过程中最关键的基因 VIP1),可
与目的基因一起进行共转化,也可以独立转化获得
对农杆菌更为敏感的材料[40,41]。而对于数量性状控
制的过程,可以用分子标记辅助育种方式培育出对
农杆菌敏感的材料[65,66]。
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