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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
三种提取冬虫夏草菌丝体基因组 DNA方法的比较
谢放  陈京津  朱子雄 
(兰州交通大学 化学与生物工程学院,兰州 730070)
  摘  要:  采用改良氯化苄法、CTAB法、蛋白酶 K裂解法这三种方法, 对冬虫夏草菌丝体基因组 DNA进行提取, 将提取
的基因组 DNA经过紫外分光光度计检测纯度和计算浓度、琼脂糖凝胶电泳分析及 PCR扩增,结果表明, 3种方法均能提取到
符合分子生物学的 DNA, 其中蛋白酶 K裂解法纯度最高,含蛋白质少, 改良氯化苄法、CTAB法次之。而浓度则是改良氯化苄
法最高, CTAB法、蛋白酶 K裂解法次之。3种方法所提取的 DNA均能扩增出理想条带。
关键词:  冬虫夏草  菌丝体  基因组 DNA 提取方法
Comparison of ThreeM ethods for Extracting Genom ic DNA
ofCordyceps sinensisMycelium
X ie Fang Chen J ingjin Zhu Z ix iong
(College of Chem ical and BiologicalEngineering, Lanzhou JiaoTong University, Lanzhou 730070)
  Abstrac:t  Threem ethods o fm odified benzy l ch lo ride me thod, CTAB m ethod and prote inase K lysis m ethod w ere used to extract
the DNA o f cordy cep s m yce lium, the concen tration of DNA w as detected byUV spectrophotom e ter and ca lculated the DNA purity, aga r

ose condensate ge l electrophoresis and PCR amp lification w as ana ly zed. The resu lts showed tha t, the threem e thods w ere able to extract
the DNA from Cordy ceps m yce lium, the DNA w hich w as extrac ted by pro teinase K lysis m ethod was the h ighest purity, conta in ing less
prote in and them od ified benzy l chlor idem ethod and the CTAB m ethod fo llowed. The DNA wh ich w as ex tracted by the benzy l chlor ide
m ethod w as the highest concentra tion, the CTAB me thod follow ed, then the pro te inaseK lysis me thod. The DNA w hich was ex tracted by
three kinds o fm ethod could amp lify the idea l bands.
Key words:  Cordycep s sinensis M yce lium  Genom ic DNA Ex traction m ethod
收稿日期: 2010
03
15
作者简介:谢放,男,副教授,研究方向:资源与环境微生物; E
m ai:l 252671461@ qq. com
快速高效地提取高质量的 DNA样品, 对于进
行限制性酶切、分子杂交以及 PCR扩增等分子生
物学试验有着重要意义。由于冬虫夏草菌丝体生
长缓慢,为获得较多的菌丝体需要长时间的培养,
然而,长时间的培养, 会造成大量色素和其它次生
代谢物的积累, 这对 DNA的提取造成很大困难,
目前,对于冬虫夏草以及冬虫夏草菌丝体基因组
DNA的提取, 报道的主要有氯化苄法 [ 1 ]和 CTAB
法 [ 2 - 4 ] , 本研究比较了 3种不同的冬虫夏草基因
组 DNA提取方法, 为冬虫夏草基因组 DNA的提
取提供参考。
1 材料与方法
11 试验材料
将购自甘肃省甘南自治州的新鲜冬虫夏草,装
在盛有冰袋的保温杯中,运回实验室,立即进行分离
培养,培养基为牛肉汁培养基, 16 培养 45 d。
12 主要试剂
氯化苄 (分析纯,天津市永大化学试剂开发中
心 ); SDS(鹏程生物 ); EDTA (分析纯,上海建信化工
有限公司试剂厂 ) ; CTAB (鹏程生物 ) ; 三水合乙酸
钠 (分析纯,莱阳市双双化工有限公司 ) ;异丙醇 (分
析纯,上海中秦化学试剂有限公司 ); 氯仿 (分析纯,
天津市福晨化学试剂厂 ) ; T ris
饱和酚 (北京索来
宝 ) ;无水乙醇 (分析纯, 烟台市双双化工有限公
司 ) ;

巯基乙醇 (分析纯, 天津市精细化工研究
所 ) ;异戊醇 (分析纯, 上海中秦化学试剂有限公
司 ) ;氯化钠 (分析纯, 天津市巴斯夫化工有限公
2010年第 8期      谢放等:三种提取冬虫夏草菌丝体基因组 DNA方法的比较
司 ) ;琼脂糖 ( BB I)扩增; PCR扩增试剂均由上海生
工提供。
13 主要仪器
TGL
20M高速冷冻离心机 (湖南湘仪 ); DYY

6C型电泳仪 (北京六一仪器厂 ) ;紫外分析仪 (北京
六一仪器厂 ); HH
2数显恒温水浴锅 (国华电器有
限公司 ) ; UVP凝胶成像系统 (USA )。
14 DNA提取方法
141 改良氯化苄法 [ 5]  称取菌丝体 200mg,液氮
研成粉末转至 5mL灭菌离心管中,加 1 000 L提取
缓冲液 ( 100mmo l/L T ris
HC l pH90; 40mmo l/L ED

TA pH80), 200 L 10% SDS, 600 L氯化苄, 振荡混
匀; 50 水浴 1 h,每隔 10m in振荡 1次;加入 600L
3 mo l/L的 NaAc( pH 52)混匀,冰浴 15 m in;用等体
积的 Tris
饱和酚!氯仿 !异戊醇 ( 25!24!1)抽提 1次,
再用氯仿!异戊醇 ( 24!1)抽提 2次;取上清, 加入等体
积异丙醇,室温沉淀 20 m in, 4 , 10 000 r/m in离心
15m in,收集沉淀, 70%乙醇清洗沉淀 2次;加 500 L
TE ( 10 mmol /L T ris
HC l( pH8. 0), 1 mmo l/L EDTA
( pH80) )溶解沉淀, 4 保存。
142 CTAB法 [ 2 ]  称取菌丝体 200 mg, 液氮研成
粉末转至 5 mL灭菌离心管中, 加 1 600 L 65 预
热的提取缓冲液 ( 2% CTAB; 14 mo l/L N aC ;l 02%


巯基乙醇; 20 mmo l /L EDTA; 100 mmo l /L Tris

HC ;l pH80)。充分混匀; 65 水浴 1 h, 期间每隔
10 m in振荡 1次;用等体积的 T ris
饱和酚 !氯仿 !异
戊醇 ( 25!24!1)抽提 1次,再用氯仿: 异戊醇 ( 24!1)
抽提 2次;取上清, 加入 2倍体积的无水乙醇, 室温
沉淀 20m in, 4 , 4 000 r/m in离心 6m in, 收集沉淀,
70%乙醇清洗沉淀 2次; 加 500 L TE溶解沉淀,
4 保存。
143 蛋白酶 K裂解法 [ 6 ]  称取菌丝体 200 mg,
液氮研成粉末转至 5mL灭菌离心管中, 加 2 000 L
提取缓冲液 ( 10 mmo l/L Tris
HC ,l pH80; 01 mo l /L
EDTA; 10% SDS; 75 g /mL蛋白酶 K ), 65 水浴 2
h; 10 000 r /m in离心 15 m in取上清液; 用等体积的
Tris
饱和酚!氯仿!异戊醇 ( 25!24!1)抽提 1次, 再用
氯仿: 异戊醇 ( 24!1)抽提 2次; 取上清,加入 2倍体
积的无水乙醇, 室温沉淀 20 m in, 4 , 10 000 r /m in
离心 10 m in, 收集沉淀, 70%乙醇清洗 1次; 加 500
L TE溶解沉淀, 4 保存。
15 DNA的纯度、浓度以及电泳检测
从以上 3种方法提取的 DNA液中吸取 10 L,
用 TE溶液定容至 2 000 L,在紫外分光光度计下
OD260, OD280值,并计算 OD260 /OD280, 依据公式 DNA
浓度 g /mL) = 50 ∀ OD260 ∀稀释倍数计算 DNA
浓度。
16 PCR扩增
采用 25 L扩增体系, 以随机引物 S20 ( GTT

GCGATCC )作为单引物, 扩增体系组成: 25 mmo l/L
M gC l2 15 L, 25mmo l/L dNTP 15 L, 10 mo l/L
引物 2 L, 10 ∀ Bu ffer 25 L, 5 U /L Taq酶 03
L,模板 (稀释成 50 ng /L) 1 L, 无菌去离子水
162 L。扩增程序: 95 预变性 5 m in 1次; 94
1m in, 36 1 m in, 72 2 m in, 共 35个循环; 最后
72 10 m in 1次。扩增产物在 15%琼脂糖凝胶中
电泳, 5 V /cm, 15 h。
2 结果与分析
21 测定的吸光值及所计算的浓度结果
3种方法提取的基因组 DNA, 在 UV759紫外分
光光度计上测定 260 nm和 280 nm处的吸光值和计
算得到 OD260 /OD280结果如表 1所示。
表 1 三种提取方法的 DNA测定结果
方法 平均
OD260
平均
OD280
OD 260 /
OD 280
浓度
(g /mL)
 改良氯化苄法
 CTAB法
 蛋白酶 K裂解法
0028 5
0027 0
0017 5
0016 5
0016 0
0010 0
1727
1687
1750
285
270
175
通常 OD260 /OD 280值约为 17 - 19, 若小于 17
可能有蛋白污染, 若大于 20, 说明有 RNA污染或
DNA已经降解。由表 1可知,蛋白酶 K裂解法蛋白
质含量较低, DNA纯度较高, 改良氯化苄法、CTAB
法次之。但是,所提取的 DNA溶液的浓度是改良氯
化苄法最高, CTAB法、蛋白酶 K裂解法次之。
22 琼脂糖凝胶电泳结果
3种方法提取的 DNA在 08% 的琼脂糖上电
泳, 电压 3V /cm,时间 1 h,结果如图 1。从图 1可以
看出, 3种方法提取的 DNA,条带清晰,均无降解, 条
带的亮度也与 DNA的浓度高低相一致, 即改良氯化
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生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 8期
苄法提取的 DNA亮度最亮,其次是 CTAB法和蛋白
酶 K裂解法。但是改良氯化苄法和 CTAB法的杂质
带相对多一些, 这除与 DNA溶液的浓度有关外,也
与 DNA溶液的纯度相关。
M. DNA
H ind# ; 1- 3.改良氯化苄法提取结果;
4- 6. CTAB法提取结果; 7 - 9. 蛋白酶 K裂解法
提取结果
图 1 三种提取法所得 DNA的电泳图谱
23 PCR扩增结果
由图 2可以看出, 3种方法均扩增出了清晰且
相同数目的条带。这说明 3种方法所提的 DNA在
结构上都具有完整性,且适合于 RAPD等分子标记
试验。
M. DL 2000; 1- 3.改良氯化苄法; 4- 6. CTAB法;
7- 9.蛋白酶 K裂解法
图 2 三种提取法所得 PCR电泳图谱
3 讨论
冬虫夏草菌的菌落呈 ∃肉质 %,无论哪种提取法
都需将菌丝体制成菌粉,本试验采用液氮冷冻研磨。
DNA的提取受 pH 值的影响较大, 所以提取液以及
TE溶液的 pH 值一定要准确。考虑到菌丝体中含
有大量色素和其他次生代谢物, 故本试验将传统氯
化苄法 [ 5]进行了改良, 即增加了用 T ris
饱和酚 !氯
仿!异戊醇 ( 25!24!1), 氯仿 !异戊醇 ( 24!1)对提取
液进行多次抽提, 这样更能有效地去除色素和蛋白
质等,效果十分显著。从试验结果来看, 3种方法提
取的 DNA都比较理想,都符合分子生物学试验的要
求, 相对而言, 蛋白酶 K裂解法纯度最高, 改良氯化
苄法浓度最高。但是,蛋白酶 K在提取液制备过程
和 DNA提取过程中很容易失活, 影响效率, 而且价
格昂贵,应用受到限制。而氯化苄法省时,高效且廉
价, 近年来在真菌 DNA提取过程中受到广泛关注。
参 考 文 献
[ 1] 李增智,黄勃,李春如,樊美珍.确证冬虫夏草无性型的分子生物
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传分化.遗传学报, 1997, 24( 5) : 410
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