全 文 ：·基础研究·
基金项目:黑龙江省科技攻关项目(GC06C40801)
作者简介:马晓鹏 , 博士 , 主治医师 , E-mail:mxpeng1977@
tom.com
虫草肾茶颗粒对单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化
模型 CTGFmRNA的影响
马晓鹏 1 ,宋立群 1 ,于思明1 ,王丽哲 2 ,马艳春3
(1.黑龙江中医药大学附属第一医院肾内科 ,哈尔滨 150040;2.黑龙江省医院;3.黑龙江中医药大学)
[摘要 ] 　目的　观察虫草肾茶颗粒对单侧输尿管结扎致肾间质纤维化模型大鼠肾组织 CTGFmRNA的
影响。方法　将 60只雄性 wistar大鼠随机分为五组 , 分别为假手术组 、模型组 、中药对照组 、西药对照组 、治
疗组 , 每组 12只。采用单侧输尿管结扎法制作肾间质纤维化模型 , 治疗组给予虫草肾茶为 4 ml· d-1·只 -1;
西药对照组给予福辛普利为 1.5 ml· d-1· 只 -1的水溶液;中药对照组给予肾衰宁胶囊 4 ml· d-1·只 -1 ,
1次 /d给药;假手术组及模型组给予相同体积的生理盐水灌胃 , 1次 /d。实验期间每周称一次体重 , 并观察大
鼠生存状况。于第 6周末处死大鼠 , 留取肾组织 , 应用 realtime-PCR检测各组肾组织 CTGFmRNA的表达。
结果　治疗组大鼠肾组织 CTGFmRNA的表达与模型组相比明显下调。结论　虫草肾茶颗粒可以部分抑制
CTGF在单侧输尿管结扎大鼠肾组织的表达。
[关键词 ] 　纤维化 /肾;输尿管梗阻;冬虫夏草属;猫须草;大鼠 , wistar
[中图分类号 ] R692.12　　　[文献标识码 ] A　　　[文章编号 ] 1672-6790(2010)03-0271-04
TheeffectsofChongCaoShenChaGranulesonexpressionofCTGFmRNAinthekidneytissueofratswithu-
nilateralureteralobstruction　MAXiao-peng1 , SONGLi-qun1 , YUSi-ming1 , WANGLi-zhe2 , MAYan-chun3(1.De-
partmentofNephrology, FirstAfiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine, Harbin150040, China.
2.HeilongjiangProvincialHospital.3.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine)
[ Abstract] 　Objective　ToinvestigatetheefectsofChongCaoShenChaGranulesonexpressionofCTGFmR-
NAinthekidneytissueofratswithunilateralureteralobstruction(UUO).Method　Intheexperiment, themalerats
byunilateralureteralObstruetion(UUO)wasadopted.TheratswererandomlydividedintoSham-operatedgroup
(n=12), theUUOgroup(n=12), traditionalChinesemedicinecontrol, westernmedicinecontrolgroup, treatment
group.thetreatmentgroupwereintragatriclyfeedwithCongCaoshenChaGranulesfor4ml/d;westerndrugcontrol
groupintragatriclyfeedwithfosinoprilaqueoussolutionwas1.5mg/d;traditionalChinesemedicinecontrolgroupwas
givenShenShuaiNingcapsules4ml/dforsixweeks;sham-operatedgroupandmodelgroupweregiventhesamevolume
ofsalinegivenoralyonceaday.Duringtheexperiment, bodyweightofeveryratwasmeasuredeveryweek, andob-
servethequalityoflife.Inthe6thweeks, allratswerekilled, therealtime-PCRwereusedtodetecttheexpression
ofCTGFmRNAinthekidneytissueofrats.Result　TheexpressionofCTGFmRNAinthekidneytissueoftreatment
groupratssignificantlydowncomparedwiththemodegroup.Conclusion　Chongcaoshenchaparticlescanpartlyin-
habittheexpressionsofCTGFofunilateralureteralobstructionrats.
[ Keywords] 　Fibrosis/kidney;Ureteralobstruction;Cordyceps;Herbofspicateclerodendranthus;Rats, wistar
　　人类肾脏疾病病理改变和肾小球损害实验动物
模型进行的大量研究显示 ,肾间质纤维化在肾脏疾
病转归中起主导作用 ,其病变程度与慢性肾病的预
后密切相关 。肾间质纤维化几乎是各种肾脏疾病进
展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理基础 [ 1-2] 。
早期防止甚至逆转肾间质纤维化对防治终末期肾衰
竭具有重要意义。现代医学对小管一间质纤维化的
发病机制进行了广泛的研究 ,显示有多种成分或因
素参与小管间质纤维化的发生过程。这就为肾间质
纤维化的治疗提供了多靶点 [ 3] 。
肾间质纤维化的促进因素涉及范围较广 ,其中
结缔组织生长因子(CTGF)在肾小球和肾间质的高
·271·中国临床保健杂志　2010年 6月第 13卷第 3期　ChinJClinHealthc, June2010, Vol.13, NO.3
表达是导致慢性肾脏疾病纤维化进展的重要原因 。
最近研究证实 ,在实验动物与人肾纤维化中 , CTGF
的表达与肾小管间质纤维化呈正相关 , CTGF可能
介导 TGF-β的许多致纤维化作用 [ 4] 。CTGF存在于
多种人体组织 ,但在肾脏的含量最为丰富 [ 5-6] 。因
此 ,调控肾脏局部 CTGF的表达 ,对延缓慢性肾脏疾
病纤维化的进展有着重要意义 [ 7] 。
1　材料与方法
1.1　实验动物与药物　Wistar大鼠 , 180 ～ 200g,清
洁级 ,购自吉林大学基础医学院实验动物中心 。 60
只大鼠随机分成假手术组 、模型组 、中药治疗组 、中
药对照组 、西药对照组 , 每组 12只 。中药治疗
组 ———虫草肾茶颗粒剂 ,组成为虫草 、黄芪 、大黄 、水
蛭 、猫须草 、草叩 。药物由黑龙江中医药大学附属第
一医院中药房提供 ,由黑龙江中医药大学药学院药
剂教研室协助制成胶囊 ,配成浓度 1.5 g/ml水溶液
(含 生 药 );中 药 对 照 组———肾 衰 宁 胶 囊
(0.35 g/粒),云南理想药业有限公司生产 , 批号
20051103,用无菌 0.9%氯化钠注射溶液配制成
0.03g/ml的 水 溶 液。 西 药 对 照 组 ———蒙 诺
(5mg/片),中美上海施贵宝制药有限公司生产 ,批
号 050288, 用无菌 0.9%氯化钠注射溶液配成
0.2mg/L的水溶液 。
1.2　试剂及仪器 　SYBR· ExScriptTM RT-PCRKit
(PerfectRealTime)和 RNAisoReagent,宝生物工程
有限公司。
RT-PCR反应引物序列:通过 htp://www.ncbi.
nlm.nih.gov网站进入 Genbank数据库 , 查找 Rat
CTGFmRNA和 GAPDHmRNA全基因序列。根据
CTGFmRNA和 GAPDHmRNA全基因序列 ,由宝生
物工程有限公司进行引物设计 , 设计的引物序列
如下:
大鼠结缔组织生长因子(CTGF)。
Forward:5′-AACTGTGCACGGAGCGTGA-3′
Reverse:5′-CACTGGTATTTGCAACTGCTTTGG-3′预
计扩增片段 175bp
大鼠磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehydesphosphate
dehydrogenase, GAPDH)。
Forward:5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′
Reverse:5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′预计
扩增片段 127bp
以上引物通过同源性(htp://www.ncibi.nlm.
nih.gov/blast)比较 ,均为特异引物 。
1.3 　单侧输尿管结扎法肾间质纤维化模型的制
作:大鼠适应性饲养 2周后 , 在 10%水合氯醛 30
ml/kg腹腔注射麻醉下 ,将大鼠右侧卧位固定于手术
台上 ,剪毛后用碘酊 、75%乙醇消毒手术区 ,行左侧
腹切口 ,逐层切开皮肤 、肌肉及腹壁各层 ,暴露并分
离左侧输尿管 。假手术组仅切开腹腔并游离左侧输
尿管 ,但不结扎和剪断。其他各组大鼠用 4-0丝线
结扎两道 ,上一道结扎点位于左肾下极水平 ,然后在
两道结扎点间剪断输尿管逐层缝合。
1.4　给药方法 　中药治疗组:给予虫草肾茶
1.5 g/ml的水溶液 4 ml, 1次 /d。中药对照组:给予
肾衰宁 0.03 g/ml的水溶液 4ml, 1次 /d。西药对照
组:给予蒙诺 0.2 mg/L的水溶液 4 ml, 1次 /d。造
模当天给药 ,模型组 、假手术组灌胃等量 0.9%氯化
钠注射溶液。
1.5 　肾组织标本采取方法　第 6周末时腹腔注射
1%戊巴比妥钠(剂量 1 ml/100 g体质量)麻醉大
鼠。仰卧位固定大鼠 ,腹正中切口 ,逐层打开腹腔 ,
钝性游离腹主动脉 ,暴露出双侧肾动脉 、肾静脉 ,在
左肾动脉分支下约 1 cm处 ,用套管针逆行穿刺腹主
动脉 ,固定套管针抽取动脉血 3 ～ 5ml。夹闭肾动脉
分支以上腹主动脉近心端 ,并在双侧肾静脉上剪一
小口 ,然后经套管针灌注预冷无菌 0.9%氯化钠注
射溶液 ,冲除肾组织中血液 ,直至肾脏由红变白。迅
速剪下双侧肾脏 ,剥去肾被膜 。摘取左侧肾脏 ,纵行
剖开 ,一半置于多聚甲醛溶液中固定 ,用于普通光镜
检测;另一半用无核糖核酸 (RNA)酶的铝箔包好 ,
迅速置于液氮冻存 ,用于 RNA提取 。取肾脏标本前
所有玻璃器皿及金属器械在锡箔纸封口包裹后 ,在
180 ℃的高温下干烤 8h,以去除 RNA酶 。
1.6　实时定量 RT-PCR检测大鼠肾组织 CTGFmR-
NA表达　①抽提总 RNA:采用 RNAisoReagent提
取总 RNA,操作按说明书进行 ,紫外分光光度法及
琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA的含量 、纯度和完整
性。 ②逆转录反应:在 2700型 PCRSystem扩增仪
上进行逆转录反应 , 按 SYBR· ExScriptTM RT-PCR
Kit说明书进行 cDNA合成 ,反应参数为:反转录反
应 42 ℃15 min,反转录酶失活反应 95 ℃ 2 min。 ③
PCR反应:采用 SYBRPremixExTaq(PerfectReal
Time)kit试剂盒 ,在 ABI7300荧光定量 PCR仪上
进行 PCR反应。第一步是预变性 , 95℃预变性10 s,
共 1个循环。第二步是 PCR反应 , 95℃变性 5 s,
60 ℃退火 31 s,共 40个循环 。整个过程中收集荧
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光 ,反应结束后 , 使用 SequenceDetectionsoftware
version1.2.3软件(AppliedBiosystems公司)分析
PCR过程各检测样本的 Ct(Thresholdcycle)值 , Ct
值随模板浓度增大而减少 ,由熔解曲线判断 PCR反
应的特异性 。
1.7　结果分析　CTGFmRNA相对含量采用 2-■■Ct
值表示 。分别扩增 GAPGH和 CTGF,每样本作 2个
复孔 ,通过以下公式计算 2-■■Ct值。
■Ctintervention=CtinterventionCTGF-Ctintervention-
GAPDH, ■Ctblank=CtblankCTGF-CtblankGAPDH,
■■Ct=■Ctintervention-■Ctblank。
1.8　统计学处理 　计量资料 x±s表示 ,用 SPSS
13.0统计软件进行分析 。多组间差异的显著性分析
用单因素方差分析(one-wayANOVA),组间两两比
较用 SNK检验。
2　结果
2.1　产物鉴定　包括熔解曲线分析和 2%琼脂糖
凝胶电泳。每个样本的熔解曲线只有一个熔解峰 ,
全部样本的熔解峰非常接近 ,表明只产生一种特异
性扩增产物 ,结合 2%琼脂糖凝胶电泳可进一步鉴
定产物的特异性 ,以 DNA分子量标记物为参照 ,可
证实产物片段大小与实验设计相符。见图 1。
2.2　虫草肾茶胶囊对肾间质纤维化模型大鼠 CTG-
FmRNA的影响　见表 1。
表 1　肾间质纤维化模型大鼠 CTGFmRNA的情况(x±s)
组别 CTCTGF CTGAPDH ■Ct 2-■■Ct
西药对照组 25.07±0.26 17.46±0.10 7.54±0.19 2.13±0.37
中药对照组 25.21±0.16 17.56±0.20 7.65±0.11 2.21±0.47
模型组 24.71±0.15 17.43±0.13 7.28±0.12 2.83±0.46
假手术组 26.16±0.13 17.39±0.14 8.77±0.24 -
治疗组 25.12±0.26 17.51±0.10 7.43±0.19 2.05±0.56
2.3　大鼠肾脏形态学观察　肉眼大体观察 ,假手术
组大鼠肾脏外观大小正常 ,无明显变化。模型组梗
阻侧肾脏显著增大肿胀呈大枣状 ,肾盂 、肾盏扩张 ,
肾实质变薄或消失 ,表面不平 ,灰红相间 ,包膜显著
增厚 ,部分包膜出现新生血管 ,个别大鼠出现肾盂积
脓 。与对应时间点的 UUO组相比 ,中药对照组 、西
药对照组 、治疗组梗阻侧肾脏肿大及积水程度较轻 ,
色泽较红润 。对侧右肾稍肿大 、颜色稍浅 ,肾组织结
构清楚 。
HE染色:模型组大鼠手术侧肾脏 HE染色可见
炎性细胞浸润 ,肾皮质极薄 ,近端小管空泡颗粒变性
显著 ,部分小管萎缩消失 ,间质纤维化显著 。中药对
照组 、西药对照组和治疗组大鼠手术侧肾脏 HE染
色可见病理改变较模型组轻 。
3　讨论
虫草肾茶胶囊由冬虫夏草 、猫须草 、黄芪 、水蛭 、
大黄等药物组成。冬虫夏草为麦角菌科植物冬虫夏
草菌的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆虫虫草蝙蝠蛾等幼
虫尸体的复合体 ,性甘温 ,入肺肾经 ,能补虚损 ,益精
气 ,止咳化痰 ,为补虚要药 。猫须草 ,为唇型科植物
猫须草的全草 ,别名肾茶 ,性甘淡 ,微苦 ,能清热去
湿 ,排石利水。该药在我国南方省份多有栽培 ,临床
上对急慢性肾炎有较好疗效 。黄芪 ,性甘 ,微温 ,入
脾肺经 ,为补气要药 。全方补而不滞 ,泻不伤正 ,体
现了健脾益肾 ,化瘀排毒 ,芳化湿浊的特点 [ 8] 。
最近研究证实 ,在实验动物与人肾纤维化中 ,
CTGF的表达与肾小管间质纤维化呈正相关 , CTGF
可能介导 TGF-β 的许多致纤维化作用。 CTGF与
TGF-β的关系密切 , TGF-β 主要分布在肾小管-间
质 ,是介导细胞外基质沉积的重要因子 。而 CTGF
作为 TGF-β的下游因子 ,在同类细胞因子中占据了
更重要的位置。有学者发现 ,与对照组相比 , UUO
大鼠梗阻侧肾组织 CTGFmRNA随着 TGF-β1而显
著上调 ,继之出现 FNmRNA明显上升 , CTGFmRNA
显著增加 。
本研究结果显示 ,与假手术组相比 ,模型组大鼠
肾组织 CTGFmRNA的表达明显上调 ,是假手术组
的 2.83倍 ,表明 CTGFmRNA的过度表达与单侧输
尿管结扎引起的肾间质纤维化相关 ,组织病理学检
查也发现单侧输尿管梗阻可以引起肾小管萎缩 ,肾
间质纤维化的发生 。与假手术组相比 ,中药对照组 、
西药对照组 、治疗组肾组织 CTGFmRNA的表达也
明显上调 ,分别为假手术组的 2.21倍 、2.13倍 、
2.05倍 ,实验结果显示虫草肾茶可以抑制单侧输尿
管梗阻引起的肾组织 CTGFmRNA的过度表达。虫
草肾茶组 CTGFmRNA的表达与中药对照组 、西药
对照组相比有所减少 ,说明虫草肾茶在保护肾脏方
面有一定的优势。但无论是虫草肾茶 ,还是蒙诺 、肾
衰宁都不能完全抑制肾组织 CTGFmRNA的过度表
达 ,说明这三种药物虽有一定的抑制 CTGFmRNA
作用 ,但尚不能完全阻断单侧输尿管结扎引起的肾
组织 CTGFmRNA高表达 。
(本文图 1见封三)
参考文献
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·273·中国临床保健杂志　2010年 6月第 13卷第 3期　ChinJClinHealthc, June2010, Vol.13, NO.3
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(收稿日期:2010-04-13)
·基础研究·
作者简介:魏优秀 ,主治医师 , E-mail:leixn1999912@yahoo.com.cn
注射胰岛素样生长因子 -1、转化生长因子 -β1
治疗关节软骨缺损及预防骨关节炎的实验研究
魏优秀 ,韦卓 ,刘平 ,周伟 ,孙文晓
(华中科技大学同济医学院附属梨园医院骨科 ,武汉 430077)
[摘要 ] 　目的　探讨关节腔内注射胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子-β 1(TGF-β 1)对修复关
节软骨缺损及预防骨关节炎的作用。方法　35只雄性成年新西兰大白兔随机分成 4组 ,空白对照组(A组)5
只 , 实验组(B、C、D三组)每组 10只 ,在膝关节滑车处钻孔造成关节软骨全层缺损 , 以右膝为实验侧 , 术后向
关节腔内注射 1 mg/ml的 IGF-1、TGF-β 1、IGF-1+TGF-β 1各 0.1ml, 每周 1次;左膝为对照侧 , 与实验组同一
时间注射等量 0.9%氯化钠注射溶液。于术后 4、 8周分别取材进行大体观察 , HE和 SafraninO染色评分 ,同
时运用免疫组织化学方法观察生长因子及其受体的表达情况。结果　各组实验侧软骨缺损处组织的修复情
况均优于对照侧 , 并且实验侧在各组软骨缺损周围的正常软骨未发生明显退变 ,而对照侧周围软骨在 4、8周
时发生了不同程度的退变 ,周围软骨中生长因子的表达实验侧与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05),
而对照侧 4、8周与正常组比较差异有统计学意义(P<0.01);受体的表达在各组实验侧和对照侧与正常组比
较均差异无统计学意义(P>0.05)。结论　关节软骨缺损早期行 IGF-1、TGF-β 1关节腔内注射可有效促进关
节软骨缺损的修复 , 并延缓周围软骨的退变 , 两者联合治疗有协同作用。
[关键词 ] 　胰岛素样生长因子Ⅰ ;转化生长因子 β;骨关节炎;模型 ,动物
[中图分类号 ] R684.7　　　[文献标识码 ] A　　　[文章编号 ] 1672-6790(2010)03-0274-04
Experimentalstudyontherepairofarticularcartilagedefectsandpreventiononosteoarthritisbyintra-artic-
ularinjectionofIGF-1、TGF-β 1　WEIYou-xiu, WEIZhuo, LIUPing, ZHOUWei, SUNWen-xiao(Departmentof
Orthopedic, AfiliatedLiyuanHospitalofTongjiMedicalColege, HuazhongUniversityofScienceandTechnology, Wu-
han430077, China)
[ Abstract] 　Objective　Toinvestigatetheefectofinsulin-likegrowthfactor-1 (IGF-1)andtransforming
growthfactor-β 1 (TGF-β 1)ontherepairofarticularcartilagedefectsandthepreventionofosteoarthritisbyintrartic-
ularinjection.Methods　Atotalof35 healthymaturedNewZealandrabbitswererandomlydividedinto4 groups.The
·274· 中国临床保健杂志　2010年 6月第 13卷第 3期　ChinJClinHealthc, June2010, Vol.13, NO.3