全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
制霉菌素抗性筛选高活性苎麻脱胶菌诱变菌株
曾莹 1 向新柱 2
(1湖北工业大学生物工程学院 ,武汉 430068; 2武汉科技学院 ,武汉 430073)
　　摘 　要 : 　利用制霉菌素抗性筛选高渗透性突变株 ,提高黑曲霉菌对苎麻纤维的脱胶能力 ,使微生物脱胶能用于工业生
产实践之中。分别用紫外线、硫酸二乙酯、亚硝酸作为诱变剂对黑曲霉 31012菌株进行诱变处理。以制霉菌素抗性为遗传标
记 ,从突变菌株中定向筛选得到一株高活性苎麻脱胶菌黑曲霉 31012226。在以未经刮制的苎麻韧皮为主要碳源 , 017%
(NH4 ) 2 SO4为氮源 ,添加 0105% KCl; 0105%MgSO4 ; 011% K2 HPO4 ; 011%酵母膏 ; Tween80 011%的培养液中 ,接入黑曲霉
31012226,置 30℃下 , 150 r/m in处理 30 h左右 ,脱胶苎麻纤维的残胶率平均为 14143%。
关键词 : 　诱变育种 定向筛选 制霉菌素抗性 苎麻脱胶菌 黑曲霉
M utation Breeding of Nystatin ResistantM icroorgan ism
with High Ram ie Degumm ing Activ ity
Zeng Ying1 Xiang Xinzhu2
(1 College of B ioengineering, Hubei University of Technology, W uhan 430068;
2W uhan Institu te of Science and Technology, W uhan 430073)
　　Abs trac t: 　 In order to imp rove the ram ie degumm ing capability of A sperg illus n iger strain, Nystatin resistance was emp loyed for
screening high permeable mutation strain, so that m icroorganism degumm ing can be app lied into industrial p roduction1 The A spergillus
n iger 31012 strain was mutated by UV light, DES, and nitrite treatment1 The strain A spergillus niger 31012226, which has high ram ie
degumm ing activity was selected out from all the mutants using Nystatin resistance as the genetic marker1 A spergillus niger 31012226
was inoculated into the medium containing unwipered ram ine bast as the main carbon source, 017% (NH4 ) 2 SO4 as nitrogen source, in
addition with 0105% KCl; 0105%MgSO4 ; 011% K2 HPO4; 011% yeast extract; Tween80 011% 1This incubation lasted 30 h at 30℃
and 150 r/m in, the average residual gum content of ram ie fiber was 14143% 1
Key wo rds: 　Mutation breeding D irective breeding Nystatin resistance Degumm ing strain of ram ie　A spergillus niger
收稿日期 : 2009209203
作者简介 :曾莹 (19532) ,女 ,教授 ,研究方向 :产酶菌株的选育 ; E2mail: zengyin1227@1261com　　苎麻脱胶是影响苎麻纤维纺织加工的关键 ,传统的化学法脱胶不仅对苎麻纤维有一定的损伤 ,会严重污染环境 ,而且破坏了苎麻纤维本身具有的多种对人体有益的保健功能 ,残留的化学物质影响人体健康。[ 1 ]生物法脱胶则是利用微生物或微生物产生的酶将胶质分解。其作用条件温和 ,对纤维损伤小 ,还能提高苎麻纤维的光泽度 ,而且生物法脱胶耗水少 ,污染轻 ,有利于环境保护 [ 2, 3 ]。多年来 ,国内外在微生物脱胶方面进行了一系列的研究 ,但因所筛选到的脱胶菌株脱胶关键酶活力不高或分泌的酶系不全 ,苎麻经微生物脱胶处理后仍然不能达到纺 织工业生产上对苎麻纤维的要求 ,而未能完全替代化学脱胶广泛应用于工业生产中 [ 4～6 ]。为了提高菌株脱胶的能力 ,一个重要方法是进行诱变育种。而选用合适的诱变剂及特殊的筛选方法 (即“筛子 ”)是提高诱变效果的关键所在。本研究试图对筛选得到的一株苎麻脱胶菌分别用紫外线、硫酸二乙酯、亚硝酸作为诱变剂进行诱变处理 ,以 Nystatinr为标记 ,定向筛选得到高活性苎麻脱胶菌。1　材料与方法1. 1　材料原麻未经刮制的有壳苎麻由湖北省咸宁市天
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
化麻业公司提供 ;菌种 :黑曲霉 (A sperg illus n iger)
31012;主要试剂 :木聚糖、果胶 ,美国 Sigma公司 ;
羧甲基纤维素钠 ,上海化学试剂公司。
培养基 : (1)蔗糖 20 g,酵母膏 10 g,蛋白胨 10
g,琼脂 20 g, pH自然。 ( 2)选择平板培养基 :上层
为无机盐溶液 ( K2 HPO4 017 g, NH4 NO3 110 g, NaCl
01005 g, ZnSO4 01002 g, KH2 PO4 017 g,MgSO4 017 g,
MnSO4 01001 g, FeSO4 01002 g, H2 O 1 000 m l) ,去氧
胆酸钠 110 g,苎麻韧皮粉 1010 g,琼脂 2010 g, pH
自然。下层为无机盐溶液 1 000 m l,琼脂 2010 g, pH
自然。 (3)脱胶发酵培养基 :苎麻条 60 g,酵母膏
410 g, K2 HPO4 110 g, KCl 015 g, MgSO4 015 g,
(NH4 ) 2 SO4 710 g, Tween80 110 g, H2 O 1 000 m l, pH
自然。
1. 2　方法
1. 2. 1　菌种的活化 将保藏菌种接入斜面培养基
中 ,置 30℃下培养 3 d。
1. 2. 2　最低抑菌浓度 (M IC)的测定 用稀释平板法
测定 Nystatin对黑曲霉 31012的最低抑菌浓度 (M IC)。
1. 2. 3　诱变处理 以 DES、HNO2、、UV为诱变剂 ,
分别用不同剂量的诱变剂对出发菌株的孢子悬浮液
进行处理。
1. 2. 4　突变株的分离 将经诱变处理的孢子悬浮
液涂于含最低抑菌浓度 Nystatin的选择平板上 ,置
30℃下恒温培养箱中培养 72 h左右 ,观察并记录结
果 ,生长良好的菌落即为抗性突变株。将突变株接
入斜面培养基上 ,置适宜条件下培养。
1. 2. 5　突变株的筛选 ( 1 )平板初筛 :往含最低
抑菌浓度 Nystatin的选择平板上注入 Lugol I2液 ,
染色 5 m in;用生理盐水漂洗 5 m in后 ,测 HC值。
HC值 =透明圈直径 /菌落直径。 ( 2)摇瓶初筛 :将
孢子浓度为 310～510 ×106个 /m l的孢子悬浮液定
量接入摇瓶筛选培养基中 ,置 30℃下 150 r /m in,
培养 30 h左右 ,测定残胶率。根据国家标准 GB
5889286测定脱胶麻纤维的残胶率。 ( 3 )复筛 :方
法 :同上 ,同时测定培养液的纤维素酶活、木聚糖
酶活和果胶酶活。
1. 2. 6　酶活力的测定 酶液的制备 :取置一定条件
下的培养瓶 ,将脱胶培养液过滤 ,滤液即为酶液。纤
维素酶、木聚糖酶、果胶酶活力测定 :用 DNS法 [ 7 ] ,酶
活力单位定义 :在 50℃、pH416条件下 ,每分钟水解底
物产生 1μg还原糖所需的酶量为一个酶活力单位 ,
以 U /m l表示。
酶活单位 = N G / 011 ×10 (μg还原糖 /m in)
其中 N 为酶液稀释倍数 ; G为酶解液中还原糖的含
量 (μg) ; 011 为加酶液量 (m l) ; 10 为酶解时间
(m in)。
2　结果与分析
2. 1　最低抑菌浓度 (M IC)的测定
制备 Nystatin系列浓度梯度稀释液 ,分别加入
选择平板培养基中 ,取孢子悬液点接于平板上 , 30℃
培养 40 h左右 ,观察平板上的菌株生长情况 ,确定
Nystatin对出发菌株的最低抑制浓度 (以未长菌平
板所含最低药物浓度为药物对出发菌株的最低抑制
浓度 )。由表 1可知随着 Nystatin浓度增加 ,平板上
菌株的生长量下降 ,当选择平板培养基中 Nystatin的
浓度达到 8175μg/m l时平板上无菌落形成。故 Nys2
tatin 对 黑 曲 霉 31012 菌 株 的 最 低 抑 菌 浓 度
为 8175μg/m l。
表 1　Nysta tin对黑曲霉 31012生长的影响
Nystatin (μg/m l) 11125 10 8175 715 6125 510 3175 0
菌株生长情况 2 2 2 2 2 2 2 2 2 + + + + + + + + + + + +
　　注 : +表示菌株生长 , +的个数表示菌株生长量 , 2表示未长菌
2. 2　突变株的分离筛选
从含 Nystatin最低抑菌浓度的平板上分离到 63
株 Nystatin抗性突变株 ,通过平板培养测定 HC值和
摇瓶发酵检测残胶率 ,其中 16株的脱胶效果较好
(表 2)。由表 2数据可见 HC值与残胶率并不一定
成正相关。这可能与菌株在平板上和在摇瓶中的培
养环境不同有关 [ 8～10 ]。其中与出发菌株比较 ,残胶
率降低了 13%以上的菌株有 6株 ,其胶质去除率见
表 3。其中 31012225的脱胶效果最好 ,胶质去除率
达 65121% ,比出发株提高了 14158%。
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2009年第 12期 曾莹等 :制霉菌素抗性筛选高活性苎麻脱胶菌诱变菌株
表 2　突变株初筛结果
突变株 HC值 残胶率 ( % ) 突变株 HC值 残胶率 ( % ) 突变株 HC值 残胶率 ( % )
3101223 2179 17141 31012226 1163 14138 31012251 2168 15188
3101224 2122 17106 31012238 2157 14172 31012256 2198 14184
3101228 1168 15141 31012239 2114 14121 31012257 3156 15122
31012213 2144 15114 31012241 1156 15105 31012260 2119 15161
31012219 2141 14173 31012242 2122 14175 出发株
31012225 2194 13170 31012248 2193 15129 An31012 2128 16197
　　注 :以上数据为 3次试验的平均值
表 3　主要突变株的脱胶能力
突变株 胶质去除率 ( % ) 突变株 胶质去除率 ( % )
31012219 62160 31012238 62162
31012225 65121 31012242 62154
31012226 63148
31012239 63192 出发株 56191
　　苎麻微生物脱胶的原理是利用脱胶菌发酵产生
的脱胶酶作用于苎麻 ,将苎麻中的胶质酶解为可溶于
水的小分子物质 ,获得分离的纤维束 [ 11, 12 ]。为此 ,对
胶质去除率在 631%以上的 3个菌株进行酶活力的
测定 ,依据高木聚糖酶活、果胶酶活 ,低纤维素酶活、
残胶率的原则进行筛选 ,结果见表 4。由表 4数据综
合分析可见 , 31012226菌株较好。
2. 3　高活性菌株遗传稳定性考察
将以上菌株连续转接 6代进行脱胶发酵 ,分别测
定残胶率 ,结果见表 5。比较可见 31012226菌株的遗传
稳定性较好。
表 4　突变株复筛结果
突变株
31012225
31012226 酶活力 (μg/m l)木聚糖酶 果胶酶 纤维素酶2 238184 4 723163 1161113 96615 5 599199 112150 残胶率 ( % )1217311199
31012239 1 89519 3 410100 078189 14118
表 5　菌株的稳定性
传代次数 (代 ) 1 2 3 4 5 6 标准差 ( S)
残胶率 31012225菌株 12169 14173 13169 13174 14111 15141 01937 025
( % ) 31012226菌株 13148 14143 15124 14102 13180 1516 01835 761
31012239菌株 13171 15189 13104 13195 16144 14156 11319 051
3　小结
以 Nystatinr为标记 ,从经过诱变育种处理的突变
株中定向筛选得到一株高活性苎麻脱胶菌黑曲霉
31012226。用黑曲霉 31012226进行苎麻脱胶处理后 , 脱胶麻的残胶率平均为 14143% ,比出发株下降了14197%。虽然经黑曲霉 31012226菌株脱胶处理后脱胶麻的残胶率偏高 ,达不到纺织工业生产上对苎麻(下转第 183页 )
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2009年第 12期 李勇超等 : SPE2HPLC法快速检测发酵液中紫杉醇的含量
的自制固相萃取柱 ,分别建立了一套完整的 SPE2HPLC
方法 ,检测结果令人满意 ;庞欣等 [8 ]证明了 SPE2HPLC
良好优越性 ;雒丽娜 [ 9 ]和吴江等 [ 10 ]各自利用自制的
PRP26固相萃取柱和 A l2 O3固相萃取柱对粗提液进
行预处理 ,起到良好的效果。综观上述研究 ,虽都通
过 SPE2HPLC对紫杉醇检测取得了良好的效果 ,但
其所用固相萃取柱的型号及填料种类与填量多少都
存在较大差异 ,且大多固相萃取柱尚未实现商品化 ,
使得要求精确的紫杉醇检测难以保证有较高的重现
性 ,对于大批量的检测不太适宜。本研究选用的是
商品化的 C18固相萃取柱 ,其重复性良好 ,可以避免
多个处理间因为固相萃取柱不同而产生的差异 ;而
且 ,固相萃取柱的填料和 HPLC色谱柱的填料是一
致的 ,可以对色谱柱起到有效的保护作用 ,延长良好
柱效时间。
3. 2 洗脱剂的选择
固相萃取紫杉醇用到的洗脱剂有甲醇 [ 9 ] ,其最
佳洗脱浓度为 80% ,与本研究一致 ,但其回收率超
过 90% ,略高于本试验所得的 8716% ,原因可能是
填料不同。也有用三氯甲烷 2甲醇 [ 7, 10 ] ,其回收率也
超过了 90%。还有用 8∶1的甲醇 /乙酸铵 [ 11 ]缓冲液
(0101 mol/L , pH510) ,回收率在 90%左右 ,也与本
研究一致。回收率的高低与洗脱剂的种类、浓度和
流速 ,以及填料的种类和床体积等因素有着密切的
关系 ,要进一步提高回收率可通过尝试改变流速和
床体积等。
参 考 文 献
1　 W aniMC, Taylor HL, Monro CF, et1al1 Jam Chem Soc, 1971, 93:
2325～23271
2　 Stierle A, Strobel GA, Stierle D1 Science, 1993, 260 ( 5105 ) :
214～2161
3　赵凯 ,平文祥 ,周东坡 1微生物学报 , 2008, 48 (3) : 403～4071
4　程龙 ,马奇明 ,陶冠军 ,等 1工业微生物 , 2007, 37 (4) : 23～301
5　孙端方 ,冉雪琴 ,王嘉福 1微生物学报 , 2008, 48 (5) : 58925951
6　张志强 ,田桂莲 ,魏新桂 ,等 1中草药 , 1999, 30 (3) : 179～1811
7　韩丽萍 ,刘演波 ,张强 1解放军军需学学报 , 2003, 19 ( 5 ) : 373
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8　庞欣 ,张光明 ,张瑞萍 ,等 1色谱 , 2004, 22 (2) : 1851
9　雒丽娜 ,董慧茹 ,郑云 ,等 1分析实验室 , 2005, 24 (7) : 80～841
10　吴江 ,卢永昌 ,朱小军 1青海师范大学学报 (自然科学版 ) ,
2006, 28 (3) : 71～731
11　张志强 ,王云山 ,田桂莲 ,等 1药物生物技术 , 2000, 7 ( 3 ) :
157～1601
(上接第 179页 )
纤维残胶率的要求 (残胶率 ≤210% ) ,但是可以通
过再进一步育种处理提高菌株的脱胶能力以及进一
步优化脱胶工艺使脱胶麻纤维含胶率降低 ,为更好
地应用现代生物科技制备高品质麻纤维材料 ,实现
绿色加工创造良好条件。
参 考 文 献
1　杜兆芳 ,曹建飞 ,张强 1苏州大学学报 (工科版 ) , 2008, 28 ( 2 ) :
27～291
2　肖丽 ,王贵学 ,陈国娟 1微生物学通报 , 2004, 31 (5) : 101～1051 3　刘正初 ,彭源德 ,冯湘沅 ,等 1纺织学报 , 2001, 22 (2) : 27～2914　胡国全 ,张辉 ,邓宇 ,等 1中国沼气 , 2003, 21 (4) : 10～1215　钟安华 ,谭远友 ,王成国 1印染助剂 , 2004, 21 (3) : 24～2616　黄俊丽 ,王贵学 1微生物学通报 , 2005, 32 (3) : 62～6717　曾莹 ,钟晓凌 ,夏服宝 1生物技术 , 2003, 13 (5) : 21～2218　韩铭海 ,黄俊 ,余晓斌 1无锡轻工大学学报 , 2004, 23 (6) : 9～1219　林捷 ,郑华 ,石木标 ,等 1微生物学杂志 , 2004, 24 (1) : 5～7110　李市场 ,白爱枝 ,姚建铭 ,等 1激光生物学报 , 2003, 12 (2) : 149～151111　李德舜 ,颜涛 ,宗雪梅 ,等 1山东大学学报 (理学版 ) , 2006, 41(5) : 151～154112　肖丽 ,王贵学 ,陈国娟 1重庆大学学报 , 2004, 27 (6) : 48～501
381
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