全 文 ：吸 阁 蜀 2 0 1 4 (2 )
低能 N+ 离子注入诱变选育云芝高产抗病菌株 的研究
蒋 益 1 郑惠华“ 刘广建 1 全卫丰 1薛 憬 1 季宏更 1 汪 洁 1 `
(1江苏省苏微微生物研究有限公司 , 江苏无锡 2 14 0 6 3 ;2 江苏安惠生物科技有限公司 , 江苏南通 2 2 6 0 0 9 )
摘 要 应用低能 N +离子注人筛选所得高产抗病融合云芝菌株
原生质体进行诱变 , 以获得一株产量更高 ,抗病性更强 , 适用于
栽培的诱变菌株 。 试验确定了低能 N +离子注人的适宜参数 : 注
人剂量为 g xl 酬 ion s/ c耐 ,注人能量 20 K e V ,靶室真空度 10 一3 aP ,
以 5 5 脉冲式注人 ,间隔时间为 巧 S 。 离子注人后 , 筛选醋酶同
工酶酶谱存在显著差异和拮抗实验呈阳性的突变菌株 , 分别以
液体发酵生物量及固体栽培子实体转化率 、对病菌平均抗性水
平为初筛和复筛标准 , 经遗传稳定性实验验证 ,筛选到了一株
云芝高产抗病菌株 ,其子实体产量较对照菌株提高了 1 0 . 3% , 抗
病水平提高了 5% 。 结果表明 :低能 N +离子束注人是一种较为
理想的云芝诱变育种手段 。
关键词 云芝 低能 N + 离子 诱变育种
文章编号 1 0 0 0一 8 3 5 7 ( 2 0 14 ) 0 2 一0 0 1 8一 0 3
云芝 ( oC ir ol 。 : e rs iol o : )又称彩绒革盖菌 、 杂色云芝等 ,
隶属于担子菌亚门 、层菌纲 、 非褶菌 目、 多孔菌科 、 革盖菌属 ,
是一种重要的药用真菌1[] 。 云芝在我国被广泛用于治疗癌症
和免疫缺陷等疾病 2[] 。 目前国内外云芝的品种聊聊可数 ,尤
其缺乏抗病高产 、生物性状优异的云芝菌株 ,且对云芝的研
究多集中在液体发酵 , 多糖 、糖肤等活性成分提取制备及其
对免疫作用机制的研究等方面 ,关于云芝菌株的人工选育研
究报道甚少 ,优良云芝菌株缺乏已成为限制云芝生产和云芝
产业发展的瓶颈 。 因此 ,笔者通过低能 +N 离子注人诱变云芝
原生质体 , 旨在确定 +N 离子注人诱变的适宜参数 , 以获得子
实体产量较高 、 性状优良的云芝新菌株 ,此方法在食用菌人
工诱变育种中尚未见报道 ,它不仅对云芝 , 同时对其它食药
用菌的诱变选育也具有较大的意义 。
1 材料与方法
1
.
1 供试材料
1
.
1
.
1 供试菌株 前期筛选所得优势融合菌株 Y R H l( 经菌
株 SY ZI 和 SY ZS 原生质体融合而成 ,其中高产 出发菌株
SY z l来自中国农科院 ,抗病出发菌株 SY sz 来自东北野生云
芝 ) , P D A优化培养基 4 ℃保存 。
1
.
1 2 培养基 原生质体丙生培养基 :麦芽糖 5 9 ,葡萄糖 10 9 ,
酵母粉 4 9 ,琼脂 5 5 9 , 0 6 m o l几甘露醇溶液 1 00 0 m L , p H 自
然 。 P D A培养基 :马铃薯 20 9 (煮后取汁 ) ,葡萄糖 20 9 ,琼脂
2 0 9
,
M g SO
、
0 5 9
,
K H
Z
p O
、
1 9
,水 1 00 0 m L , p H 自然 。 p D液体
收稿日期 : 2 0 14一 0 1一 1 6
基金项目 : 江苏省科技支撑计划— 农业部分 (项 目编号 :B EZ O 12 3 4 1 ) 。
作者简介 :蒋益 , 主要从事食药用真菌的菌种选育与食药用菌产
品安全检测等方面的工作 。 联系电话 : 1 39 21 29 27 5 。
* 通讯作者。 联系电话 : 0 5 1 0一 8 5 5 15 9 57 。
培养基 : 马铃薯 20 9 (煮后取汁 ) ,葡萄糖 20 9 , M gOS 、 住5 9 ,
K H
Z
OP
、
1 9
,水 1 0 0 m L , p H 自然 。 袋料栽培培养基 :棉子壳
83 %
,教皮 巧% , 蔗糖 1% ,石膏粉 1% 。 水分的含量以用手用
力挤压可挤出 1一 2 滴为宜。
1
.
2 试验方法
1 2
.
1 低能 +N 离子 注入诱变
1 2
.
1
.
1 离召亡人前处理 取O . l m L 云芝原生质体悬液 (10日丫m助
涂布于无菌平皿中央 , 于超净工作台中快速涂匀风干后立即
进行低能 +N 离子注人 。
1 2
.
1 2 低能 +N离子注人 离子注人前 , zL D 一 9 0 型离子注
人机开机预热 Z h , 用紫外线对靶室持续消毒 30 m in , 调节靶
室真空度为 1 0 一 3 P a , 注人物质 +N离子提前加速到 20 eK v , 后
以 2 x l创“ 10 15 (/ C m “ · S )的脉冲率对样品进行剂量分别为 30 、
6 00
、
9 00
、
1 2 0 0
、
1 50 0
、
1 SOO x l O
1 2
i o n s c/ m
Z的注人 。 试验组采
用间歇式脉冲注人 ,连续注人 5 5 后间隔巧 S ,对照组置于靶
室真空中 ,不经离子注人 。
1 2 2 原生质体存活量统计 离子注人后用 1 m L 住6M蔗糖
缓冲液洗脱培养皿内原生质体 ,用涂布棒轻轻将贴壁的原生
质体刮起 ,动作尽量轻柔 ,减少对原生质体的损伤 ,取 0 . 1 m L
洗脱液均匀涂布于原生质体再生培养基上 ,平皿在超净台上
正放静置 10 m in 后将其倒置于 28 ℃恒温培养箱避光培养 。
% h后 ,待原生质体再生形成菌落 ,计数并观察菌落形态 。
对照组做同样处理 。 统计菌落数量 ,绘制云芝原生质体在不
同剂量的 +N 离子注人下的存活率曲线 。
存活率 = 某剂量下离子注人组菌落数 /相应真空对照组
菌落数 xl 0 %
1 2 3 低能 +N 离子 注入对云 芝突 变率的影响 每个剂量下
随机挑取 20 个菌株 ,转接至单独的 P D A 优化培养基上 , 28 ℃
恒温培养箱培养 6 d后 ,取直径 5 m m 打孔菌块 2一 3块 ,接种于
装有 10 0 m L种子液培养基的 30 m L 摇瓶中 , 28 ℃恒温摇床
静置 2 4 h后 , 1 4 0 r/ m i n 旋转培养 s d 。
以 10 % ( V邝 )接种量 , 用无菌移液管转接至装有 10 0 m L
发酵培养基的 3 0 m L摇瓶中 , 28 ℃恒温摇床 140 1五l l i n 旋转培
养 6 d后 , 测定各个菌株生物量 ,对照做相同处理。 定义生物
量高于对照 5% 以上的为正突变 ,低于对照 5% 以上的为负突
变 ,否则为无义突变 ,统计结果并作图 。
1 2井 诱变菌株的 筛选
1 2井 . 1 初筛 挑取菌丝浓密 、 生长健壮的菌落 ,与出发菌株
进行拮抗试验和醋酶同工酶试验 ,观察拮抗试验现象 ,计算
酶谱相似度 T 和联合系数 S 。
酶谱相似度 T 的计算方法为 : T = n x l (/ x l + X Z+ … + x ) ,
2 0 1 4(2 ) 吸 阁 蜀
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掌\排华仲
其中n 为所研究的菌株数 , x 为第 n 个菌株的酶带数 , x l 为 n
个菌株所共有的酶带数 。
联合系数 S的计算方法为 : S = 两个菌株之间共同具有
的酶带数厕菌株所具酶数之和减去共同具有的酶带数 。 以
T < 住9 、 S < 0 . 8 ,且拮抗实验呈显阳性 (表现为隆起型 、 隔离
型 、 沟型 )时认定为发生突变 , 反之舍弃。 将确定发生突变的
菌株进行生长速度试验 ,剔除生长速度小于对照组生长速度
80 %的菌株 。 筛选得到的菌株进行液体发酵试验 , 测定菌丝
体生物量。
1 2 4 2 复筛 抗病性试验依据文献3[] ,供试病原菌与其所
用相同。
子实体栽培实验 : 以 l%接种量将接种袋置与培养室层
架上培养或地面墙式叠放培养 ,控温 27 ℃左右 , 空气相对
湿度 70 % 以下 ,遮光培养 , 约 4 d后 ,观察菌丝萌发情况 ;经
过 30 d 左右培养 , 白色浓密的菌丝长满全袋 ,当袋内有原
基突起时 ,将菌袋放在层架上 ,袋间距离 巧 C m 左右 ,除去
袋 口塑料盖 , 同时在袋上划一个交叉 口 , 方法与栽培木耳
相似 。 亦可在床架上铺一层 6 Cm 左右的沙或沙壤土层 ,然
后将菌袋薄膜除去 , 把菌筒放在沙或沙壤土上 。 菌筒的三
分之一埋在沙内 ,菌筒间距离约 10 C m 。 菌筒排放好后 ,要
求温度 2 5 ~ 2 8℃ , 空气相对湿度 85 % 一90 % , 适当增加漫射光
和通风 ,促使子实体发生 。 子实体发生后 的管理方法与袋
栽灵芝相似 。
每州斑捡菌株重复 50 袋 , 全覆 L栽培和床架袋栽同时i断丁。
试验采收一潮云芝 。 云芝成熟后及时采摘 ,称量鲜重 ,
烘干后后称量干重 。 计算子实体转化率 ,选择子实体转化率
高的菌株作为高产新菌株。
子实体转化率 :( 子实体干重 /培养基干重 ) xl 0 % 。
1 2 5 遗传稳定性试验 将经过上述诱变筛选得到的菌株
连续传代 20 代 ,然后进行栽培试验和抗病试验 ,选择产量稳
定 、 性状无变化的菌株 ,确定为用于生产上的新的云芝抗病
高产新菌株 。
3U U 6 UU 夕UU 1 2 0 0 1 5 0 0 1 8 0 0
N
·离子注人剂量 ( x l o 12 i o n s · e m Z )
不同 +N 离子注入剂量下云芝原生质体的存活率曲线
_
口 突变匆%
. 正突变匆%
r于 l 厂
掌\排例识
3 0 0 6 0 0 9 0 0 1 2 0 0 1 5 0 0 1 8 0 0
注人剂量 ( x l o 12 i o n s · e m Z )
图 2 不同 +N 离子注入剂量对云芝突变率的影响
图1090876543210
2
.
3 诱变菌株的初筛 以 9 0 xl 畔 101 5 c/ 耐为注人剂量对
云芝原生质体进行诱变处理 ,经过平板拮抗试验验及镜检获
得 40 株有明显锁状联合的菌株 ,按 1 2 井 . 1进行筛选 ,得到 30 株
突变菌株 ,部分菌株同工酶酶谱分析结果如图 3 。
测量和计算样品的 fR 值 ,在同一 fR 值处 ,有谱带的条带
记为 1 ,无谱带的记为 。 ,共得到 14 条不同醋酶同工酶条带 ,
单个菌株的酶谱条带为 6一 7 条 。 把醋酶同工酶谱信息处理
为 O , 1数据后 ,计算 T 、 S值 ,得到 T < 住 9 、 S < 0 . 8的 30 株菌株 ,
相应的拮抗试验都表现为阳性 。
2 结果与分析
2
.
1 低能冲离子注入诱变对存活率的影响 不同剂量的 +N
离子注人下云芝原生质体的存活率曲线 , 整体呈现先快速下
降后略微平缓上升再下降的“ 马鞍型 ”变化 : +N 注人剂量小于
9x l0’ 4 10 15 c/ 耐之时 , 云芝原生质体的存活率随着注人剂量的
增大而急速下降至 30 % 以下 ; 而后随着注人剂量的增大 ,存
活率又呈现缓慢上升趋势 ,在剂量为 g xl 畔 iol s/ c耐处达到峰
值 ,此时云芝原生质体的存活率为 3 73 % ;之后随着注人剂
量的增大 , 云芝原生质体存活率下降 ,当剂量达到 1 8xl 少
10 15 c/ 耐之时原生质体存活率降至 20 % 以下 (图 1 ) 。
2
.
2 低能冲离子注入对菌株突变率的影响 图 2显示 ,突变
率与注人剂量之间没有确切的比例关系 , 注人剂量在 6 o ox
l0’ ` 10 15 c/ 耐时 ,菌株突变率最高 。 云芝菌株的正突变率随着
+N离子注人剂量的增大而呈现上升的趋势 ,剂量达到 9 0 x
10
1 4
10 15 c/ 耐之时正突变率达到最大值 18 75 % , 而后又呈下
降趋势 , 因此选定该剂量作为诱变的适宜剂量 。
弃去生长速度小于对照组 80 % 、 菌丝稀疏的菌株 ,得到
25 株菌株 ,将其进行液体发酵试验。 综合菌株的生长速度及
液体发酵生物量 ,初筛共得到 9株优势菌株 ,如表 1所示 , 9株
中较对照菌株生长速度快的菌株有 7株 ,生长速度最快的为
1Y 29
, 达 0 . 82 c m /d ;液体发酵生物量高于对照菌株的有 7株 ,
其中与对照存在显著性差异的有 3株 , Y g l6 、 Y 9 20 和 YI 803
分别较对照提高了 21 . 8% 、 20 % 和 16 井% 。
2
.
4 诱变菌株的复筛 对初筛得到的 9株优势菌株进行复
筛 , 以子实体转化率 (以头潮芝干重计 ) 、 室内抗病率为主要
考察依据 ,从表 2可以看出 ,袋料栽培试验子实体转化率高于
对照菌株的有 6株 ,其中 Y g l6 较对照有显著差异 ,转化率达
24 73 %
,较对照高 10 3% , Y 902 次之 ,较对照高 5井% 。 抗病
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表 1 诱变菌株的生长情况
菌株编号 菌丝生长速度 (/ c m ·川 ) 液体发酵生物量 /( g · 10 m L , )
Y RH I 0 7 4 士 0 0 3b 0 5 5士 0 0 3 b e
Y 3 1 1 0 7 5士 0 0 4 ab 0石0士 0 0 3ab e
Y 3 13 0 7 3士 0 04 b 0石 1士 0 0 6 a b
Y 9 0 2 0名0士 0 0 3 ab 0 5 2士 0 0 2 e
Y 9 16 0 7 9士 0 0 6 ab 0石7士 0 0 7 a
Y 9 2 0 0 7 7士 0 0 2 ab 0石6士 0 0 8 a
Y 12 9 0名2士 0 0 5 a 0石 1士 0 04 ab e
Y 12 10 0 7 4 士 0 0 3b 0 5 2士 0 0 6 t , e
Y 15 18 0 7 9士 0 0 4 ab 0 5 8士 0 02 ab e
Y 18 0 3 0 7 6士 0 0 2 ab 0 64 士 0 04
a
注 :数据为平均值和标准差 ( n 二 3 ) , 同列数据后字母表示在 a 05
显著性水平差异 。
表 2 诱变菌株的复筛试验结果
菌株编号 子实体转化匆% 对青霉菌抗病性/% 对芽泡杆菌抗病性 /%
S、 2 1 2 2 4 0士 0石g b e d / /
S、 2 8 / 89 2 5士 0 5 2 ab 4 7 4 3士0 3 8b
Y3 1 1 2 1 7 2士0 3 1de 8 2乡2 士0石7 d 4 5 4 6士 03 2 e
Y3 13 2 刀6士0 3 1e d 7 3石8士 1 3 2 f 4 3刀5士0石s f
Y9 02 2 3石0士0乡Z ab 88 4 3士 0名4 ab 4 9乡 1士 01 6a
Y9 16 24刀3 士0乡o a 89刀7士0 19 a 4 9名 1士 0乡l a
Y92 0 2 2 5 7士 04 9 b e d 7 9 2 8士 1石o e 4 12 1士 0刀39
Y 12 9 2 3 4 0士 0石3ab e 8 1 92 士0 3 9 d 4 6名8士0 3 4 b
Y 12 10 2 2名3士 0刀6 b e d 8 2刀0士0石4 d 44刀9士 0 2 5d e
Y 15 18 2 05 3 士0石4 e 8 7名4 士0名s b 4 3石1士 04 9e f
Y 18 03 2 3 1 0士 1石6 b e d 84 5 4士0 2 9 e 44刀0士 0 4 1e d
注 :数据为平均值和标准差 , 同列数据后字母表示在 a 05 显著
性水平差异 。
性试验中 ,筛得菌株对青霉菌的抗病性没有显著提高 ,最高
为 Y g l6 ,较对照提高了 住6% ;对芽抱杆菌抗病性有 2株显著
高于对照 , 为 Y 902 和 Y g l6 ,其分别较对照提高 了 5 23 % 和
5 02 %
。 综合三项考察水平 ,确定筛得 Y 902 和 Y gl 6为 2株优
势菌株。
2
.
5 遗传稳定性 将筛得的两株优势菌株进行遗传稳定性
实验 ,结果见表 3 。 由表 3可知 ,传代后菌株 Y 9 02 对青霉菌
抗病性下降幅度较大 ,子实体生物转化率减小 , Y g l6 对青霉
菌及芽抱杆菌抗病性与传代前几近一致 ,子实体生物转化率
变化不大 。 故 Y gl 6 号菌株性状最优 ,确定其为可应用于实
际生产栽培的高产抗病菌株 。
表 3 遗传稳定性试验结果
菌株 对青霉菌抗病性%/ 对芽抱杆菌抗病性%/ 子实体转化率%/
编号 初代 2 0代 初代 2 0代 初代 2 0代
Y g OZ 8 8
.
4 3 87
.
3 0 4 9
.
9 1 4 8
.
0 5 2 3
.
6 0 2 2
.
13
Y g l 6 8 9
.
7 7 8 9
.
3 5 4 9
.
8 1 4 8
.
5 9 2 4
.
7 3 24 石5
3 讨 论
自1 9 86 年中国科学院等离子体物理研究所率先把低能
重离子注人技术应用于水稻诱变育种以来 ,低能重离子注人
技术以其生理损伤小 、 突变谱广 、 突变频率高 ,有一定的重复
性和方向胜的诱变效应等特点 ,其应用范围逐渐拓宽 ,在生
命科学的各个领域逐步显示出了广阔的应用前景阱 ,· 〔习。 至
今 ,离子束诱变技术 、离子束 D N A 大分子转移技术 、离子束辅
助农杆菌遗传转化技术 、 离子束介导超远缘分子杂交技术和
离子束细胞加工技术等已成为具有我国自主知识产权的定
向遗传改良的新方法 、新途径 6[] 。 目前 ,人们已经通过 印c o 一丫
射线 、 紫外线 、 激光 、 射线 、 超声波 、 快中子 、 亚硝酸 、 亚硝酸
肌 、 氮芥 、 硫酸二乙醋等对食用菌进行育种并取得一定的进
展 。 然而低能重离子注人技术在食用菌诱变育种中的应用
研究还较少 。 陈恒雷通过应用加速能量和注人剂量为 巧
eK V 和 1 2 xl 沪 101 5 c/ 耐的低能 +N 束分别对阿魏菇菌丝单细
胞和分生抱子进行辐照处理 ,分别筛选得到了营养缺陷型耐
高温阿魏菇突变株两株和耐高温阿魏菇突变株 1株 7[] 。 付永
前通过低能离子束对阿魏菇多糖生物效应的研究 ,采用 巧
eK v 能量 , 注人剂量为 g xl 畔 iol s/ c耐的低能离子束对阿魏菇
菌丝体细胞进行注人诱变 ,筛选出 1株多糖高产菌株 8[] 。 李颖
颖等以注人能量 20 eK V , 注人剂量 1 25 xl 沪 101 5 c/ 耐的低能
离子束刊新鲜灵芝抱子注人诱变 ,筛得一株灵芝高产菌株 9[] 。
可见 目前利用低能离子注人诱变食药用菌供试材料多
采用菌丝单细胞或抱子 , 由于原生质体致死率高 ,不易控制
离子束注人能量 、 剂量等诱变参数 ,利用原生质体诱变的成
功率往往较低 ,故而尚未见利用原生质体诱变筛选食用菌菌
株的报道 。 笔者采用离子注人云芝原生质体的诱变选育 ,避
免了以往采用杂交育种和紫外诱变育种等手段诱变效率低 、
易导致负突变和遗传性状不稳定的缺点 ,提高了诱变的效率
和正突变的机率 ,结果诱变出一株子实体产量高于原出发菌
株的云芝诱变菌株 ,提高了云芝的产量和抗病性 ,且遗传性
状稳定 。 研究结果表明 ,离子注人技术能够应用于云芝抗病
高产菌株的诱变选育中 ,具有较高的突变率和较宽的突变
谱 ,诱变效果好 ,是一种比较理想的食用菌菌种选育方法 ,且
为其他食药用菌的选育提供了参考 。
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