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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
牡丹 ACC合成酶 ACS1 基因的克隆与原核表达
张超 张玉环 贾培义 董丽
(北京林业大学园林学院 国家花卉工程技术研究中心，北京 100083)
摘 要: 从牡丹‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘Luo Yang Hong’)花瓣中提取总 RNA，根据 GenBank上牡丹 ACC合成
酶基因 PsACS的序列设计引物，通过 RT-PCR获得牡丹 PsACS1 基因序列，包含一个 1 479 bp的开放阅读框，编码 492 个氨
基酸。将 PsACS1 基因 cDNA片段与 pET28a(+)构建原核表达载体 pET-ACS1，转化大肠杆菌 E． coli BL21(DE3)。0. 4 mmol /L
IPTG诱导 3 h后，在预期的蛋白分子量 55 kD 处出现 1 条表达加强的蛋白条带。为进一步目的蛋白的纯化和鉴定提供试验
基础。
关键词: 牡丹 ACC合成酶基因 克隆 原核表达
Cloning and Prokaryotic Expression of ACC Synthase
ACS1 Gene from Tree Peony
Zhang Chao Zhang Yuhuan Jia Peiyi Dong Li
(College of Landscape Architecture，Beijing Forestry University，National Flower Engineering Technology Research Center，Beijing 100083)
Abstract: Total RNA was isolated from the cut flower of tree peony‘Luo Yang Hong’． A pair of specific primers were designed
according to ACC synthase ACS gene sequence of Paeonia suffruticosa recorded in GenBank． A cDNA fragment of PsACS gene inclu-
ding an ORF(1 479 bp)was amplified by RT-PCR，encoding 492 amino acids． The recombinant prokaryotic expression vector pET-
ACS1 was constructed using vector pET-28a(+)and transformed into E． coli DH5α． SDS-PAGE of PET-ACS1 protein induced by 0. 4
mmol /L IPTG for 3 h showed that a strengthened protein band in expectant 55 kD protein marker． These results could provide a founda-
tion for further purifying and identifying objective protein．
Key words: Paeonia suffruticosa ACC synthase gene Cloning Prokaryotic expression
收稿日期:2011-03-22
基金项目:国家自然科学基金项目(30972030)
作者简介:张超，男，硕士研究生，研究方向:观赏植物采后生理;E-mail:zhangchao24804@ gmail． com
通讯作者:董丽，女，教授，博士生导师，研究方向:切花采后生理与技术研究;E-mail:dongleah@ yahoo． com． cn
牡丹(Paeonia suffruticosa)作为中国的传统名
花，在我国具有悠久的栽培历史。它品种多样，花色
丰富，花姿或高贵，或雅致，素有“国色天香”，“花
王”之美称，深受国内外人民的喜爱，因此具有极大
的市场开发潜力。然而，牡丹的自然花期短暂且集
中，采后贮运保鲜技术不过关成为了其切花产业生
产的瓶颈。通过对牡丹切花采后生理及其衰老机理
的研究发现，乙烯在大部分牡丹切花品种衰老过程
中扮演着重要的角色［1 － 3］。研究表明，牡丹切花花
瓣内源乙烯的生成分别受外源乙烯和乙烯抑制剂
1-甲基环丙烯(1-MCP)处理的促进和抑制，ACC 合
成酶(ACS)活性变化与内源乙烯的生成相联系［2］。
ACS是植物乙烯生物合成途径中的限速酶，对内源
乙烯合成起着重要的调控作用［4］。课题组前期已
从牡丹花瓣中分离了 1 个 ACS 基因，命名为
PsACS，并发现 PsACS 的表达受到了乙烯处理的明
显促进和 1-MCP 的有效抑制［5］。以上研究均表明
PsACS基因与牡丹内源乙烯合成密切相关。
本研究拟通过构建牡丹 PsACS1 基因原核表达
载体，获得该基因编码的重组蛋白，为进一步研究
ACS蛋白的特性及其对牡丹切花乙烯生物合成的
调节作用奠定基础。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植物材料、载体和菌株 植物材料为牡丹
‘洛阳红’切花，于 2008 年采自洛阳国际牡丹园，当天
运回实验室，取开花指数 5 级［6］的切花花瓣于液氮中
速冻后 －80℃保存备用。克隆载体 pGEM-T Easy购自
北京天根生化科技有限公司;原核表达载体 pET-28a
(+)为北京林业大学园林学院戴思兰教授惠赠;大肠
杆菌菌株 E． coli DH5α和 BL21(DE3)感受态细胞购自
北京全式金生物技术有限公司。
1. 1. 2 主要试剂 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自北
京天根生化科技有限公司;M-MLV 反转录酶购自
Promega公司;T4 DNA 连接酶、核酸分子量标准、
dNTP以及 Taq DNA聚合酶购自北京全式金生物技
术有限公司;SDS-PAGE电泳所需试剂均购自 Amer-
osco公司;限制性内切酶 Pst I、Sph I、BamH I 和
Hind Ⅲ购自 TaKaRa 公司;其他常规药品均为进口
或国产分析纯试剂。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 RNA的提取及 cDNA第一链合成 采用
CTAB法［7］提取牡丹花瓣总 RNA。反转录反应参照
Promega公司的 M-MLV反转录酶说明书，以提取的
总 RNA 为模板，Oligo(dT)15为引物合成 cDNA 第
一链。
1. 2. 2 RT-PCR 扩增 根据 GenBank 上牡丹 ACC
合成酶基因 PsACS的序列，设计特异性引物:上游引
物 P1 序列为 5-TTGATGGGATTCATGTCCACAGAT-
3，下 游 引 物 P2 序 列 为 5-GATTAAGCTCGAA-
CAAGGGGTGAT-3 。以合成的 cDNA第一链为模板
进行扩增，20 μL 反应体系:10 × buffer(含 Mg2 +)2
μL，dNTP(10 mmol /μL)0. 4 μL，上、下游引物(10
mmol /μL)各 1. 5 μL，cDNA 1 μL，Taq DNA 聚合酶(5
U/μL)0. 2 μL，ddH2O 14. 4 μL。反应程序:94℃预变
性 5 min;94℃变性 1 min，60℃退火 45 s，72℃延伸
2 min，共 35个循环;最后 72℃延伸 10 min。
PCR反应产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后回
收，与 pGEM-T Easy载体连接，转化大肠杆菌 DH5α
感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，经 PCR和 Pst I、
Sph I双酶切鉴定后送北京奥科生物技术有限责任
公司测序，正确的重组质粒命名为 pGEM-ACS1。
1. 2. 3 原核表达载体的构建及诱导表达 根据从
牡丹‘洛阳红’花瓣扩增得到 ACS1 基因 cDNA 序列
及 pET-28a(+)载体上的酶切位点设计特异性引物
P3:5-ATAGGATCCATGGGATTCATGTCCACAGAC-
3(划线部分为 BamH I 酶切位点) ;P4:5-ACTA-
AGCTTTTAAGCTCGAACAAGGGGTGAT-3(划线部
分为 HindⅢ酶切位点)。以重组质粒 pGEM-ACS1
为模板，进行 PCR 扩增:95℃预变性4 min;95℃变
性 1 min，58℃退火 35 s，72℃延伸1 min，共 35 个循
环;72℃延伸 10 min。
PCR反应产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后回
收，然后用 BamH I和 HindⅢ双酶切，回收酶切后小
片段与经 BamH I和 HindⅢ酶切的 pET-28a(+)载
体质粒进行定向连接，得到重组表达质粒 pET-
ACS1，转化大肠杆菌 BL21(DE3)菌株中，菌液 PCR
和质粒酶切确定阳性质粒。
挑取阳性克隆接种于 4 mL含有 50%卡那霉素
的 LB 液体培养基，37℃培养过夜。次日，按 1 /50
比例接种菌液至 5 mL 到含有 50%卡那霉素的 LB
培养基中，37℃条件下培养至 OD600为 0. 6 时，加入
100 mmol /L IPTG 至终浓度为 0. 4 mmol /L，继续在
37℃下培养 3 h。以刚加入 IPTG的时间为 0 h，分别
在 0 和 3 h取样。每次取 1. 5 mL菌液，离心收集菌
体，加入 SDS-PAGE 上样缓冲液煮沸 5 min 以裂解
细胞。室温下，12 000 r /min 离心 30 s，取 10 μL 上
清液进行 SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。
2 结果
2. 1 牡丹 ACS1 基因的克隆与测序
通过 RT-PCR扩增到了一条与预期大小相符的
目的条带(图 1)。重组质粒 pGEM-ACS1 经 Pst I 和
Sph I双酶切鉴定(图 2) ，证实外源基因正确插入的
重组质粒进行质粒测序。测序结果表明，该片段序
列包括一个 1 479 bp 的开放阅读框，编码 492 个氨
基酸，与 GenBank上登录的牡丹 ACS基因(登录号:
DQ337250)对比，核苷酸同源性为 99%，确定所克
隆到的基因片段即为‘洛阳红’牡丹衰老相关的
ACS基因，将该基因命名为 PsACS1。
2. 2 牡丹 ACS1 基因原核表达载体的构建及鉴定
以 pGEM-ACS1测序质粒为模板，用引物 P3和 P4
扩增到一条约 1. 5 kb的片段，目的片段经 BamH I和
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2011 年第 10 期 张超等:牡丹 ACC合成酶 ACS1 基因的克隆与原核表达
M． DNA marker DL2000;1，2． PCR产物
图 1 牡丹 ACS1 基因的 cDNA序列的扩增产物
M． DNA marker DL15000;1 － 3． pGEM-ACS1 /Pst I + Sph I
图 2 重组质粒 pGEM-ACS1 酶切鉴定
HindⅢ双酶切回收后，经 T4连接酶连接插入到经同
样限制性内切酶双酶切的 pET-28a(+)载体上，构
建了原核表达载体 pET-ACS1(图 3)。将其转化大
肠杆菌，进行菌液 PCR 鉴定以及 BamH I 和 HindⅢ
双酶切鉴定，结果分别见图 4 和图 5，说明目的片段
已经正确插入 pET-28a(+)载体中，原核表达载体
构建成功。将构建成功的重组质粒进行测序，测序
结果与前期所获的序列比对，相似性为 100%，说明
该目的片段即为 PsACS1，且目的片段插入方向与读
码框正确。
图 3 原核表达载体 pET-ACS1 的构建
M． DNA marker DL2000;1． 阴性对照;2 － 4． PCR 产物
图 4 原核表达载体 pET-ACS1 的 PCR鉴定
M． DNA marker DL15000;1． pET-ACS1 / BamH I + HindⅢ
图 5 原核表达载体 pET-ACS1 的酶切鉴定
2. 3 牡丹 PsACS1 基因的原核表达
重组表达质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)感受
态细胞，在 37℃，0. 4 mmol /L IPTG 诱导 3 h 后收获
细菌。从 SDS-PAGE分析(图 6)可见，IPTG 诱导后
细菌大量表达一种分子量接近为 55 kD 的新蛋白，
新蛋白与理论上牡丹 ACS分子量一致，说明新蛋白
为所需的目的蛋白。
M．蛋白质分子量标准;1，3． pET-ACS1 诱导 0 h 表达的
蛋白;2，4． pET-ACS1 诱导 3 h表达的蛋白;箭头指示目
的蛋白
图 6 重组质粒 pET-ACS1 在 BL21(DE3)的表达
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
3 讨论
乙烯是植物内源激素之一，ACC 是乙烯合成的
直接底物，ACS 的活性影响植物内源乙烯的合成，
因此其在植物的生长、发育及果实发育等多种生理
过程中起着重要着调节作用。由于 ACS 是一种诱
导酶，在一般组织中含量很低。目前只在拟南芥
(Arabidopsis thaliana)［9］、番茄(Lycopersicon esculen-
tum)［10］以及烟草(Nicotiana tabacum)［11］等物种上
获得了 ACS的重组蛋白。本研究从‘洛阳红’牡丹
品种 5 级切花中克隆了 ACS 基因 cDNA 片段，课题
组前期的工作表明，该基因在牡丹切花的开花衰老
进程中起重要作用。在大肠杆菌中初步实现了
PsACS1 的表达，诱导蛋白的分子量与预测的编码蛋
白的分子量接近，说明克隆的 PsACS1 基因具有完
整的读码框，这也为进一步研究该酶结构和生化特
性奠定了基础。
本研究克隆的牡丹 PsACS1cDNA 片段与 Gen-
Bank中登录的牡丹 ACS基因序列进行比较，结果显
示两者同源性为 99%。同源性未达到 100%的原因
可能是由于试验中用的是普通 Taq DNA 聚合酶，不
是高保真 Taq DNA聚合酶，导致 PCR扩增过程中的
碱基错配。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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