全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
嗜热菌 Lon蛋白酶的逆境应答作用及其功能分析
葛科学 刘晓晴
(首都师范大学生命科学学院,北京 100048)
摘 要: Lon蛋白水解酶广泛存在于微生物以及动植物体内。它除了水解蛋白质的功能以外, 还参与到细胞生理过程
的调节当中。以嗜热栖热菌 HB8(Thermus thermophilus HB8)的 Lon蛋白酶 ( TTLon)及其两个片段 TT lonL和 TT lonS为研究对
象, 采用 RTPCR技术证明了 TTLon在嗜热栖热菌 HB8的逆境应答过程中发挥着重要作用,它的蛋白酶活性是受到 Mg2+影响
的, 失去 C端的 TT lonL和 TT lonS没有了蛋白水解酶活性和分子伴侣活性,但是它们仍然具有一定的 ATP结合能力。
关键词: Lon蛋白酶 逆境应答 ATP依赖型蛋白酶
The Role of Stress Response and FunctionalAnalysis of
the Lon Protease from the Thermophilic Bacteria
GeKexue L iu X iaoqing
(College of Life Sciences, Cap italN ormal University, B eijing 100048)
Abstrac:t Lon proteases present in m icroorg an ism s, as w ell as a w ide range o f plan ts and anim a ls. In addition to the functions of
prote in hydro lysis, they are a lso invo lved in the regulation o f physio log ica l pro cesses in ce lls. Th is study uses the Lon protease ( TTLon)
from Thermus thermophilus HB8 and its two fragm ents TT lonL and TT lonS as the research objects. U sing RTPCR techn ique, w e proved
tha t TTLon play an im po rtant ro le in the process o fTherm us thermophilusHB8 adversity response, and its pro tease ac tiv ity is a ffected by
theM g2+ . The TT lonL and TT lonS wh ich have lost the ir C term ina l have no pro teo lytic activ ity and m o lecular chaperone activ ity, but
they a lso have a certa in ATPbinding capacity.
Key words: Lon protease Stress response ATPdependent pro tease
收稿日期: 20100510
基金项目:国家自然科学基金 ( 30870053 )
作者简介:葛科学,硕士生,研究方向:分子酶学; Ema i:l lingfeng131@ 163. com
通讯作者:刘晓晴,博士,教授,研究方向:分子酶学; Ema i:l liuxq@ m a i.l cnu. edu. cn
Lon蛋白酶是一种 ATP依赖型的多功能性蛋白
水解酶, 与 C lp蛋白水解酶、FtsH 等成员都属于
AAA
+
(ATPase associated w ith various cellular activ i
t ies)大家族的成员。它们都具有相类似的水解机
制:首先通过一定的方式与底物结合,然后通过 ATP
水解供能将底物展开, 再将其运输到水解酶的 口
袋 !之中,在这里肽键被切开。Lon蛋白酶对细胞正
常功能的行使起着重要的作用:首先它能够降解体
内错误折叠的、潜在危害性的以及不稳定的蛋白质,
从而维持细胞内某种特殊蛋白质的动态平衡。 Lon
蛋白对这些蛋白底物的识别是一个重要的生物学过
程,因为蛋白的水解是一个不可逆的过程。至今为
止人们对 Lon蛋白识别底物的分子机制并不是十分
了解,但是已经在大肠杆菌的 Lon蛋白中找到了一
个底物识别 ( SSD )结构域, 并有试验证明其与底物
的识别有一定的联系 [ 1]。现在已经有大量的证据
表明 Lon水解酶活性是受 ATP调控的, 了解其结合
ATP以及受 ATP调节的机制是了解其水解酶机制
的关键;其次 Lon蛋白还参与到多种生理功能的调
节当中,包括 DNA甲基化, DNA复制, 细胞分裂, 荚
膜形成,维持质粒的稳定性等,而且人们还发现许多
调控蛋白都是它的作用底物,包括 SulA、RcsA、CcdA
及 N蛋白质等; 再次 Lon蛋白还与一些革兰氏阴
性致病菌的病原性有关, 这些病原菌通过 TTSS
( type three secretion systems)转运病毒蛋白到宿主
细胞, Lon蛋白就是通过对 TTSS的转录子的调控来
2010年第 11期 葛科学等 :嗜热菌 Lon蛋白酶的逆境应答作用及其功能分析
影响其病原性。除此之外 Lon蛋白酶还具有依赖
ATP的分子伴侣活性, 在合成以及降解蛋白质的过
程中发挥重要作用, 帮助一些蛋白正确的插入到膜
中以及一些蛋白复合体的降解 [ 1 ]。从最初人们在
大肠杆菌中发现 Lon蛋白酶到现在, 人们对其研究
已经取得了一些成果: 它是由相同的亚单位组成的
低聚物,虽然人们还没有得到 Lon蛋白酶整体的晶
体结构,但是其 C端的晶体结构已经证明了 Lon蛋
白酶是一个环形的六聚体,每一个亚单位包含 3个
结构域: N端结构域,可能与底物的识别和结合有一
定的关系; ATP酶结构域, 它包含着 ATP结合区,可
能与多聚磷酸盐和 DNA的结合有关; C端结构域,
包含着由丝氨酸 - 赖氨酸二聚体形成的水解活性
区域 [ 2]。
细胞内数量众多的蛋白质需要在适当的地点、
合适的时间被合成,其数量也受到严格的控制,因此
每种蛋白质都有其寿命, 完成其使命后需要适时地
被清除,即蛋白质的生物合成与降解在细胞内处于
动态平衡。在蛋白质降解的过程中, 一些参与重要
生物功能的调节蛋白的浓度与活性更是受到了精确
的调控,为了避免对细胞内的非目标蛋白质造成致
命损伤, Lon蛋白酶在这一系列的活动中都发挥了
一定的作用,可见其是细胞生命活动中必不可少的
一部分。目前国内外对 Lon蛋白酶的研究一般都是
来源于大肠杆菌,而本研究选用了一种嗜热栖热菌,
Thermus thermophilus HB8, 它的最适生长温度为
70∀ ,其 Lon蛋白酶在 50∀ 仍保持非常稳定的酶活
性 [ 3] ,而热稳定性蛋白质比较适合于 X射线晶体学
分析和核磁共振,为以后的研究奠定了基础。
1 材料与方法
11 材料
111 菌种和质粒 嗜热栖热菌 ( Thermus ther
mophilusHB8), 构建好的含有 TTLon (Thermus ther
mophilus HB8Lon )基因序列的表达载体 ptrchisC
TTLon以及 TTLon蛋白 (均为本实验室保存 ) , 大肠
杆菌 E. col i DH5, 大肠杆菌 E. coli BL21; pGM T
vector试剂盒购自 Promega公司;表达载体 pT rcH isA
购自 Inv itrogen公司。
112 主要试剂 质粒提取试剂盒购自 Omega公
司;限制性内切酶 E coR #、Bg l ∃, LA Taq酶和 T4
DNA连接酶均购于宝生物 (大连 )工程有限公司;
DNA M arker, Prote in M arker, DNA 胶回收试剂盒
SYBR GREEN #荧光染料均购自天根生化 (北京 )
科技有限公司。亲和层析填料 N iNTA Superflow qon
亲和层析柱购自 Q iagen公司; 氯化钙、偶氮酪蛋白
购自 S igma公司。冲洗液 ( 50mmo l /L N aH2 PO4, 300
mmo l/L NaC ,l 20 mmo l/L咪唑, pH 80), 洗脱液 ( 50
mmo l/L NaH2 PO4, 300 mmo l/L NaC,l 500 mmo l/L咪
唑, pH80) , mRNA提取试剂盒, 逆转录试剂盒。
12 逆境条件下嗜热栖热菌 (Thermu s thermophilus
HB8)中 Lon蛋白酶表达量的变化
在 70∀ 下 Thermus thermophilus HB8能够正常
的生长,本试验用 50∀ 和 01 mo l/L H2O 2分别处理
OD600值约为 04的 Thermus thermophilus HB8 4 h
后, 再将其转入正常条件下培养, 每隔 4 h取样, 提
取其总 mRNA后进行逆转录,得到 Lon基因的 cD
NA,通过 RTPCR分析 Lon蛋白的相对表达量。
121 嗜热栖热菌 (Thermus thermophilus HB8)总
RNA的提取 每次取样时收集 15 mL细菌, 6 000
r/m in离心 10m in, 弃上清。用 50 L PBS充分悬浮
菌体并转移至预冷的研钵中, 加液氮研磨成粉末。
加入 400 L细胞裂解液,吹打后转入 15 mL的离
心管中。再加入 150 L的中和液,涡旋震荡 15 s,
12 000 r/m in离心 5 m in。取上清至新的离心管中,
加入 250 L的异丙醇, 混合均匀。然后将其加入到
吸附柱中,离心 1m in,弃滤液。加入 500 L的洗涤
液, 离心 1 m in去滤液。加入 700 L的去盐液, 离
心 1m in去滤液。将吸附柱空甩 2 m in,向其中央加
入 70 L RNA asefree水,室温静置 1m in, 1 2000 r /
m in离心 1m in,洗脱得到 RNA。
122 cDNA的获得 在没有核酸酶污染的试管
中依次加入以下组分: RNA 2 L, oligo ( dT ) 18 primer
1 L, DEPCtreated w ater 9 L, 5 % reaction buffer 4
L, RNase Inh ib itor 1 L, 10mmo l/L dNTP m ix 2 L,
Reverse Transcriptase 1 L,轻轻混匀后 42∀ 孵育 60
m in。而后将其放入 75∀ 加热 5 m in结束反应。
123 RTPCR技术检测 Lon蛋白酶相对表达量 在
02mL的离心管中构建以下体系: cDNA 2 L, 25 %
ReaMl asterM ix 10 L, Lon上游引物 1 L, Lon下游引物
1 L, ddH 2O 11 L。设计 PCR参数为 95∀ 预变性
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1m in; 95∀ 变性 20 s; 60∀ 退火 1 m in; 72 ∀ 延伸
1m in; 30个循环, 由软件分析 Lon蛋白的相对表
达量。
13 K +、Ca2+、Na+、Mg2+和 Fe2+对 Lon蛋白酶活
性的影响
采用偶氮酪蛋白法测定各种离子对 Lon蛋白酶
活性的影响。在不加金属离子的情况下,取 05mL
偶氮酪蛋白溶液 ( 02%偶氮酪蛋白溶于 01 mo l /L
磷酸钾缓冲液中, pH80)与 Lon蛋白 (终浓度为
016mg /mL)混匀, 50∀ 孵育 1 h后加入 02 mL
10%三氯乙酸终止反应,离心取上清液于 340 nm处
测定光吸收值,然后用同样的方法加入相对应的离
子后测定其吸光值变化情况。
14 TT lonL和 TTlonS目的蛋白的获得
141 TT lonL和 TT lonS基因片段的克隆及回收
根据目的基因的序列, 设计相同的上游引物 5&CA
GATCTGCATGAAGGACTTTCTGCG3&, 下游引物 1
5&TGAATTCTCATTCGCGGAGCTCCTC3&和下游引
物 2 5&GCGAATTCTCACGTGGTGATGAAGA3&, 目
的片段大小分别为 768 bp和 1 425 bp。在引物 5&端
分别引入限制性内切酶 Bgl ∃和 E coR I的酶切位
点 (下划线部分 )。在 25 L PCR反应体系中, 依次
加入 25 L 10 % LA PCR buffer(M g2+ plus) , 2 L
dNTP m ix ture (各 25 mmo l/L ), 1 L ptrch isC
TTLon,上下游引物 ( 10 mo l/L )各 05 L, LA Taq
酶 1 L, 175 L ddH 2O。 PCR反应程序: 94∀ 预变
性 3 m in; 94∀ 变性 30 s; 61∀ 退火 30 s; 72∀ 延伸 2
m in; 30个循环; 72∀ 延伸 10 m in, 使扩增产物完整。
反应产物与 5 L 6 % load ing bu ffer混合上样,进行
1%琼脂糖凝胶电泳, 切胶回收目的片段。
142 目的片段与 pGM T载体连接 取回收好的
目的片段 7 L, pGM T载体 1 L, 10 % L igase buffer
1 L, T4 L igase 1 L混匀, 16∀ 连接。将连接产物采
用热激法转化大肠杆菌 E. coli DH5,进行蓝白斑筛
选,阳性质粒进行 Bgl ∃ /E coR I双酶切鉴定, 并回
收切下的目的片段。
143 融合蛋白表达载体的构建 将回收的目的
基因片段连接至经同样酶切处理并回收的表达载体
pTrcH isA上, 构建重组表达质粒 pTrcH isAlonL及
pTrcH isAlonS,转入大肠杆菌 BL21。阳性单克隆进
行测序鉴定。
144 目的蛋白表达和纯化 将双酶切验证正确
的转化菌接种至含 100 g /mL氨苄青霉素的 LB培
养液中, 37∀ 振荡培养过夜,再以 5%的量转接到 200
mL新鲜 LB培养液中,继续培养至 OD600为 04- 06
时, 加入异丙基 ( D硫代半乳糖苷 ( IPTG )至终浓
度 1 mmo l/L, 在 37∀ 诱导培养 4 h后, 离心收集菌
体。每克菌体加入 4mL裂解液悬浮。加入溶菌酶
(终浓度为 1mg /mL) ,放置冰浴中 60m in充分酶解
后再用超声波破碎细胞。 12 000 r /m in 4 ∀ 离心
30m in,收集上清液。按照每 4 mL上清液与 1mL
N iNTA胶比例, 4∀ 充分混合 60 m in。将上述混合
液装入准备好的层析柱,加入冲洗液,冲洗 2次。然
后加入洗脱液, 收集流过的液体, 即获得目的蛋白
TTLon L和 TTLon S。取 10 L蛋白洗脱液与 2 L
6 % SDS样品缓冲液混匀, 进行 SDS-聚丙烯酰胺凝
胶电泳,考马斯亮蓝 R250染色分析。
15 TT lonL和 TT lonS蛋白水解酶活性
偶氮酪蛋白为底物测定其蛋白酶活性。取 05
mL 02%偶氮酪蛋白溶液分别与 TT lonL和 TT lonS
蛋白溶液 (终浓度为 016mg /mL)混匀, 50∀ 孵育 1
h后加入 02 mL 10%三氯乙酸终止反应, 离心取上
清液于 340 nm处测定光吸收值变化。
16 TT lonL和 TT lonS蛋白与 ATP的结合
采用荧光分光光度法测定目的蛋白与 ATP的
结合。在盛有 25mL pH75磷酸钾缓冲液的比色
皿中分别加入 TT lonL和 TT lonS蛋白, 室温条件下,
285 nm处激发, 测定 340 nm处荧光强度。随后逐
步加入 ATP贮液,同样波长下测定相对荧光强度的
改变,直至随着 ATP浓度的增加, 荧光强度基本不
变为止。以 ATP浓度为横坐标,以相对荧光强度为
纵坐标作图,并计算出结合常数 Kb。
17 TT lonL和 TT lonS蛋白的分子伴侣活性
采用将绿色荧光蛋白 ( GFP)变性, 再利用待测
蛋白将其复性的方法, 来测定其分子伴侣的活性。
首先用终浓度为 66 mmo l/L的 HC l处理 GFP使其
变性,然后调节溶液 pH恢复至 70, 再加入待测蛋
白、ATP 和 MgC l2终浓度分别为 1 mmol /L、75
mmo l/L, 50∀ 水浴中温浴 55 s使其复性。用荧光分
光光度法测定其变性前后和复性后的相对荧光强度
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2010年第 11期 葛科学等 :嗜热菌 Lon蛋白酶的逆境应答作用及其功能分析
变化。激发光波长 488 nm,在恒温 50∀ ,记录不同
条件下 510 nm处相对荧光强度。
2 结果与分析
21 逆境条件下 Lon蛋白酶表达量的变化
经过低温 ( 50∀ )和 H 2O2刺激之后 4 h, Lon蛋
白表达量明显的提高, 它们分别是正常条件下表达
量的 45倍和 31倍。而将它们放回适宜的生长条
件后,菌体进入了其恢复期,随着菌体的增殖 Lon蛋
白的相对表达量虽然在不断的增加, 但是它们的差
距却在不断的减小 (图 1)。通过以上结果,可以初
步推断 lon蛋白酶在 Thermus thermophilusHB8的逆
境应答过程中发挥着重要作用,当菌体度过危险期
后 Lon蛋白的表达量也恢复到了正常。
A
B
图 1 ( A)不同条件下 Lon蛋白的相对表达量
( RTPCR结果 ) ( B)不同条件下 Lon蛋
白的相对表达量
22 K+、Ca2+、Na+、Mg2+和 Fe2+对 lon蛋白酶活
性的影响
以偶氮酪蛋白为底物测定金属离子对 lon蛋白
酶活性的影响,发现反应体系中加入 K +、Ca2+、N a+
及 Fe2+离子后 Lon蛋白酶的活性并没有受到影响,
吸光值变化微弱,而加入 Mg2+后 Lon蛋白酶活性有
了明显的提高, 大约是空白试验的 15倍 (图 2 ),
M g
2+对 Lon蛋白酶水解酶活性能起到很大的促进
作用。而图 3所示当 Mg2+的浓度小于 0001 mo l/L
时, 对 lon蛋白酶的活性影响不大, 当浓度达到
0001 mo l/L时, lon蛋白酶的活力有了很明显的提
高, 随着 M g2 +浓度的提高而逐渐趋于稳定, 它对
Lon蛋白酶水解酶活性的促进是有一定的限
度的。
图 2 离子对 TTLon蛋白酶活性的影响
图 3 M g2+对 TTLon蛋白酶活性的影响
23 基因克隆及表达载体的构建
利用 ptrch isCTTLon为模板进行 PCR, 目的条
带大小分别为 768 bp和 1 425 bp,结果如图 4所示,
在相应的位置出现了目的条带。然后将 PCR产物
回收与 pGM T连接扩增,经 Bg l∃和 E coR I双酶切
鉴定后可以看到两条明显条带, 分子量较大的为
3 015 bp,为 pGM T载体, 而分子量较小的为目的片
段 (图 5)。将目的片段回收再与表达载体 pTrcH isA
连接,测序证实重组表达质粒构建成功。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
M. DNA m arker; 1. TTLonS PCR产物; 2. TTLonL PCR产物
图 4 PCR结果
M. DNA m arker; 1. pGMTtt lonS双酶切结果;
2. pGMTtt lonL双酶切结果
图 5 重组质粒 pGMTttlonS和
pGMTttlonL的双酶切
24 基因表达产物的 SDSPAGE分析
用构建好的重组质粒转化 E. coli BL21, 并加入
IPTG进行诱导表达, 表达产物经过亲和层析纯化
后,进行 SDSPAGE分析, 预测 TT lonL和 TT lonS的
分子量分别为 51 kD和 27 kD,由图 6可见已经成功
的得到目的蛋白质条带。
25 TT lonL和 TTlonS蛋白水解酶活性
TTLon蛋白具有依赖 ATP的蛋白水解酶活性,
而去除 C端的 TT lonL和 TT lonS是否还具有水解酶
活性, 通过试验发现这两个蛋白与偶氮酪蛋白混合
温浴之后并不能使其吸光值发生变化, 可以判定这
两个片段都已经失去了酶活,不能再水解蛋白质底
物。这又进一步证明了 TTLon蛋白 C端结构域是
M.蛋白分子量 m aker; 1, 4.诱导前; 2, 5.诱导后; 3, 6.目的蛋白
图 6 重组表达的目的蛋白的 SDSPAGE分析
其发挥水解功能所不可缺少的。
26 TT lonL和 TT lonS蛋白与 ATP的结合
Lon蛋白酶是依赖 ATP的, Lon蛋白与 ATP结
合的结合常数 Kb为 2328mo l/L[ 3]。为了解失去 N
端结构域的 TT lonL和 TT lonS蛋白是否还有 ATP结
合能力,仍然以荧光分光光度法测定其与 ATP的结
合,结果如图 7。随着 ATP浓度的增大,荧光强度刚
开始急剧下降,随后下降速度减慢,直至荧光强度不
再变化。通过计算得出 TTlonL和 TT lonS与 ATP结
合的结合常数 Kb为 512 mo l/L和 200 mol/L。
虽然仍具有结合 ATP的能力, 但是结合能力在不断
的减小。
A
B
图 7 (A )ATP与 TT lonL1- 1425蛋白的
结合能力的测定 ( B) ATP与 TT
lonS1- 768蛋白的结合能力的测定
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2010年第 11期 葛科学等 :嗜热菌 Lon蛋白酶的逆境应答作用及其功能分析
27 TT lonL和 TTlonS蛋白酶分子伴侣活性
采用 GFP变性后利用分子伴侣使其复性的方
法测定出 TTLon蛋白酶具有依赖 ATP的分子伴侣
活性。本试验仍然采用这种方法测定 TT lonL和
TT lonS蛋白的分子伴侣活性。结果显示, 这两个片
段都失去了此活性, 就此可以初步推断结构的完
整性是 Lon蛋白行使分子伴侣活性必不可少的。
3 讨论
蛋白被氧化可能是对细胞伤害最严重的形式之
一,它们在细胞内能够发生聚集, 引起蛋白功能失
活,有时也会引入一些有害修饰,导致细胞死亡。在
细胞当中,有许多调节蛋白质, 能够将对细胞的氧化
损伤降低到最小程度, 而当外界环境比较适合细胞
生长时,这些调节蛋白就不再发挥作用。Lon蛋白
酶的表达量的相对增加可能跟降解这些调节蛋白有
一定的关系,它能够水解这些非必需的调节蛋白,得
到的氨基酸可以被重新利用来合成重要蛋白质,或
直接参与代谢以提供能量。
使这些调节蛋白维持在一个动态平衡的水平。
可以推测 Lon蛋白酶可能是一种应急保护性蛋白
酶,它的减少能大大增加体内蛋白被破坏的机率,甚
至能引起某些疾病或者死亡。
ATP水解供能是 Lon蛋白酶行使其功能所必不
可少的。ATP在水解供能时,需要激酶将能量转移
到底物上,而镁离子在激酶行使功能的过程中是必
不可少的。Mg2+可能就是通过影响了 ATP的水解
来影响 Lon蛋白酶水解酶活性的。可见, Lon蛋白
酶是一种受 ATP调控的蛋白水解酶。研究其与
ATP结合的机制,是进一步了解 Lon蛋白酶水解机
制的关键。
目前,人们对大肠杆菌的 Lon蛋白酶了解较
多, 其 N端和 C端都已成功结晶,并对其行使功能
的机制提出了很多假说, 但是都没有足够的证据
证明其理论的正确性。至今, Lon蛋白酶整体结构
还没有结晶出来, 对 Lon蛋白酶的功能机制的研
究还不是十分清楚, 例如, 其和底物的结合区域,
对底物的识别机制等都有待于进一步的研究。
参 考 文 献
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