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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
群体感应信号分子及其抑制剂快速检测方法的建立
储卫华1 刘永旺2 朱卫1
(1中国药科大学生命科学与技术学院，南京 210009;2南京农业大学动物医学院，南京 210095)
摘 要: 细菌能自发产生、释放一些特定的信号分子，并能感知其浓度变化，调节微生物的群体行为，这一调控系统称
为群体感应。细菌群体感应参与包括人类、动植物病原菌致病力在内的多种生物学功能的调节，群体感应抑制剂成为抗感染
药物开发的靶点。利用紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)作为指示菌，建立检
测高丝氨酸内酯(AHLs)及其抑制剂的简便方法。结果表明，通过平板交叉划线接种，使用指示菌能够有效地检测 AHLs，并且
通过薄层层析(TLC)与细菌生物感应器相结合的方法可以快速、方便地鉴定 AHLs 的种类;通过双层平板法观察指示菌色素
产生情况，能够有效地检测群体感应信号分子 AHLs抑制剂，且该方法简单易行。
关键词: 群体感应 N-酰基-高丝氨酸内酯 群体感应抑制剂 检测
Rapid Detection of Quorum Sensing Signal Molecules N-acyl-
homoserine Lactones and Its Inhibitors
Chu Weihua1 Liu Yongwang2 Zhu Wei1
(1School of Life Science ＆ Technology，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009;
2College of Veterinary Medicine，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095)
Abstract: Quorum sensing(QS)is a mechanism by which diverse microorganisms can control specific processes in response to
population density． A relatively well-known form of QS among proteobacteria involves production and subsequent response to N-acylated
homoserine lactones(AHLs)． Quorum sensing inhibition(QSI) ，targeting AHL-dependent signaling，has been developed as a target for
anti-infection drug． In order to detect AHL and it’s inhibitors，a convenient and sensitive bioassay was developed based on the produc-
tion of pigments by Chromobacterium violaceum and Agrobacterium tumefaciens． Using cross-feeding assay and TLC methods，we can de-
tect and identify AHLs． We also developed a simple soft agar overlay protocol，based on pigmentation inhibition，to rapidly screen for the
presence of potential QSI by bacteria and plants． This new method is simple，inexpensive and easy to application for the detection of
AHLs and QSI．
Key words: Quorum sensing N-acylhomoserine lactonase Quorum sensing inhibitor Detection
收稿日期:2010-08-09
基金项目:江苏省自然科学基金项目(BK2009691)
作者简介:储卫华，男，博士，副教授，研究方向:微生物与免疫学，生物工程;E-mail:chuweihua2002@ yahoo． com． cn
长期以来，人们一直认为细菌是以单纯的单个
细胞的生存方式存在于环境中。直到 20 世纪 70 年
代，科学家在研究费氏弧菌(Vibro fischeri)时发现在
低浓度时费氏弧菌不产生荧光，但在高密度时能够
产生荧光［1］。20 世纪 90 年代以来，科学研究证实
了在革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌中存在着信
息交流，把这种交流形象地称为群体感应(quorum
sensing，QS)［2］。这种交流是当细菌达到临界生长
密度时通过相互交换一种自动诱导物(autoinducer)
的信号分子来实现的，受细菌群体感应调节系统的
控制。现在已发现细菌许多生理功能都受此系统的
调节，包括抗生素的合成，质粒的转移，植物、动物和
人类病原菌的致病因子的产生，细菌发光，以及生物
膜的形成等［3］。研究细菌与细菌之间的信息交流
已成为微生物研究的新热点。同时，细菌群体感应
作为替代抗生素的抗菌药物靶点越来越被重视［4］。
细菌产生的群体感应信号分子主要有［5］:革兰
氏阴性菌产生具有不同酰基侧链的高丝氨酸内酯
2011 年第 3 期 储卫华等:群体感应信号分子及其抑制剂快速检测方法的建立
(N-acyl-homoserine lactonase，AHLs) ;革兰氏阳性菌
产生一些小肽(autoinducer peptide)作为信号分子来
感知种内自身种数量，协调多种基因的表达;还有一
类信号分子———一种呋喃硼酸二聚酯，即自体诱导
子-2(autoinducer-2，简称 AI-2) ，它在革兰氏阴性菌
和阳性菌中均存在，被用来感知种间细菌数量调控
细菌自身行为。如何快速、准确地检测细菌是否产
生群体感应信号分子，以及产生的种类是研究细菌群
体感应与病原菌致病因子产生、生物膜形成、抗生素
的产生等的基础，而群体感应信号分子抑制剂(quo-
rum sensing inhibitor，QSI)的筛选为替代抗生素药物
的开发提供一个有效的途径。本研究拟通过指示菌
建立一种快速检测细菌 AHLs及其抑制物的方法。
1 材料和方法
1． 1 菌株与培养条件
供试菌株、质粒，见表 1。Agrobacterium tumfa-
ciens A136(pCF218 /pCF372) ，含有 PtraI-lacZ 融合
基因和 traR 基因。本身不产生高丝氨酸内酯
(AHLs) ，但仍含有产色素基因，当有外源的 AHLs
存在时 lacZ基因大量表达，水解 X-gal等底物，使得
产色素基因表达而产生色素，A136 对酰基侧链长度
为 C6 － C14的 AHLs不同程度地敏感。A． tumefaciens
表 1 供试菌株及来源
菌株 特性 来源
Agrobacterium tumfa-
ciens A136
traI-lacZ fusion
(pCF218) (pCF372)
［6］
A． tumefaciens KYC6
3-oxo-C8 HSL
overproducer
［6］
Chromobacterium vio-
laceum CV026
mini Tn5 mutant
of 31532
［7］
C． violaceum
ATCC 31532
non-pigmented，C6
HSL production
ATCC
C． violaceum
ATCC 12472
type strain ATCC
Pseudomonas aerugi-
nosa PAO1
C4 and 3-oxo-C12
HSL production
本研究室保存
Aeromonas
hydrophila YJ-1
C4 and C6
HSL production
本研究室保存
Bacillus sp．
AHL lactonase
production
本研究室保存
ATCC． American Type Culture Collection
KYC6(pCF218) ，过量表达 3-oxo-C8-HSL信号分子，
用作报告菌株 A136 的阳性对照。Chromobacterium
violaceum CV026 系 C． violaceum ATCC31532 的 mini-
Tn5 突变体，本身不产生 AHLs，也不产生紫色，当外
源 AHLs存在时能产生紫色色素，对酰基侧链长度
为 C4 － C6 的 AHLs 不同程度地敏感。C． violaceum
ATCC31532 不产生紫色，但产生 C6-HSL，作为报告
菌株 CV026 的阳性对照。
所使用的抗生素浓度分别为 A136 所用壮观霉
素(Sp)50 μg /mL、四环素(Tc)4． 5 μg /mL，KYC6 用
四环素(Tc)4． 5 μg /mL，CV026 用卡那霉素(Km)为
20 μg /mL，所有菌株均在 LB 培养基中 30℃摇床
培养。
1． 2 试剂和设备
壮观霉素、四环素、卡那霉素、C4-HSL、C6-HSL
和 X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷)等均购自
Sigma公司(美国) ;Si-C18F反相薄层层析板 JT Baker
#7013-04(Capitol Scientific，Inc．，Austin，USA)。
1． 3 AHLs粗提液的制备
待测菌 37℃ 过夜培养至一定的密度，5 000
r /min离心，取上清，加入 3 倍体积的酸化乙酸乙酯
(含 0． 1%的甲酸) ，混匀，静置，取上层，反复 3 次，
合并提取液至旋转蒸发仪蒸干溶剂，溶于一定量的
乙酸乙酯中，－ 20℃保存备用。
1． 4 平板交叉划线接种(cross-feeding assay)检测
AHLs
将高丝氨酸内酯报告菌在相应培养基上活化
后，将报告菌与待检菌以“T”字型划线接种于 LB 平
板上(图 1)。以 A． tumefaciens A136 为作为报告菌
时，在 LB平板表面涂布 50 μL的 20 mg /mL X-gal。
1． 5 薄层层析(TLC)检测鉴定 AHLs
根据文献［8］方法进行薄层层析，将乙酸乙酯
提取物 2 － 5 μL点样于 C18 反相薄层板上，每个样
品相距 2 cm，以甲醇 /水(60∶ 40，V /V)为流动相，使
样品充分展开后，通风厨中吹干，将过夜培养的 50
mL报告菌菌液与 100 mL含 1． 0%琼脂 50℃保温的
LB培养基混合后，立即铺于 TLC 板上，凝固后置于
消毒的密闭容器中 28℃培养 24 － 48 h(图 1)。采
用 A． tumefaciens A136 为作为报告菌时，需加入 500
μL的 20 mg /mL X-gal。
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图 1 平板交叉划线法和薄层层析法
检测 AHLs过程示意图
1． 6 AHLs抑制剂的检测
检测 AHLs降解酶产生菌时，先将待检样品进
行增菌，然后获得单菌落，将获得的单菌落划线接
种于 LB 平板中央，一定的温度下培养，再将含指
示菌 C． violaceum ATCC 12472 的半固体培养基平
铺于该平板上，过夜培养，观察色素产生情况。检
测植物或植物提取物或者化合物时，则将植物(本
试验用干燥穿心莲叶)置于 LB 平板表面，或将新华
滤纸浸泡提取物或化合物的溶液中，吹干，获得含有
提取物或化合物的纸片，将纸片贴于 LB 平板上，并
在其上铺含有指示菌的半固体培养基，观察色素产
生情况。
2 结果
2． 1 平板交叉划线接种法检测 AHLs
以 C． violaceum CV026 和 A． tumefaciens A136 报
告菌，利用平板交叉划线法能够有效地检测细菌产
生 AHLs。C． violaceum CV026 主要能够检测短链的
AHLs，嗜水气单胞菌能够产生 C4 和 C6-AHLs，所以
在靠近 Ah YJ-1 的地方 C． violaceumCV026 受到
AHLs的诱导产生紫色色素。同样，以 A． tumefaciens
A136 为报告菌，由于铜绿假单胞菌 PAO1 和 A． tu-
mefaciens能够产生长链的 AHLs，所以 A． tumefaciens
A136 能产生绿色的色素(图 2)。
图 2 利用紫色色杆菌 CV026 和根癌农杆菌 A136
平行交叉划线法检测 AHLs信号分子
2． 2 薄层层析分离鉴定 AHLs
由于酰基侧链不同，不同大小的 AHLs 在以甲
醇 /水(60∶ 40，V /V)为流动相时，分子量小的在最前
端，分子量大的运动速度慢在最下端，当铺上报告菌
后，由于 AHLs的存在，在 AHLs周围由于受之诱导，
指示菌就会产生色素。运用 AHLs标准分子作为对
照可以鉴定出 AHLs的种类(图 3)。
图 3 薄层层析法与指示菌结合分析 AHLs
2． 3 AHLs抑制剂的检测
AHLs抑制物能够抑制 AHLs的活性，使得指示
菌不能够产生群体感应信号分子，从而抑制指示菌
色素的产生。图 4-A为本实验室分离的一株能够产
生 AHL降解酶的芽胞菌，含有 aii基因，因此在双层
平板上，C． violaceum ATCC 12472 不能够产生紫色
色素。图 4-B是穿心莲叶置于平板上，能够抑制 C．
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violaceum ATCC 12472 紫色色素的产生，说明该树叶
中含有 AHLs抑制成分。
图 4 AHLs抑制剂产生菌及抑制物的筛选
3 讨论
本试验基于群体感应信号分子能够诱导细菌生
物感应器紫色色杆菌或者农杆菌产生紫色的原理，
建立了平板交叉划线法以及 TLC 法检测 AHL 类似
物的方法，并将双层平板法用于可能产生群体感应
信号分子抑制物的微生物，甚至是植物样品的初步
筛选。一些基于 luxI / luxR QS系统的微生物传感菌
可以检测含 4 － 14 个碳原子酰基侧链的 AHLs，其中
最常用的是 McClean等［7］采用转座子插入突变法破
坏紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)AHLs 合
成酶基因 cviI和紫色色杆菌素合成抑制基因而构建
的紫色色杆菌突变株 CV026。在含有外源的 AHLs
培养基中培养 CV026 时，紫色色杆菌素可迅速产
生。该传感菌主要检测短链 AHLs，对 C6-AHL最敏
感。而 TraI /R QS 系统位于根癌农杆菌的 Ti-质粒
上，其 QS 系统的信号分子主要为 C8-3-oxo-AHL。
根癌农杆菌 NT1(pZLR4)是去掉 Ti 质粒的 NT1 菌
株，携带含有 traR和 traG∶ ∶ LacZ 融合基因的重组质
粒 pZLR4［9］。traG的转录受 traI /R AHL QS 系统调
控。它可以检测含有 3 羰基取代基 4 － 12 碳原子酰
基侧链的 AHLs和除 C4-AHL 之外的所有 3 位碳上
无取代基的 AHLs。另外，该传感菌还可以用来检测
3-羟基 AHLs，尤其是 C6-3-hydroxy-AHL、C8-3-hy-
droxy-AHL和 C10-3-hydroxy-AHL。结合紫色色杆菌
与农杆菌能够有效地检测出待测菌是否产生群体感
应信号分子，该方法简单易行，不需要特殊的设备，
一般过夜培养即可得出结果。
群体感应抑制已成为微生物领域研究的一个热
点。群体感应抑制剂能使致病性病原菌中由 QS 系
统所调控的生理特性不表达或者表达水平下降。因
此，QS系统作为新型的抗生素靶点，越来越受到人
们的重视。人们试图通过研究这些信号分子的降解
途径来干扰其 QS 系统，达到控制感染的目的。本
试验利用 AHL报告菌株紫色色杆菌产生紫色色素
的原理，建立了检测群体感应抑制剂的平板法。此
方法可用于筛选产生 QSI 化合物的微生物，甚至是
植物样品的初步筛选。由于很多微生物及中药能够
产生抗菌物质，利用平板法进行检测时，对报告菌的
生长产生抑制作用，导致假阳性结果。因此，利用此
方法检测 QSI时，需仔细观察待检菌或待检植物周
围是否有报告菌生长，若没有生长则该菌或植物产
生抑菌物质，对于植物，需进行提取，测定 MIC，然后
用低于 MIC的浓度来测定是否产生 QSI。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)
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