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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
人 Cε3-Cε4 基因克隆、表达及纯化复性
刘中成1 时海浪1 张艳芬2 赵丽君1 王培莹1 常斌1 李雨诗1
(1河北省药物质量分析控制重点实验室，保定 071002;2河北大学实验室管理办公室，保定 071002)
摘 要: 利用 RT-PCR技术从变态反应疾病患者外周血淋巴细胞中克隆出人 Cε3-Cε4 基因，将其克隆至原核表达载体
pET-17b中，转化大肠杆菌并进行诱导表达，SDS-PAGE后 Cε3-Cε4 蛋白表达量占细菌总蛋白的 30. 7%。菌体经裂解、2 mol /L
尿素洗涤后，绝大部分杂蛋白被去除，目的蛋白纯度达 85. 5%。用 8 mol /L尿素溶解包涵体，经 Ni-NTA柱对变性状态下的目
的蛋白进行纯化，并利用降低尿素梯度的方法对纯化的蛋白进行复性，最终目的蛋白纯度为 95. 3%。Western blotting方法对
Cε3-Cε4 蛋白进行鉴定，为该蛋白的进一步相关研究奠定基础。
关键词: Cε3-Cε4 表达 柱上复性
Expression，Cloning and Refolding of Human Cε3-Cε4 Genes
Liu Zhongcheng1 Shi Hailang1 Zhang Yanfen2 Zhao Lijun1 Wang Peiying1 Chang Bin1 Li Yushi1
(1Key Laboratory for Drug Quality Control and Analysis of Hebei Province，Baoding 071002;
2Laboratory Management Office of Hebei University，Baoding 071002)
Abstract: IgE targeting with a high affinity receptor FcεRI is a key step in I-type allergy． IgE /FcεRI signaling pathway was an
important target for drug design which has been a research focus of treatment the allergic disease currently． The gene coding human IgE
Cε3-Cε4(H34)was cloned and plugged in an expression vector pET17b-H34． The target protein was expressed as inclusion body in E．
coli BL21． The amount of Cε3-Cε4 expression reached at 30. 7% in total bacterial proteins through SDS-PAGE． Most of the impurity
were eliminated after 2 mol /L urea washing the inclusion body，and the purity rate of target protein exceeded 85. 5% ． The denatured H34
was dissolved in 8 mol /L urea，then purified and refolded in lower urea gradient method on Ni-NTA column． The final purity rate of target
protein was 95. 3% ． The Cε3-Cε4 protein was confirmed by Western blotting which will be a basis for further studies of the protein．
Key words: Cε3-Cε4 Expression On-column Refolding
收稿日期:2011-07-22
基金项目:河北省自然科学基金资助项目(C2010000248) ，河北大学大学生科技创新项目(2011089) ，河北大学引进人才项目(2008-140)
作者简介:刘中成，男，博士，副教授，研究方向:变态反应性疾病病理学;E-mail:liuzc@ hbu． edu． cn
IgE在变态反应中的作用已获得公认，阻止 IgE
分子与效应细胞表面高亲和力受体 FcεRI结合已经
成为抗变态反应性疾病治疗的研究热点。目前，已
相继开发了抗 IgE 抗体、抗受体抗体、IgE 分子类似
多肽、受体类似物以及依据抗 IgE 抗体效应部位设
计的多肽等抑制性小分子以及以 IgE 为基础设计的
疫苗，它们均显示了潜在的治疗变态反应性疾病的
能力［1，2］。其中，2003 年 6 月上市重组人源化抗人
IgE单克隆抗体 Omalizumab(商品名:Xolair) ，为Ⅰ
型变态反应性疾病的治疗带来了光明［3］。大量研
究表明，以 IgE /FcεRI 信号通路为靶点设计药物，是
治疗变态疾病的有效途径。
有文献证实，IgE分子重链区 Cε3-Cε4(H34)是
与其高亲和力受体 FcεRI作用的关键区域［4–7］。为
此本试验对 H34 基因进行了克隆，在原核表达系统
中进行了表达，并用一步法柱上纯化复性 H34 蛋
白，优化纯化工艺，步骤简单，旨在获得高纯度的目
的蛋白，为进一步开发研究与 H34 相关的治疗变态
疾病的药物奠定良好的基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和质粒 试验材料大肠杆菌 E. coli
BL21，质粒 pET-17b 均由本实验室保存;变态反应
2011 年第 11 期 刘中成等:人 Cε3-Cε4 基因克隆、表达及纯化复性
性疾病病人外周血来自河北大学附属医院。
1. 1. 2 主要试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR 试剂
盒、DNA聚合酶、T4 连接酶、限制性内切酶 EcoRⅠ、
NdeⅠ，PCR产物纯化试剂盒、质粒小量快速提取试
剂盒、DL2000 DNA Marker(TaKaRa 公司) ;淋巴细
胞分离液(Axis-shield 公司) ;鼠抗人 IgE 重链特异
的抗体(IgG)、抗 His 标签抗体以及 HRP 标记的二
抗(Abcam公司) ;Ni-NTA柱(Bio Basic 有限公司) ;
BCA蛋白定量试剂盒(武汉博士德公司) ;其它试剂
均为国产分析纯。
1. 1. 3 引物 根据所选用载体 pET-17b 的序列特
征设计引物序列扩增 H34 基因，上游引物:5-
GCATATGGATTCCAACCCGAGAGGGGTGAGCGCCT-
ACCTAAGC-3，下游引物:5-CCGGAATTCTTAGTG-
GTGGTGGTGGTGGTGTTTACCGGGATTTACAG-3，上
下游引物中下划线处为 NdeⅠ和 EcoRⅠ的酶切位
点，双下划线为 6 个组氨酸的 His标签。
1. 2 方法
1. 2. 1 目的基因的克隆 取变态性疾病病人外周
血，加入 EDTA 抗凝血(1. 2 mg /mL 血液) ，用等体
积 PBS稀释血液并混合均匀，将稀释血缓慢加入到
等体积的淋巴细胞分离液中，水平转子2 000 r /min
离心 30 min，用吸管小心吸取中间层细胞，转移至洁
净试管中，用生理盐水洗涤 2 次，得到富含淋巴细胞
的悬浮液。
将上述细胞悬液转移至 1. 5 mL的离心管中，按
照 TaKaRa公司的 RNA 抽提试剂盒的步骤抽提淋
巴细胞的总 RNA。RT-PCR方法克隆 H34 基因。
1. 2. 2 原核表达载体的构建及鉴定 分别用 NdeⅠ
和 EcoRⅠ双酶切质粒 pET-17b 和 PCR回收产物，按
照质粒 DNA∶目的基因 = 1∶ 5 进行连接转化，在氨苄
青霉素抗性平板上筛选转化子，随机挑取单菌落进行
PCR扩增并提取质粒 DNA，通过限制性内切酶的酶
切验证，得到阳性重组质粒 pET17b-H34后测序。
1. 2. 3 H34 蛋白的诱导表达 提取测序正确的
pET17b-H34 质粒转化至 E. coli BL21 中，挑取单菌
落至含有 100 μg /mL氨苄青霉素的 LB 液体培养基
中，37℃，220 r /min培养 16 h 后菌液按 1∶ 100 的比
例接入新鲜 LB液体培养基中，37℃振荡培养 2. 5 h
左右至OD600达0. 8，加入 IPTG至终浓度 1. 0 mmol /L，
37℃继续振荡培养 4 h，并设未诱导对照和 pET-
17b /BL21 空质粒诱导的对照。诱导结束，8 000 r /min
离心 5 min收集菌体，用 PBS(phosphate buffer saline
pH7. 3)缓冲液洗涤 2 次，然后用 PBS 重悬菌体，在
冰浴中用超声破碎菌体，将破碎液于 4℃，12 000
r /min 离心 10 min，收集上清和沉淀。用 15% SDS-
PAGE检测融合蛋白的表达情况。
1. 2. 4 蛋白纯化与复性 将超声破菌后的沉淀，用
2 mol /L 尿素(含 1%的 Triton X-100)清洗，再离心
收集沉淀，用 pH7. 4 的 50 mmol /L 磷酸缓冲液
(0. 5 mol /L NaCl，8 mol /L尿素，20 mmol /L咪唑)重
悬。4℃ 条件下置于磁力搅拌器上搅拌 4 h，以
12 000 r /min、4℃离心 15 min，留澄清上清液。
用 pH7. 4 的 50 mmol /L 磷酸缓冲液(0. 5mol /L
NaCl，8 mol /L尿素，20 mmol /L 咪唑)2 倍柱体积冲
洗 Ni-NTA层析柱，后将上述澄清上清液分成两等
份，分别注入到两根 Ni-NTA 亲和层析柱上，用
15 mL的 pH7. 4 的 50 mmol /L磷酸缓冲液(0. 5 mol /L
NaCl，8 mol /L 尿素，20 mmol /L 咪唑) ，0. 5 mL /min
流速冲洗 Ni-NTA 亲和层析柱，同样流速下用 0. 5
mol /L pH5. 0 的醋酸缓冲液洗脱 Ni-NTA层析柱。
稀释复性:另一根分别用 10 mL的 50 mmol /L、
100 mmol /L、300 mmol /L 和 500 mmol /L 咪唑的洗
脱液(50 mmol /L 磷酸缓冲液 pH7. 4，0. 5 mol /L
NaCl，8 mol /L 尿素)洗脱，取少量洗脱液进行 SDS-
PAGE电泳。将其他收集的洗脱液及蛋白装入到透
析袋后加入 GSSG /GSH 终浓度为 0. 5 mmol /L
GSSG，5 mmol /L GSH和终浓度为 0. 5 mol /L的 L-精
氨酸，分别对含有 6. 0、4. 0、2. 0 和 0 mol /L 尿素的
PBS复性液透析进行复性。
柱上复性:其中一根柱子用含 6. 0、4. 0、2. 0 和
0 mol /L 的 复 性 缓 冲 液 (20 mmol /L Tris-HCl，
500 mmol /L NaCl，10% 甘油，20 mmol /L 咪唑，
0. 5 mmol /L GSSG，5 mmol /L GSH，pH8. 0)进行线性
梯度洗涤，逐步去除尿素以复性，复性后的目的蛋白
用 300 mmol /L 咪唑洗脱，作为对照。配制 15%的
SDS-PAGE进行蛋白电泳。
1. 2. 5 Western blotting 分析 H34 的特异性 样品
经 15% SDS-PAGE后，电转移到 PVDF 膜上。分别
用抗 His标签抗体及鼠抗人 IgE 抗体与纯化后的融
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
合蛋白进行免疫印迹杂交，ECL显色检测目的蛋白。
2 结果
2. 1 RNA提取结果
抽提结束后用紫外线分光光度计检测 RNA 的
质量浓度和纯度，OD260 /OD280处于 1. 8 － 2. 0 之间。
琼脂糖凝胶电泳(图 1)显示，RNA 带型清晰，28S
rRNA亮度约为 18S rRNA的 2 倍，符合试验要求。
图 1 总 RNA琼脂糖凝胶电泳结果
2. 2 RT-PCR扩增 IgE Cε3-Cε4 区 cDNA 片段
Cε3-Cε4 的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，结果
(图 2)显示，在 675 bp 左右可见目的基因片段，与
预期结果相符。
M． DNA Marker DL2000;1． Cε3-Cε4 基因
图 2 Cε3-Cε4 基因 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
2. 3 重组表达质粒鉴定
重组质粒 pET17b-H34 双酶切产物电泳图谱如
图 3 所示，酶切产生一条 675 bp 左右的条带和一条
与质粒大小相符的条带。测序结果显示，测定序列
与目的序列完全一致且开放阅读框也正确，说明重
组表达载体 pET17b-H34 构建成功。
M． DNA Marker DL5000;1． pET-17b经 EcoRⅠ + NdeⅠ双
酶切产物;2． pET17b-H34 经 EcoRⅠ + NdeⅠ双酶切产物
图 3 重组表达载体 pET17b-H34 的双酶切鉴定
2. 4 Cε3-Cε4 基因的表达
H34 的诱导表达结果如图 4 所示。与空质粒诱
导带对照，pET17b-H34 /BL21 诱导表达带在约 30
kD处有一条过量表达蛋白带，与目的蛋白的预期值
29 kD相符。不加 IPTG诱导的对照组中没有目的
M．蛋白Marker;1． IPTG未诱导 pET17b /BL21 的全菌;2．
IPTG诱导的 pET-17b /BL21 的全菌;3． IPTG 未诱导
pET17b-H34 /BL21 的全菌;4． IPTG 诱导 pET17b-H34 /
BL21 的全菌;5． IPTG 诱导 pET17b-H34 /BL21 的全菌破
碎后上清;6． IPTG 诱导 pET17b-H34 /BL21 的全菌破碎
后沉淀;7．纯化后 H34 目的条带
图 4 表达的 H34 蛋白 SDS-PAGE分析
蛋白的表达，说明目的基因在宿主细胞中得到了
表达。同时，发现融合蛋白质大部分分布在沉淀
中，由此认为融合蛋白质主要以包涵体形式表达。
经 Tanon Gis 软 件 分 析，包 涵 体 的 表 达 量 高
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2011 年第 11 期 刘中成等:人 Cε3-Cε4 基因克隆、表达及纯化复性
达 30. 7%。
由于 H34 表达蛋白带有 6 个组氨酸残基标
签，因而可以利用镍离子亲合层析的方法纯化融
合蛋白。纯化的 H34 蛋白经 SDS-PAGE 分析，结
果(图 4)显示，在相对分子量约 29 kD处可见单一
条带。
2. 5 融合蛋白纯化和复性
对 H34 蛋白进行透析复性，当透析到 2 mol /L
尿素时出现蛋白聚集。
柱上复性及咪唑梯度洗脱结果如图 5 所示，
SDS-PAGE证实第 II 峰即为可溶性 H34 融合蛋白
(图 6，4 － 7 泳道)。这表明 Ni-NTA 层析柱上复性
一步法就能得到较高纯度的可溶性 H34。
Ⅰ．杂蛋白;Ⅱ．用咪唑梯度洗脱的目的蛋白
图 5 以 Ni-NTA柱上复性和纯化 H34 的层析图
H34 包涵体经 2 mol /L尿素洗涤，8 mol /L尿素
溶解，Ni-NTA复性纯化留样 SDS-PAGE 分析。结果
(图 6)显示，在经 2 mol /L尿素洗涤包涵体，洗去杂
质的同时也洗去部分目的蛋白。用 Tanon Gis 软件
分析经 8 mol /L 尿素溶解的洗涤后包涵体的纯度，
纯度高达 85. 5%;最终目的蛋白纯度达 95. 3%。
2. 6 蛋白回收率
在本试验从 150 mL的菌液中获得 320 mg湿菌
体，破碎后得 150 mg 沉淀，经 2 mol /L 尿素洗后的
沉淀质量为110 mg，并用 BCA 试剂盒测定 5 mL 经
Ni-NTA金属螯合层析纯化后的可溶性蛋白，其浓度
为 5 mg /mL。获得 H34 融合蛋白的终回收率为
7. 8%(表 1)。
M．低分子量蛋白Marker;1． 2 mol /L尿素洗脱的包涵体;
2． 8 mol /L 尿素溶解包涵体;3． 平衡液洗脱液 Ni-NTA;
4 － 7． 300 mol /L咪唑洗脱的目的片段
图 6 重组蛋白亲和纯化与柱上复性的 SDS-PAGE分析
表 1 蛋白回收率
重量(mg) 回收率(%)
湿菌体 320
破碎后沉淀 150 46. 88
2 mol /L尿素洗后沉淀 110 73. 33
过柱后蛋白 25 22. 73
2. 7 Western blotting鉴定
分别用抗 His标签抗体及鼠抗人 IgE 抗体与纯
化后的融合蛋白进行免疫印迹杂交(图 7)显示，在
约30 kD处均可检测到阳性信号，显示该纯化蛋白既
可与抗 His标签抗体结合，又可结合鼠抗人 IgE 抗
体，表明此蛋白即为目的蛋白 H34。
M．蛋白 Marker;1．鼠抗人 IgE抗体;2．抗 His标签抗体
图 7 重组蛋白的Western blotting分析
3 讨论
IgE分子重链区 Cε3-Cε4 是与其高亲和力受体
FcεRI作用的引发 I 型变态反应的关键步骤。近年
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来，研究人员根据变态反应性疾病发病机制，以
Cε3-Cε4 为靶标设计了多种药物抑制 IgE 介导的肥
大细胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒反应，如已上市的
Omalizumab等抗 IgE 抗体、模拟肽以及 IgE 疫苗等
药物［8，9］。研究表明，以 Cε3-Cε4 蛋白开发治疗变
态疾病的药物是可行的。因为大肠杆菌表达系统具
有操作简单、表达量高、可以根据需要进行优化等优
点，但大多外源蛋白均以包涵体形式存在，复性较为
困难。据文献报道，人们大多在昆虫细胞或哺乳动
物细胞表达 H34 蛋白。以大肠杆菌系统表达 H34
蛋白的报道较少［10］，且在蛋白纯化过程中均采用多
步纯化复性，过程繁琐、时间久，本研究尝试一步柱
上纯化复性获得 H34 蛋白。
通过筛选表达菌株，优化诱导温度，尽管在一定
程度上提高了 H34 蛋白的表达水平，但其表达产物
依然以包涵体的形式存在，无法获得可溶性表达。
所以对包涵体沉淀进行洗涤、溶解、纯化和复性。
初次抽提的包涵体含有细菌外膜蛋白和核酸等杂
质，利用 2 mol /L尿素和 1% Triton X-100 对包涵体
进行反复洗涤，去掉了细菌内大部分杂质及部分目
的蛋白，减少了后步的纯化压力，有利于后续的包涵
体复性［11，12］。由于在分离纯化过程都会有不同程
度的目的蛋白的丢失或损耗，以及在 2 mol /L 尿素
洗涤沉淀过程中洗去杂蛋白的同时也洗去了部分目
的蛋白，致使蛋白回收率偏低，但蛋白纯度高达
85. 5%。采用一步柱上复性，相对于透析复性和两
步柱纯化复性，缩短复性时间，达到纯化效果。
层析复性是近期包涵体复性的研究热点，它可
以通过变性蛋白在层析柱中与层析介质的相互作用
抑制蛋白质的聚集，从而达到提高蛋白质活性回收
率的目的，并且同时还能将蛋白质提纯，起到一举两
得的效果［13，14］。本研究采用柱上一步纯化和复性
的策略，通过逐渐减低尿素的浓度，有利于 H34 的
折叠，同时还脱去了蛋白质溶液中的尿素，得到了较
高纯度的可溶性重组 H34 蛋白。相对于透析复性
和稀释复性，柱上复性既克服了透析复性容易出现
蛋白聚集而导致复性失败的缺点，又克服了稀释复
性后体积过大，浓缩困难的缺点［15］。分析柱上成功
复性的原因可能是，带 6 个组氨酸标签的目的蛋白
结合到 Ni-NTA 柱上后，每个蛋白分子是相对独立
的，易于正确折叠［16，17］。采用 Western blotting 检测
表明，所获 H34 蛋白能被鼠源性抗 IgE mAb 所识
别，表明已暴露出其抗原表位，为进一步该蛋白的相
关研究奠定了基础。
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(责任编辑 马鑫
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