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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 11期
枣树肌动蛋白基因 cDNA片段的克隆及其表达分析
孟玉平 1 　张洁 1, 2 　张春芬 1 　孙海峰 1, 3 　曹秋芬 1, 2
(1山西省农业生物技术研究中心 ,太原 030031; 2山西大学生物工程学院 ,太原 030006; 3山西大学化学化工学院 ,太原 030006)
　　摘 　要 : 　根据 GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源核苷酸保守序列设计引物 ,以壶瓶枣 ( Z iziphus ju juba M ill. Hup2
ingzao)刚萌发结果枝构建的 cDNA文库为模板 ,利用 PCR技术得到了一个 478 bp的 cDNA片段。与其它植物同源序列进行
分析表明 ,其核苷酸序列的同源性在 70%以上 ,氨基酸序列的同源性在 85%以上 ,证明它是肌动蛋白基因在枣树中的同源
cDNA片段 ,命名为 Z jA T1 ( Z iziphus jujuba actin1) , GenBank登录号为 EU251882。DNA印迹分析结果表明 , Z jA T1在枣树基因组
中以单拷贝的形式存在。对不同发育阶段的不同器官组织进行了 RT2PCR分析 ,结果显示 Z jA T1基因只在花和幼果中有明显
表达 ,在毛根、幼茎、叶片、成熟茎尖、成熟茎段以及成熟果实的果肉和种仁中都没有检测到表达。
关键词 : 　枣树 　肌动蛋白基因 　克隆 　表达
Clon ing and Expression Analysis of Actin Gene cDNA
Fragment( ZjAT1) from Jujube
Meng Yup ing1 　Zhang J ie, 1, 2 　Zhang Chunfen1 　Sun Haifeng1, 3 　Cao Q iufen1
(1 Agri2B iotechnology R esearch Centre of Shanxi P rovince, Taiyuan 030031; 2 College of B ioengineering,
Shanxi University, Taiyuan 030006; 3 College of Chem istry and Chem ical Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006)
　　Abs trac t: 　W hen cDNA of the fruit2bearing shoot of Z iziphus jujuba M ill(Hup ingzao) was used as model DNA, and the PCR p rim2
er according to the homologous nucleotide sequences of actin in GenBank was designed, a 478 bp cDNA fragment( Z jA T1) was obtained
by PT2PCR. The results of homologous sequence analysis by compared homology of this fragment with the other p lants showed that frag2
ment was homologous gene of actin in jujube, in which the homology of nucleotide sequenceswas above 70% and the homology of am ino
acid sequences was above 85%. In this paper, the 478 bp fragment was named as Z jA T1 ( Z iziphus Ju juba Actin1) , with registered num2
ber in GenBank EU251882. The Southern blotting analysis suggested that Z jA T1 existed in jujube genome in the form of single copy. The
results of RT2PCR analysis in different organs and different development stages confirmed that Z jA T1 was only exp ressed in flower and
young fruit, and no Z jA T1 could be found in leaf, root, stem, bud, pulp and kernel.
Key wo rds: 　Z iziphus jujuba　A ctin gene　Cloning　Exp ression
收稿日期 : 2009208226
基金项目 :山西省自然科学基金项目 (20051081, 200801106222)
作者简介 :孟玉平 (19552) ,男 ,副研究员 ,研究方向 :果树生物技术 ; E2mail: mengyup ing@ yahoo. com. cn
通讯作者 :曹秋芬 , Tel: 035127127503, E2mail: caoqiufeng@yahoo. com. cn　　肌动蛋白是真核生物细胞骨架中的一种基本结构组分。根据目前研究表明 ,植物肌动蛋白通常由376～377个氨基酸残基组成 ,具有高度的保守性和表达稳定性 [ 1 ] ,其编码基因常被看作植物基因表达分析常用的内参之一。在植物生长和发育过程中肌动蛋白起着多种重要作用 ,如细胞分裂、细胞器定向运动、细胞极性的建立、细胞形状和分裂板的决定等细胞学过程 [ 2, 3 ]。由于极性、细胞分裂的方向和细胞壁的沉 积被认为是植物模式形成和器官形态的主要支配因素 ,所以肌动蛋白是植物发育中的一个中心元件 [ 4 ]。而且研究还证明 ,多种植物中都存在有多个肌动蛋白基因 ,如矮牵牛的基因组中有 100多个肌动蛋白基因 ,大豆、烟草、土豆、水稻、拟南芥等都属于多基因家族。不同生物肌动蛋白具有高度保守性 ,其核苷酸残基变化 1%约需 100万年 ,暗示着肌动蛋白基因在进化过程中承受着较大的选择压力 ,在生物体内执行着
2009年第 11期 孟玉平等 :枣树肌动蛋白基因 cDNA片段的克隆及其表达分析
重要的生物学功能 [ 5, 6 ]。
目前 ,对枣属植物肌动蛋白基因的研究很少 ,在
GenBank中尚未见注册。中国枣属于鼠李科枣属植
物 ( Z iziphus ju juba M ill. ) ,主要分布于我国华北及其
周边地区 ,是一种重要的经济林树种 ,是枣属植物的
典型代表。枣树属于无性繁殖 (嫁接、根蘖苗 )树
种 ,具有童期较短 ,成花容易的特点。枣树结果枝
(枣吊 )于春天从结果母枝 (枣股 )中萌发 ,边生长边
花芽分化 ,秋天在果实采摘后一个多月即自行脱落 ,
它是一年中生长发育最活跃的器官。为了探索、克
隆枣树的一些优良特性基因 ,构建了枣树生长初期
结果枝 cDNA 文库 ,再从文库中克隆分离有用基
因。本研究从枣结果枝 cDNA文库中的克隆肌动
蛋白基因片段及其表达特征分析。这对于研究枣
树中肌动蛋白基因家族具有一定意义 ,为进一步
研究肌动蛋白基因对枣树的生长发育调控机制奠
定基础。
1　材料与方法
111　材料与试剂
供试材料取自山西省农业生物技术研究中心试
验园 40多年生的壶瓶枣树 ( Z iziphus ju juba M ill. Hup2
ingzao) ,为春天刚萌发不久、生长发育旺盛时期采集、
长度大约为 10 mm的结果枝 ,用于构建 cDNA文库。
另外 ,为了分析该基因片段在不同营养和生殖器官中
的表达 ,采集毛根、幼茎、叶片、成熟茎尖、成熟茎、花
和幼果、成熟果实的果肉和种仁。所有采集的材料用
冰壶从试验园取回后做适当剥离、修整 ,液氮快速冷
冻后置于 - 70℃冰箱保存备用。
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶以及 PCR 用
Taqase等常规分子生物学试剂购自大连宝生物有限
公司 , mRNA 纯化试剂盒 (货号 : Z5200 )购自 Pro2
mega (美国 ) , cDNA文库构建试剂盒 (货号 : 18248 -
039)购自 Invitrogen (美国 ) ,MMLV第一链 cDNA合
成试剂盒 (货号 : BS 250)购自 BB I(加拿大 ) ,地高辛
标记和检测试剂盒 (货号 : 1093657、2041677 )购自
Roche (德国 )。
112　总 RNA提取及 cDNA第一链的合成
采用曹秋芬等 [ 7 ]报道的 CTAB法进行总 RNA
提取。利用 Eppendorf光电比色计测定总 RNA 的
浓度后 ,取 3μg总 RNA用于 cDNA第一链合成 ,根
据试剂盒推荐的反应体系及条件进行合成 ,光电比
色法测定产物浓度以确定 RT2PCR的模板用量。
113　结果枝 cDNA文库的构建
根据 mRNA 纯化试剂盒说明书对提取的总
RNA进行纯化。用纯化的 mRNA 进行 cDNA文库
构建 ,具体操作步骤采用试剂盒推荐的方法和条件
进行 ,最后用 TEN (10 mM Tris2HCl, pH 715, 011 mM
EDTA, 25 mM NaCl)稀释 cDNA至浓度为50 ng/μl。　
114　肌动蛋白基因片段的克隆、同源性分析
根据 GenBank中登录的植物肌动蛋白基因同源
核苷酸保守序列设计引物 ,委托上海生工生物工程技
术服务有限公司合成。
上游引物 Aac12S: 5′2gtgctcgactctggagatggtgtg23′
下游引物 Aac12AS: 5′2cggcgattccagggaacattgtgg23′
取上述 113构建的 cDNA文库 1μl作为模板 ,
浓度为 10 pmol/μl的引物 015μl, 013 U Taq DNA
聚合酶 , 2 μl 10 ×PCR Buffer和 015 μl 215 mM
dNTP,用水扩大体积至 20μl。反应条件 : 94℃预变
性 5 m in, 94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 m in循环 35
次 , 72℃延伸 5 m in终止反应。取 3μl PCR产物进
行电泳确定片段大小。
根据《精编分子生物学实验指南》报道的方法 [8 ] ,
制备 pB lueScrip t KS (2) PCR克隆 T载体 ,而后将 PCR
产物与制备好的 T载体连接过夜 ,反应温度为 12℃。
连接产物转化至 E1coli DH5α感受态细胞 ,涂布于有
氨苄青霉素抗性的平皿 37℃培养过夜。蓝白斑筛选
重组质粒并委托上海生工双向测序。分别利用 NCB I
(www1ncbi1nlm1nih1gov/ )和 SW ISS2PORT ( http: / /
expasy1org/ sport/ )在线分析软件 B last将其核苷酸
序列及推测的氨基酸序列与植物肌动蛋白进行同源
性比对。
115　枣基因组 DNA的提取及 Southern印迹分析
肌动蛋白属于多基因家族 ,为了了解该基因在
枣基因组中的分布 ,以重组质粒为模板 ,用 PCR的
方法制备地高辛标记的探针 ,引物及反应条件同
114。利用改良的 CTAB法 [ 9 ]从嫩叶材料中提取枣
基因组 DNA 10 μg, 限制性内切酶 B am H Ⅰ、
EcoRⅠ、H indⅢ和 EcoRⅤ分别酶解后 , 017%琼脂糖
凝胶电泳分离 ,印迹到 Hybond2N +膜上。分子杂交
是用 D IG EASY HYB 液体在 50℃, 探针浓度
99
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
100 ng/m l的条件下进行 12 h。杂交后的尼伦膜在
室温下用 2 ×SSC, 011% SDS冲洗 2次 ,然后在 65℃
条件下 ,用 015 ×SSC, 011% SDS洗 2次 ,各 15 m in,
化学发光检测按照制造商的说明用 CDPstar进行 ,用
X光胶片显影。
116　RT2PCR分析该基因在不同器官中的表达
利用上述克隆基因所用引物 ,以所采根、幼茎、
叶片、成熟茎尖、成熟茎、花和幼果等组织的 RNA反
转录产物 (反转录反应按照试剂盒说明进行 )为模
板 ,进行 RT2PCR反应。反应体系 : 10 ×PCR buffer 5
μl, 215 mM dNTP 4 μl, 10 μM Aac I2S、Aac I2AS各
110μl, TaqDNA聚合酶 011 U,模板用量 2μl,用水
补充体积至 50μl;反应条件与上述基因克隆条件相
同 ,循环次数为 40。同时以 Z jH3 ( GenBank登录号 :
EU916201)为内参基因 ,其反应体系与前面相同 ,
PCR条件除了退火温度改为 60℃外 ,其他条件
相同。
2　结果与分析
211　枣肌动蛋白基因片段的克隆及其同源性比较
肌动蛋白基因片段扩增产物的 112%琼脂糖电
泳结果表明 ,从构建的 cDNA文库中获得了大约是
500 bp cDNA片段 (图 1)。序列测定结果表明 ,该片
段为 478 bp,编码 159个氨基酸的肌动蛋白 cDNA不完
全序列 (图 2) ,命名为 Z jAT1 ( Z iziphus jujuba Actin1) ,
GenBank核苷酸登录号为 EU251882;氨基酸登录号
为 ABX09991。该段核苷酸序列与 GenBank中登录的
其它植物同源区域进行比对的结果表明 ,与禾本科植
物高粱 SVSOAC1 (X79378)同源性为 78% ,与拟南芥
ACT1 (NM179953)和 AAC1 (M20016)的同源性均为
77% ,与拟南芥 ACT2 (NM112764)、ACT3 (NM115235)、
ACT7 ( NM121018 )、ACT11 ( NM112046 ) 和 ACT12
(NM114519)、夏堇 ACT4 (AB330990 )和向日葵中
ACTIN (AF282624)的同源性为 76% ～7616% ,说明
获得的 cDNA片段是肌动蛋白基因在枣树中的同源
片段。
图 1　Z jA T1基因的 PCR电泳分析
图 2　Z jA T1的核苷酸序列及推测的氨基酸序列
001
2009年第 11期 孟玉平等 :枣树肌动蛋白基因 cDNA片段的克隆及其表达分析
CAA33874. 水稻 ; AAM65277. 拟南芥 ; AAC23632. 拟南芥 ; CAA55923. 高粱 ;
AAB40097. 马铃薯 ; AAL89713. 金鱼藤 ; AAZ74666. 黄瓜
图 3　ZjA T1氨基酸序列与其它植物肌动蛋白序列保守性分析
　　由 Z jAT1基推测的氨基酸序列与 GenBank中的
其它植物肌动蛋白基因同源区域氨基酸序列进行相
似性比较 ,发现其相似性都在 85%以上。从图 3可
以看出 , Z jA T1与水稻中肌动蛋白 (CAA33874)和拟
南芥中的 ACT11 (AAM65277)同源性最高 ,为 88% ;
其次为拟南芥的 ACT3 (AAC23632 ) 87 % ; 高粱
(CAA55923) 87% ;马铃薯 (AAB40097) 87% ;金鱼
藤 (AAL89713) 86% ;黄瓜 (AAZ74666) 86%。由此
可见 ,肌动蛋白在氨基酸组成上是高度保守的 ,这与
它参与构成细胞骨架的重要功能是紧密相关的。
对氨基酸序列进行功能域分析结果表明 ,该片
段包含 4个 ATP结合位点 , 1个肌动蛋白凝溶胶蛋
白结合位点 , 5个肌动蛋白的抑制蛋白结合位点。
212　Z jA T1同源基因在枣基因组中的存在
地高辛标记探针分析酶切枣基因组 DNA的结
果见图 4。从图中可以看出 , B am HⅠ、EcoRⅠ和 H ind
Ⅲ酶切过 DNA 中均为一条带 ,而 EcoR V 酶切后
DNA中呈现出两条带 ,核苷酸序列酶切位点分析证
实该基因片段中存在 EcoR V的酶切位点。这些试
验结果表明 Z jA T1在枣树基因组中以单拷贝的形式
存在。该结果与拟南芥基因组中 A ac1以单拷贝形
式存在的结果一致。
1. B am H I酶切 ; 2. EcoR I酶切 ;
3. H indⅢ酶切 ; 4. EcoRV酶切
图 4 D NA2blot分析
213　Z jA T1在不同组织中的表达
以 Z jH3 ( GenBank登录号 : EU916201)为内参基
因 ,对不同组织中的 RT2PCR分析结果表明 (图 5) :
Z jA T1在花和幼果中具有明显表达 ,在毛根、幼茎、
叶片、成熟茎尖、成熟茎断、成熟果肉和种仁中都没
有检测到其表达。据此推断 , Z jA T1不同于组成型
表达的肌动蛋白基因 ,即是在生长旺盛的幼茎、以及
生长缓慢的成熟茎和叶片中都没有表达 ,它可能属
101
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 11期
于一个在花和幼果中特异表达的肌动蛋白 ,对花和
幼果得发育起调控作用。
1. 根 ; 2. 幼茎 ; 3. 叶 ; 4. 茎尖 ; 5. 成熟茎 ; 6. 花 ;
7. 幼果 ; 8. 成熟果肉 ; 9. 种仁 ;M. marker
图 5　Z jA T1在不同器官中的表达
3　讨论
本研究是在构建枣树生长早期落性枝 cDNA文
库的基础上 ,以文库为模板克隆获得 Z jA T1。这种
方法的优点是只作一次前期工作便可从中选择性地
克隆多个基因 ,省工、省时、省试材、省成本。利用同
样的方法 ,本实验室已经克隆得到 Z jA T1 , Z jA P1
( EU916199 ) , Z jUBQ ( EU916200 ) , Z jH3 ( EU91
6201 ) , Z jEF1 ( EU916202 ) , Z jCyP ( EU916023 ) ,
Z jEX P 1 ( FJ449891) , Z jEX P 2 ( FJ449892)等基因。
肌动蛋白是真核生物细胞中普遍存在的最保守
的古老蛋白之一 ,具有重要的生理功能。一般认为
肌动蛋白在各种生物中通过复制和变异而被保留下
来 ,植物肌动蛋白起源于一个共同的祖先 [ 10 ]。根据
本试验从枣中的分离得到的肌动蛋白基因片段核苷
酸序列和氨基酸序列分析证明 ,该片段与 GenBank
中收录的其它生物肌动蛋白基因有较高的同源性。
植物的肌动蛋白基因家族各成员具有高度保守的氨
基酸组成 ,这种高度保守性与肌动蛋白作为细胞骨
架的保守功能是相应的。许多研究结果表明 ,不同
的生物中肌动蛋白的数目变化很大 ,除少数单细胞
原生动物、藻类、酵母类外 ,所有的多细胞真核生物
的肌动蛋白都由多基因家族编码 [ 11, 12 ] ,因而具有数
量不等的异型体。各异型体基因的编码区保守性很
强 ,但非编码区差异较大 ,其表达具有时间和空间上
的差异 [ 13 ] ,以适应不同组织和细胞类型在不同发育
时期的需要。
本研究最初设想以克隆得到枣肌动蛋白基因作
为分析其他功能基因表达时的内参 ,以苹果肌动蛋
白基因的核苷酸序列设计的特异性引物 ,但表达分
析结果表明得到的 Z jA T1是一个具有表达特异性的
基因 ,不适合作为内参基因。由于 Z jAT1基因分离
自刚发芽的落性枝 ,此时的落性枝正处于花芽分化
旺盛时期、生长旺盛时期 ;分析 Z jA T1基因在不同器
官中的表达 ,表明其只存在于花和幼果 ,在其它器官
中没有检测到 ;基因组印迹分析也表明 Z jA T1在枣
基因组中是以单拷贝的形式存在。由此推断 , Z jA T1
不是组成型表达 ,属于特异性表达的一种 ,它只是枣
树肌动蛋白基因家族中的一个异型体 ,还应该有其
他成员存在 ,需要进一步深入研究。
多项报道指出植物发育过程中肌动蛋白基因的
表达具有发育阶段特异性和器官特异性。黄绍兴
等 [ 14, 15 ]研究了丝瓜、黄瓜和豌豆发育过程中肌动蛋
白基因的表达 ,在丝瓜等幼苗的根、子叶、下胚轴中
肌动蛋白基因表达量很低 ,而在开花植株的幼果、卷
须和花粉中的肌动蛋白基因表达量明显增高。在黄
瓜的开花植株中肌动蛋白基因表达量也以花粉、幼
果和卷须中含量较高 ,这表明肌动蛋白的表达有器
官特异性和发育阶段特异性。在开花植株中肌动蛋
白的表达量以雌雄蕊为高 ,在雌蕊的心皮 (花萼、花
瓣较少 )、果实中肌动蛋白的表达量最高。Kandasamy
等 [ 16 ]证明在拟南芥 (A rabidopsis tha liana )中肌动蛋
白基因分为两类 :即营养体基因与生殖细胞基因 ,属
于在不同发育阶段差异表达的肌动蛋白 [ 17 ]。 Z jA T1
的表达模式分析表明它不同于组成型表达的肌动蛋
白基因 ,类似于上述研究中生殖细胞基因类型 ,只在
花和幼果中表达 ,可能属于在花发育阶段特异表达
的肌动蛋白。
Z jAT1是首次在 GeneBank中注册的一个枣树肌
动蛋白基因片段 ,增加了一个 Actin基因家族的成员
且有助于 Actin基因的研究 ,但是枣树 Actin基因家族
的研究只是开了个头 ,还需要大量、深入地研究。
参 考 文 献
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2　 Mascarenhas JP. Plant Cell, 1993, (5) : 1303～1314.
(下转第 107页 )
201
2009年第 11期 张文娜等 :甜樱桃品种 SSR2PCR反应体系的优化
因素设计、完全组合设计及正交设计的方法。正交
设计是从复因子的试验结果中仅挑选部分有代表
性的水平组合进行试验 ,相对于单因素设计及完
全组合设计减少了许多处理组合 ,节省了人力和
物力 ,但其可选的数值变化范围较小 ,不能够全面
体现单一因素梯度的变化 ,而且在技术上有许多
不便 ,所以本试验使用多次单因素设计 ,以期获得
最佳优化体系。
4　结论
本试验找出了甜樱桃 SSR反应体系中 MgCl2、
dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及模板 DNA等 5因素
的较优的水平组合 ,建立了优化的甜樱桃 SSR反应
体系。应用该体系对 24个甜樱桃品种及野生种进
行扩增 ,获得片段大小为 75～250 bp ,证实该体系稳
定可靠。
参 考 文 献
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