全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLO GY　BULL ETIN 2009年第 9期
三七法呢基焦磷酸合酶原核表达载体的构建及其表达
周娟 1 　赵瑞强 1 　陈莉 2 　吴耀生 1
(1 广西医科大学生物化学与分子生物学教研室 ,南宁 530021; 2 桂林医学院 ,桂林 541004)
　　摘 　要 : 　在克隆得到三七法呢基焦磷酸合酶 ( FPS) cDNA的基础上 ,构建原核表达载体 pET32a ( + ) /FPS,并转化大肠杆
菌 BL21 (DE3)受体菌 ,在 37℃, 1 mmol/L IPTG浓度条件下 ,诱导表达 FPS融合蛋白 ,对诱导表达条件进行了优化。结果表明 :
成功构建了原核表达载体 pET32a ( + ) /FPS,并在大肠杆菌中成功表达 FPS蛋白 ,分子量约为 40 kD,为进一步开展 FPS的蛋
白纯化和功能分析奠定了基础。
关键词 : 　三七 　法呢基焦磷酸合酶 　原核表达 　pET32a ( + ) 　融合蛋白
Construction of Expression Vector of Notog iseng FPS
and Its Expression in Prokaryotic Cells
Zhou Juan1 　Zhao Ruiqiang1 　Chen L i2 　W u Yaosheng1
(1 Departm ent of B iochem istry and M olecular B iology, Guangxi M edical University, N anning 530021; 2 Guilin M edical University, Guilin 541004)
　　Abs trac t: 　The FPS gene was amp lified from the temp late of p lasm id pBSK2FPS by PCR. The FPS was sub2cloned into the multi2
p le clone sites of p lasm id pET32a ( + ) to get the p rokaryotic vector of pET32a ( + ) /FPS, which was transformed into E. coli BL21
(DE3). The fusion p rotein FPS was exp ressed under 1 mmol/L IPTG concentrations at 37℃. The results showed that the p rokaryotic
exp ression vector pET32a ( + ) /FPS was constructed successfully and FPS fusion p rotein was exp ressed with molecular weight of 40
kD, laying a foundation for further purification and functional study of the FPS p rotein.
Key wo rds: 　Panax notoginseng　Farnesyl pyrophasphate synthase ( FPS) 　Prokaryotic exp ression　pET32a ( + ) 　Fusion p ro2
tein
收稿日期 : 2009204207
基金项目 :广西研究生教育创新计划资助项目 (2008105981001M228)
作者简介 :周娟 (19822) ,女 ,硕士研究生 ,从事药用植物分子生物学研究 ; E2mail: zhoujuan1213@163. com
通讯作者 :吴耀生 ,教授 ,硕士导师 ; Tel: 077125358817, E2mail: wuyaosheng03@ sina. com　　三七是一种重要的药用植物 ,主要有效成分是三萜皂苷。三萜皂苷的生物合成途径复杂 ,整个合成过程涉及法呢基焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶或单加氧酶、氧化鲨烯环化酶等一系列酶。类异戊二烯化合物是植物三萜皂苷合成中的中间产物 ,法呢基焦磷酸处在许多类异戊二烯化合物合成的分支点上 ,该中间产物合成的酶促反应被广泛认为在萜类合成中是一个限速步骤。法呢基焦磷酸合酶 ( farnesyl pyrophasphate synthase,FPS)是类异戊二烯途径中的一个关键酶 ,它催化五碳原子的异戊烯基焦磷酸和二甲丙烯基焦磷酸以 1, 4头尾连续缩合反应 ,形成 15碳的法呢基焦磷酸 ,而该产物是许多植物代谢产物的前体物 ,如 甾醇、三萜、长醇、泛醌、类胡萝卜素的前体物以及蛋白质的法呢基化的底物 [ 1 ] 。在植物中 , FPS基因在植物适应环境、抗逆及抗病方面起着关键的作用。本试验在已经克隆了三七 FPS基因 cDNA的基础上 ,构建 FPS原核表达载体 ,并在大肠杆菌中诱导表达 ,为 FPS蛋白的进一步纯化 ,进行结构和功能的研究奠定基础。1　材料与方法111　材料质粒 pET232 Vector、菌株 DH5α、BL21 (DE3)、限制性核酸内切酶 Sa l I、B am H I、Taq DNA聚合酶购自 TaKaRa宝生物工程公司产品。含 FPS全基因组序列的体外克隆 pBSK2FPS由本课题组构建。高保
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2009年第 9期 周娟等 :三七法呢基焦磷酸合酶原核表达载体的构建及其表达
真 KOD2PLUS聚合酶购于 Toyobo公司。基因测序
由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
112　方法
11211　原核表达载体 pET32a ( + ) /FPS的构建及
鉴定 　根据前期研究的 FPS基因序列的结果 ,在获
得克隆载体 pBSK2FPS的基础上 ,重新设计引物 ,上
游引入 B am H I酶切位点 ,下游引入 Sa l I酶切位点
(下划线部分 )。
上游引物 : 5′2ACGGATCCATGAGCGATCTGAAG
ACG23′
下游引物 : 5′2ACGTCGACTTACTTTTGCCGCTTA
TA23′
采用 30μl反应体系 , PCR扩增条件 : 94℃预变
性 3 m in, 94℃ 15 s、58. 6℃ 30 s、72℃ 70 s,共 30个
循环 ,最后 72℃延伸 10 m in。PCR产物电泳后回收
并纯化。用 B am HⅠ和 Sa lⅠ酶双酶切 ,电泳后胶回
收 ,溶于 20μl三蒸水中。
用限制性内切酶 B am HⅠ酶和 Sa lⅠ酶双酶切
pET32a ( + )空质粒 ,得到线性 pET32a ( + )质粒。
在反应管中加入双酶切后的 FPS胶回收片段 3μl,
pET32a ( + )双酶切产物 2μl, SolutionⅠ5μl (DNA
L igation Kit Ver. 2. 0) , 16℃反应 30 m in。将得到的
FPS基因与 pET32a ( + )质粒连接产物转化感受态
细胞 DH5α。将转化菌取 150μl涂于含氨卞青霉素
的 LB培养板上 , 37℃培养 12～16 h。采用质粒小
提试剂盒提取质粒 ,以其为模板进行 PCR扩增 ,并
将提取的质粒经 B am H I和 Sa lⅠ双酶切。筛选阳性
重组克隆 ,送 DNA测序作最后的确认。
11212　重组质粒 pET32a ( + ) /FPS在 BL21 (DE3)
中的诱导表达 　用重组质粒 pET32a ( + ) /FPS转化
E. coli BL21 (DE3)受体菌 ,筛选阳性重组克隆于含
氨苄青霉素的液体 5 m l 100 mg/L LB培养基中 ,置
于 37℃培养过夜后 ,取 50 m l菌液加入含 100μg/m l
氨卞青霉素的 LB培养液培养至 A600达 0. 4～0. 6,
取 1 m l留作诱导前对照 , 4 m l加入 1 mol/L的 IPTG
至终浓度 1 mmol/L。继续培养 3～5 h, 8 000 r/m in
离心 10 m in,收集菌体沉淀。每管加 1. 5 m l细菌重
悬液重悬菌体 ,置冰浴中 ,超声波破菌 (打 0. 5 s,停
0. 5 s)共 5 m in。4℃, 8 000 r/m in离心 15 m in,分别
收集上清液和沉淀 ,均进行 12% SDS2PAGE电泳 ,考
马斯亮兰染色 ,比较上清液及沉淀中蛋白质表达情
况。观察不同 IPTG浓度、诱导时间、开始诱导表达
时间及诱导温度对融合蛋白表达量的影响。
2　结果
211　原核表达载体 pET32a ( + ) /FPS构建和鉴定
以提取的 pET32a ( + ) /FPS质粒为模板 ,用
PCR扩增 ,经电泳检测 ,结果扩增出约 1 kb的片段
(图 1,泳道 2) ,与理论上 FPS大小一致 ; B am H I和
S a l I内切酶酶切 ,切出一条 1 kb大小的 DNA片段
及一条约 5. 9 kb的载体片段 (图 1,泳道 3) ,与预期
一致 ;测序结果表明 ,重组表达载体 pET32a ( + ) /
FPS插入的序列与本课题组克隆的三七 FPS基因序
列基本一致 ,为预期的 FPS编码序列。其推测的氨
基酸序列与人参的氨基酸序列一致 ,也是编码 342
个氨基酸残基 (图 2)。
1. DL2000分子量对照 ; 2. FPS PCR产物 ;
3. B am H I、Sal I双酶切 pET32 a ( + ) 2FPS产物
图 1　原核表达载体 pET32a( + ) /FPS酶切鉴定结果
212　pET32a ( + ) /FPS在 BL21 (DE3 )中的诱导
表达。
将 IPTG诱导后的工程菌裂解、离心、取上清和
沉淀 , SDS2PAGE检测显示有融合蛋白表达 ,分子量
约为 40 kD,与预期相吻合。表达的融合蛋白以部
分可溶的形式存在于大肠杆菌胞液中。在 1 mmol/
L的 IPTG诱导下 , pET32a ( + ) /FPS表达的起始时间
为 1 h,蛋白表达量随着时间的延长而增加 ,最佳诱导
时间为 5 h,最佳诱导温度为 37℃ (图 3～图 6)。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 9期
①为上游引物位点 ,其中 GGATCC为 B am H I酶切位点 ; ②为下游引物位点 ,其中 GTCGAC为 SalⅠ酶切位点
图 2　原核表达载体 pET32a( + ) /FPS的质粒测序结果
1. 标准蛋白 ; 2. 空质粒 ; 3. pET32a ( + ) /FPS未诱导 ; 4. 0. 1 mmol/L
IPTG; 5. 0. 5 mmol/L IPTG; 6. 1 mmol/L IPTG; 7. 2 mmol/L IPTG; 8. 4
mmol/L IPTG; 9. 8 mmol/L IPTG
图 3　 IPTG浓度对 pET32a( + ) /FPS诱导表达的影响
1. 标准蛋白 ; 2. 空质粒 ; 3. pET32a ( + ) /FPS未诱导 ; 4. 诱导 0. 5 h; 5.
1 h; 6. 2 h; 7. 3 h; 8. 5 h; 9. 7 h; 10. 20 h; IPTG诱导浓度均为 1 mmol/L
图 4　pET32a( + ) /FPS表达的最佳诱导时间
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2009年第 9期 周娟等 :三七法呢基焦磷酸合酶原核表达载体的构建及其表达
1. 标准蛋白 ; 2. 空质粒 ; 3. pET32a ( + ) /FPS未诱导 ; 4. 0 h开始诱
导 ; 5. 0. 5 h; 6. 1 h; 7. 2 h; 8. 3 h; 9. 5 h; 10. 7 h
图 5　pET32a( + ) /FPS表达的最适开始诱导时间
1. 标准蛋白 ; 2. 空质粒 ; 3. pET32a ( + ) / FPS未诱导 ; 4. 37℃诱导的
菌液上清 ; 5. 37℃诱导的菌体沉淀 ; 6. 28℃诱导的菌液上清 ; 7. 28℃
诱导的菌体沉淀 ; 8. 25℃诱导的菌液上清 ; 9. 25℃诱导的菌体沉淀
图 6　温度对 pET32a( + ) /FPS诱导表达的影响
3　讨论
三萜皂苷的合成途径一般为甲羟戊酸途径 ,主
要分为 3个阶段 [ 2 ] : (1)活性异戊二烯单位Δ3 2异戊
烯焦磷酸酯 ( isopentenyl diphosphate, IPP)和γ,γ2二
甲基烯丙焦磷酸酯 ( dimethylally diphosphate, DMA
PP)的生物合成 ; ( 2)鲨烯的合成及环化 ; ( 3)环上
复杂的官能化反应过程 ,最终形成完整的三萜皂苷。
涉及植物三萜皂苷生物合成通路的各种酶基因有不
少已经克隆测序 ,但是各种基因表达的酶结构特征
仍不十分明确 ,也缺乏药用植物三萜皂苷生物合成
通路的系统研究。目前还未见对三七法呢基焦磷酸
合酶在蛋白质水平上研究的报道。试验是在三七
FPS已经克隆的基础上 ,构建了重组组原核表达载
体 pET32a ( + ) /FPS。转化 pET32a ( + ) /FPS的大
肠杆菌在 37℃下 ,经 1 mmol/L IPTG诱导 5 h成功
高表达分子量约为 40 kD的融合蛋白。
对三七克隆得到的 FPS基因测序结果发现 ,三
七 FPS与其他几种已见报道的植物 FPS测序结果
一样 [ 3 ] ,是编码 342～343个氨基酸残基。三七和人
参有共同的三萜皂苷合成通路 ,推测其中的法呢基
焦磷酸合酶、鲨烯合酶、鲨烯环氧酶和氧化鲨烯环化
酶等功能酶的作用是一致的 ,但这些功能酶的表达
水平或酶活性是否因存在差异而造成三萜基本骨架
含量差异尚未得知。目前的研究表明 ,对某些植物
来说 ,如青蒿 , FPS基因的过度表达确实可以提高次
级代谢产物的产率 [ 4, 5 ]。但由于以 FPP为底物合成
的产物众多 ,在不同植物中有差别 [ 6 ] ,所以 FPS的
高表达或者活性的提高能否提高三七三萜化合物的
生成量仍待探索 ,还需要做更多的工作。
下一步要进行的是对原核表达的 FPS蛋白进
行纯化 ,再分析其结构和特性。采用 W estern blot2
ting技术 ,利用原核表达的 FPS蛋白制备抗体 ,可从
蛋白水平上研究三七或其它同属植物 FPS的表达
状况 ,比较不同植物中 FPS的表达是否存在差异 ,
导致后续产物量的改变 ; FPS高表达高活性的三七
植株 ,其三萜皂苷的合成量是否比普通植株高。从
而进一步明确 FPS在植物三萜合成中的生物学
意义。
通过对原核表达载体 pET32a ( + ) /FPS的构建
及 FPS蛋白的成功表达 ,为 FPS的进一步纯化 ,制
备抗体及进行结构和功能的研究奠定基础 ,同时也
为深入探讨 FPS的催化机制和三七三萜皂苷合成
途径提供可能。
参 考 文 献
1　 Szkop inska A, Plochocka D. Acta B iochim Pol, 2005, 52 ( 1 ) : 45
～55.
2　陈莉 ,吴耀生. 国外医药·植物药分册 , 2004, 19 (4) : 15～161.
3　 赵玉军 ,叶和春 ,李国风 ,等. 科学通报 , 2003, 2 ( 48 ) : 162
～166.
4　 Chen DH, Ye HC, L i GF. Plant Science, 2000, 155: 179～185.
5　 Chen DH, L iu CJ, Ye HC, et al. Plant Cell, Tissue and O rgan
Culture, 1999, 57: 157～162.
6　 Angela M, Montserrat A, David M, et al. Plant J, 2002, 30 ( 2) :
123～132.
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