全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
植物丙酮酸磷酸双激酶的分子生物学和
基因工程研究进展
张桂芳 1 　王金明 2 　赵明 3 　丁在松 3
(1 北京师范大学 ,北京 100875; 2 吉林省农业科学院水稻研究所所 ,公主岭 136100;
3中国农业科学院作物科学研究所 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　丙酮酸磷酸双激酶是 C4 光合途径中的专一性酶 ,在 C4 光合作用中起着重要作用。综述了植物丙酮酸磷酸双
激酶基因结构、基因进化、表达调控机理 ,概述了植物丙酮酸磷酸双激酶基因工程在植物光合生理方面的研究进展。
关键词 : 　丙酮酸磷酸双激酶 　分子生物学 　基因工程 　研究进展
Progress of PPDK in the Area of M olecular
Biology and Gene Engineer ing
Zhang Guifang1 　W ang J inm ing2 　Zhao M ing3 　D ing Zaisong3
(1 Departm ent of L ife Science, N orm al University of B eijing, B eijing 100875; 2 Institute of R ice, J ilin Academ y of Agricultrual Science,
Gongzhuling 136100; 3 Institu te of Crop Sciences, China Academ y of Agricultural Sciences, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　Pyruvate orthophosphate dikinase ( PPDK) is a key enzyme of C4 photosynthesis pathway1 It p lays an important role in
C4 photosynthesis1 The gene structure, gene evolution, gene exp ression and gene regulation and control of PPDK were reviewed in this
paper, meanwhile, the PPDK gene engineering on p lant photosynthetic physiology were also introduced1
Key wo rds: 　Pyruvate orthosphate dikinase　Molecular biology　Gene engineering　Research p rogress
收稿日期 : 2008212216
基金项目 :国家自然科学基金 (30370853)
作者简介 :张桂芳 (19652) ,女 ,博士 ,研究方向 :植物转基因 ; E2mail: zhangguifang@bnu. edu. cn
　　丙酮酸磷酸双激酶 ( pyruvate orthophosphate
dikinase, PPDK)是植物 C4 光合途径中的专一性酶 ,
它催化固定 CO2 最初受体 PEP的再生。对 F laveria
biden t植物的反义 PPDK分析表明 ,此酶控制的反应
是 C4 光合途径的一个关键限速步骤 [ 1 ]。现已对许
多植物丙酮酸磷酸双激酶基因进行了分离克隆和测
序 ,并对它们的结构、调节和进化作了详尽的研
究 [ 2～6 ]。很多学者通过转基因方法成功地将外源丙
酮酸磷酸双激酶基因导入植物 ,提高了转基因植物
中丙酮酸磷酸双激酶活性 ,并且这些植物在一定程
度上表现出了目的生理性状。在此基础上对国内外
植物丙酮酸磷酸双激酶分子生物学及基因工程的研
究进展进行了综述。
1　植物丙酮酸磷酸双激酶基因结构
到目前为止 ,已经从细菌、原生生物和高等植物
中克隆了其 ppdk基因。对于一些高等植物的 ppdk
基因研究较多 ,如水稻、玉米、高粱和 F laveria属双
子叶植物。研究表明 :所有植物的 ppdk基因的序列
高度 相 似。例 如 , F laveria 属 植 物 中 C4 植 物
F1 trinervia和 C3 植物 F1pring lei的 cDNA s相似性为
94% ,两者 PPDK成熟蛋白区相似性高达 96% [ 7 ]。
目前的研究认为 ppdk基因包括 C4 型和胞质型两种
类型。C4 型 ppdk与胞质型 ppdk基因的主要区别在
于 C4 型 ppdk基因包含一个转运肽序列 ,该转运肽
引导 C4 型 ppdk基因在叶绿体中特异性表达 ;两者
在其它编码区序列基本一致。
玉米中 ppdk基因是双拷贝的。其中一个只编
码胞质型 PPDK;另一个基因根据不同的转录起始
位点既编码 C4 型 ppdk也编码胞质型 PPDK,胞质
型 ppdk基因的启动子和转录起始点位于 C4 型 pp2
2009年第 8期 王金明等 :植物丙酮酸磷酸双激酶的分子生物学和基因工程研究进展
dk基因的第一个内含子中。有研究表明产生两个
不同的 mRNA s是由于不同的启动子 ,而非不同的
mRNA s剪辑导致。而在 F laveria属植物中 PPDK
仅以单拷贝的形式出现 , C4 型 PPDK和胞质型 PP2
DK均由同一个 ppdk基因编码。玉米的 C4 型 ppdk
基因由 19个外显子和 18个内含子构成 ,外显子长
度在 58～430 bp之间 ,而内含子长度在 78～519
kb之间 ;水稻中的类 C4 型 ppdk基因包含 21个外
显子 , 20个内含子。第一个外显子仅包含 5′非编
码区 ,第二个外显子由 45 bp的 5′非编码区和 225
bp的转运肽编码区组成 ,外显子和内含子的长度
分别为 57～345 bp及 81～1 458 bp ,第二个内含
子长度较大。两者的外显子 2内含子结构极为相
似 ,区别在于水稻类 C4 型 ppdk基因比玉米 C4 型
ppdk基因多两个内含子。
在 F laveria属 C4 植物的 ppdk基因的相同位置
也发现了两个额外的内含子 : F laveria属中 C4 植物
F1 trinervia核基因由 21个外显子和 20个内含子构
成。这表明 ,在单子叶和双子叶植物分化前 ,这两个
额外的内含子可能就存在 ,在向 C4 植物进化过程中
这两个额外内含子丢失。此外 , F laveria属 C4 植物
ppdk基因的第 14个内含子与外显子交界处序列为
“GC⋯AG”,其余内含子和外显子的交界处均存在
“GT⋯AG”的核苷酸序列 ,玉米的 C4 型 ppdk基因中
也存在同样的现象。研究发现在 F1 trinervia的转运
肽区和成熟蛋白区间有一约 611 kb的插入序列 ,而
在玉米的这两个区之间也存在一插入序列 ,大小约
为 519 kb,在已知的所有植物 ppdk基因的外显子 1
和外显子 2之间均存在一插入序列 ,该序列并不编
码任何蛋白 ,但是在该区存在有许多重复序列。
在玉米 ppdk基因的 5′侧翼序列 ,位于 - 30区
存在 1个典型的 TAT元件 , - 70区附近有 1个 AT2
AGG序列 ,与 CCAAT序列反向相似 ;在基因的 - 51
～ - 42区存在 1段 GTCGCGCCC特征序列 ;在其 5′
侧翼序列 - 286 ～ - 172 区存在 3个长的重复序
列 [ 7, 8 ] ,这 3个序列相邻 ,其同源序列位于上游的 -
780～ - 766、- 307～ - 298及下游的 - 108至 - 99。
这些多样的元件也存在于玉米的 pepc基因的启动
子区 ,可以引导基因在玉米绿色叶片的叶肉细胞中
特异表达。对玉米 ppdk基因启动子的 cis反应元件
分析发现 , C4 型 ppdk基因启动子 - 347～ - 44区存
在一个 300 bp的区域 ,当把该区插入黄化或正在生
长的原生质体的启动子时 ,叶片表现特异性、调节和
光诱导特性。其中最重要的是一含 29 bp区 ,该区
包含一对 7 bp反向重复序列的。试验表明 ,删除该
反应元件启动子后 PPDK蛋白活性会降低 10倍 ;仅
从绿色叶片中分离出此元件 ,而在黄化叶及根中没
有检测到该元件。
2　植物丙酮酸磷酸双激酶结构、功能和调控
到目前为止 ,从许多已知的 ppdk基因序列可以
推导出大量的 PPDK蛋白的氨基酸序列信息 ,并从
一些高等植物中得到了纯化的 PPDK蛋白 ,对它们
的结构有了一定程度的了解。
植物的 PPDK是一个同源四聚体结构 ,每个亚
基的分子量约为 94 kD。C4 植物和细菌中的 PPDK
蛋白的四级结构相差很大 ,在细菌中该酶是个同型
二聚体 [ 9 ] ,而在 C4 植物中 PPDK为一同源四聚
体 [ 10 ]。在一级结构上 ,植物的 PPDKs仅比细菌的
PPDKs多含一个转运肽序列外 ,其它区两者完全一
致。玉米 ppdk基因的 cDNA编码 947个氨基酸残
基 ,蛋白质分子量为 102167 kD,且成熟蛋白包含
876个残基 ,另外 71个氨基酸残基编码一个转运肽
蛋白 ,该转运肽主要负责把前体蛋白由胞质中运送
叶绿体中 ,而成熟蛋白则作为关键酶在 C4 植物光合
作用中起着重要作用 [ 11 ]。
Goss等 [ 12 ]报道在细菌 (B 1sym bisus)的 PPDK蛋
白的催化位点周围有一个 GGMTSHAAVVA序列 ,同
时 ,在高等植物玉米、水稻中及 F laveria属植物在其
催化及调节位点处发现有完全一样的序列 ;在细菌
中 ,该区的组氨酸残基接受 PEP中的磷酰基生成
ATP,而在高等植物中 ,组氨酸残基结合来自 ATP中
的焦磷酸基生成 PEP。原生生物中的 PPDK蛋白含
有一个与此相似的序列 : GGKTSHAAVVA [ 13 ]。在上
述所有的 PPDK蛋白中 ,此催化位点区可能形成一
个短的 а2螺旋 ,在其周围有两个含有打破 а- 螺旋
的残基 (如氨基已酸和精氨酸 ) 的反向翻转结
构 [ 14 ]。两个相邻的氨基已酸可以破坏蛋白的二级
结构 ,增加多肽链的可变性。值得注意的是 ,位于催
化位点组氨酸上游的两个氨基酸处发现一个苏氨酸
残基 ,这一残基在植物和细菌的 PPDK蛋白中均存
91
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
在。研究表明 ,玉米 PPDK的活性通过苏氨酸残基
的可逆磷酸化来调节 ,而在细菌和原生生物中 ,苏氨
酸残基的可逆磷酸化并不会导致 PPDK活性的变
化 ,其原因尚不清楚。
PPDK的表达主要在转录水平上调控 ,表现出
细胞特异性表达 ;此外 , PPDK的转录也受光的调
控 ,光照能增强 PPDK mRNA的稳定表达 [ 15, 16 ]。PP2
DK酶的活性受光照的调节 ,在光照下能迅速的被
可逆的蛋白磷酸盐所调控 ,而此蛋白磷酸盐是一双
功能调控蛋白的介质。
在 PPDK酶催化的 3步反应中 ,每一步反应都
是由位于该酶的 3个区域的中间区域表面的组氨酸
受体调节。 (1) E2H is + ATP E2H is2PP1AMP, ( 2 )
E2H is2PP1AMP + P ( i) E2H is2P + AMP + PP ( i) ,
(3) E2H is2P +丙酮酸 E2H is + PEP。前两步的反应
由位于 N2末端的活性部位催化 ,第 3步由位于 C2末
端的活性部分催化。当催化活性转移的时 ,中央部
分从一个末端向另一个末端转移。该酶的 X2晶体
结构表明两个连接可能导致它们可以共同运动 [ 17 ]。
C4 植物起源于 C3 植物 , C4 型 ppdk基因的进化
被认为是其中很重要的一步。玉米 ppdk基因在两
个启动子的驱动下 ,由两个不同的转录位点起始转
录出两个不同的转录本 ,大的转录本编码带有转运
肽的 C4 型 PPDK蛋白 ,小的转录本编码无转运肽的
胞质型 PPDK蛋白。同样 ,在水稻及双子叶植物
F laveria属中也存在一样的双启动子系统。
进化分析表明 ,玉米 C4 型 ppdk基因与同为禾
本科植物的水稻 C3 型 ppdk基因相似性要高于与双
子叶植物中的 C4 型 ppdk基因的相似性 [ 18 ]。玉米
C4 型起源于禾本科 C3 植物中的 ppdk基因 ,而 C4 双
子叶植物则起源于 F laveria属中的 C3 植物。对水
稻和玉米 PPDK转运肽蛋白序列分析表明 ,两者的
相似度极高 [ 18 ]。玉米和水稻 PPDK蛋白的高度相
似性暗示 ,玉米和水稻的 ppdk基因来自于禾本科植
物中 C3 和 C4 植物分化前的一个古老基因。
3　植物丙酮酸磷酸双激酶基因工程研究
进展
311　转 ppdk基因研究进展
到目前为止 ,人们已经成功地将玉米的 ppdk基
因导入 C3 植物烟草、马铃薯、拟南芥和水稻等中并
实现了 PPDK的过量表达。 Ishimaru等 [ 19, 20 ]将拟南
芥 RbcS启动子和 CaMV35S启动子控制的玉米 ppdk
基因转入拟南芥中 ,并在叶绿体中表达 ,转基因植株
中的 PPDK活性为对照的 4倍 ,表明 C4 单子叶植物
玉米的 C4 型 PPDK的转运肽在 C3 双子叶植物拟南
芥中也能起作用 ,转基因植株的 PPDK活性受转录
后水平和翻译水平的调控。他们还将玉米的 ppdk
基因转入马铃薯中 ,转基因植株的 PPDK活性比对
照高 514倍 ;同时引起了丙酮酸含量的损耗以及
PEP含量的轻微增高 ,而苹果酸的含量也大幅增加 ,
推测可能是由于提高了 PEPC的运转从而导致苹果
酸的形成。Fukayama等 [ 21 ]获得了转玉米 ppdk基因
水稻植株 ,转基因水稻的 PPDK活性高于对照 20
倍。此外 , Sheriff等 [ 22 ]将兼性 CAM植物 M esem bry2
an them um crysta llinu的质体 ppdk基因转入烟草 ,这
些转基因植株的叶片和种子中 PPDK的含量均得到
提高。为使 C4 植物光合作用基因的启动子区能够
在 C3 植物中充分发挥调控功能 ,把 C4 植物的 PPDK
核基因组导入 C3 植物 ,与由 Cab启动子驱动的 ppdk
基因 cDNA融合基因同时对水稻进行遗传转化。T0
代的 PPDK活性分析显示 :导入 Cab启动子驱动的
ppdk基因 cDNA的转基因水稻植株与对照相比 , PP2
DK活性最高只有几倍的提高 ;而导入 ppdk基因核
基因组的水稻 ,比对照的活性提高了几十倍 ,相当于
玉米中 PPDK活性的 40% ～50%。这可能是由于
ppdk基因的启动子及终止子 ,以及内含子 ,或它们
的联合作用 ,可以提高转录本的稳定性 ,从而提高
C4 酶的高效表达 [ 23 ]。
312　转 ppdk基因的生理作用
Ishimaru等 [ 19 ]发现 ,在转基因拟南芥中 , PPDK
活性的提高不影响 Rubisco和其它 C4 酶 ( PEPC、
NAD ( P) 2ME)的活性。在转基因马铃薯中 ,叶片中
PPDK活性与丙酮酸含量负相关而与苹果酸的含量
正相关。他们推测提高 PPDK活性可能使碳代谢发
生变化 ,引起部分 C4 型碳代谢。然而 ,可能由于
PPDK的表达是太低 ,转基因植株中碳代谢的改变
对光合作用的影响很少 ,在上述转基因植株中 , CO2
气体交换没有变化 [ 20 ]。高表达玉米 PPDK使转基
因水稻叶片的含 N量升高 ,但 Rubisco和叶绿素含
量下降 , CO2 同化速率下降 ,而 CO2 补偿点没有变
02
2009年第 8期 王金明等 :植物丙酮酸磷酸双激酶的分子生物学和基因工程研究进展
化 ,在乳熟期的种子中也发现 PPDK的高表达 ,但对
糙米的含 N 量和 C /N 没有影响。 Sheriff等 [ 22 ]发
现 ,当 PPDK在质体中表达时 ,转基因烟草的在每个
蒴果中的种子数比野生型多 ,蒴果也更重。当除去
转运肽序列使 PPDK在细胞质中表达时 ,转基因植
株产生的种子比野生型少 ,高表达的转基因植株几
乎不产生种子。所有转基因植株的种子和叶片中游
离氨基酸的比例都与野生型不同 ,但根的游离氨基
酸没有变化。袁莉民等 [ 24 ]发现 ,转基因 PPDK品系
的叶鞘维管束组织不及对照发达 ,但叶片上气孔密
度和气孔总面积高于对照 ,其秧苗干重也显著高于
对照品种。张建福等 [ 25 ]研究发现 ,具有玉米 ppdk
基因的转基因植株在温室条件下可以促进氮的吸收
和对氮的同化 ,同时在一定程度上可以提高转基因
植株的收获指数。
4　展望
迄今 ,许多学者已经将玉米及其它 C4 植物中丙
酮酸磷酸双激酶基因导入了 C3 植物中 ,如水稻、烟
草、拟南芥等。尽管转基因植株中 PPDK的活性有
所提高 ,但是对光合作用的影响甚少。要使转基因
植株真正获得较高的光合速率还有很长的路要走 ,
还需要植物生理学、植物分子生物学、植物基因工程
和植物遗传育种等多学科密切合作。
参 考 文 献
1　 Trevanion SJ, Furbank RT, A shton AR1 Plant Physio, 1997, 113:
1153～11651
2　 Sheen J1 Plant Cell, 1991, 3 (3) : 225～2451
3　 Chastain CJ, Fries JP, Vogel JA, et al1 Plant Physiol, 2002, 128
(4) : 1368～13781
4　 Matsuoka M1 Plant Cell Plysiol, 1995, 36 (6) : 937～9431
5　 M surice SB Ku, Yuriko KM, Matsuoka M1 Plant Physiol, 1996,
111 (4) : 949～9571
6　 Matsuoka M1 J B iol Chem, 1990, 265 (28) : 16772～167771
7　 Rosche E, W esthoff P1 PlantMol B iol, 1995, 29: 663～6781
8　 Glackin CA, Grula JW1 Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87: 3004
～30081
9　 M ilner Y, M ichaels G, Wood HG1 Methods Enzymol, 1975, 42: 199
～2121
10　Sugiyama T1 B iochem istry , 1973, 12: 2862～28681
11　Matsuoka M, Ozekl Y, Yamamoto N, et al1 J B iol Chem, 1988,
263: 11080～110831
12　Goss NH, Evans CT, Wood HG1 B iochem istry, 1980, 19: 5805
～58091
13　Saavedra2L ira E, Perez2Montfort R1 Gene, 1994, 142: 249～2511
14　Matsuoka M1 The Journal of B iological Chem istry, 1990, 265 ( 28) :
16772～167771
15　 Sheen JY, Bogorad L1 J B iol Chem, 1987, 262 ( 24 ) : 11726
～117301
16　Hudspeth RL, Glackin CA, Bonner J, et al1 Proc Natl Acad Sci
USA, 1986, 83: 2884～28881
17 　W ei M, L i Z, Ye D, Herzberg O, Dunaway2Mariano D1 J B iol
Chem , 2000, 275: 41156～411651
18　Matsuoka M1 Plant Cell Physiol, 1995, 36: 937～9431
19　 Ishimaru K, Ichikawa H, Matsuoka M, et al1 Plant Sci, 1997, 129:
57～641
20　 Ishimaru K, Ohkawa Y, Ishige T, et al1 Physiologia Plantarum,
1998, 103: 340～3461
21　Fukayama H, Tsuchida H, Agarie S, et al1 Plant Physiology, 2001,
127: 1136～11461
22　Sheriff A, Meyer H, R iedel E, et al1 Plant Sci, 1998, 136: 43～571
23　Fukayama H, Imanari E, Tsuchida H, et al1 Plant Cell Physiol,
2000, 41: 1121
24　袁莉民 ,仇明 ,王朋 ,等 1 中国农业科学 , 2006, 39 ( 5 ) : 902
～9091
25　张建福 ,谢华安 ,王国英 ,等 1分子植物育种 , 2006, 4 ( 5) : 655
～6621
12