全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 12期
二氢黄酮醇 4还原酶的生物信息学分析
陈大志 周嘉裕 李萍
(西南交通大学生命科学与工程学院,成都 610031 )
摘 要: 花色素苷是影响花色的主要色素, DFR是花色素苷合成的关键酶。采用生物信息学的方法分析已经在 Gen
Bank上注册的拟南芥、金鱼草、兰花、山茶、番茄、水稻、矮牵牛和玉米等植物的 DFR核酸及相应氨基酸序列, 并对其理化性
质、生化功能、系统发育关系和结构特征等进行预测。结果表明, 金鱼草和山茶 DFR定位于叶绿体, 矮牵牛 DFR定位于线粒
体, 山茶和矮牵牛 DFR都是跨膜蛋白。DFR拥有一个 NADB_Rossm ann superfam ily保守结构域和 co iledco il结构; 所构建的
DFR基因系统发育关系与形态学上的物种发育关系基本吻合; 螺旋和无规则卷曲是 DFR的主要二级结构元件; DFR的空间
结构分为两个部分, 松散 C末端和致密球状结构。
关键词: 花色素苷合成 DFR 生物信息学
B ioinformaticsAnalysis of Dihydroflavonol 4Reductase
Chen Dazh i Zhou Jiayu L i P ing
( Southw est J iaotong University, Schoo l of L ife Science and Eng ineering, Chengdu 610031)
Abstrac:t Anthocyanin is the m a in p igment to affect flow er co lo r, and DFR is a key enzym e in anthocyanin synthes is. In this
study, DFR from A rab idop sis thaliana, Antirrhinum m ajus, B romhead ia finlaysoniana, C am ellia sinens is, Lycop ersicon esculentum,
Oryza sativa, P etunia hybrid and Z ea m ays, wh ich w ere reg istered in GenBank, w ere ana lyzed and predicted by too ls o f b io informa tics
in the follow ing aspects: physica l and chem ical prope rties, b iochem ica l func tion, phy logeny, structure o f pro te in. The results as fo llow
ing: DFR from Antirrhinum majus and Cam ellia sinensis lie in chlorop last, P etunia hybr id DFR locates in m itochondr ia, both o fCam el
lia s inensis and Petunia hybrid DFR are transm em brane pro teins. DFR conta ins conserved NADB_Rossm ann superfam ily dom a in and
co iledco il structures; DFR gene phy logeny is in ag reem ent w ith m orpho log ical spec ies phy logeny in genera;l he lix and random co il
are pr ima ry secondary structural com ponen ts o f DFR; the spatia l structu re of DFR is div ided into tw o parts: loose ly Cte rm inus and
tightly spheripo l shape.
Key words: Anthocyanin synthesis DFR B io in fo rm atics
收稿日期: 20100513
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金 ( SW JTU09CX065 )
作者简介:陈大志,男,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l cdz19870104@ 163. com
通讯作者:李萍,女,教授,博士,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l wu _m engt ing@ 163. com
花色和果色是植物的重要遗传性状, 决定花卉
和果实的商品性和价值性 [ 1]。在高等植物中, 花色
和果色主要由类黄酮 ( flavono id)、类胡萝卜素 ( ca
roteno id)和甜菜色素 ( be tala in )三大色素决定 [ 2 ]。
而类黄酮中的花色素苷 ( anthocyan in)是影响花色的
主要色素,赋予花和果实除绿色之外的所有颜色,如
红色、粉红色、紫罗兰色和蓝色等, 特定条件下出现
黑色 [ 3]。二氢黄酮醇 4还原酶 ( D ihydro flavono l 4
Reductase, DFR)在不同花色形成中发挥关键作用,
它是将二氢黄酮醇转变为花色素反应的第一个酶。
在还原型辅酶 (N icot inam ide Adenine D inucleotide
Phosphate, NADPH )的参与下, DFR将 3种二氢黄酮
醇 ! ! ! 二氢杨梅黄酮 ( D ihydromyricetin, DHM )、二
氢栎皮黄酮 ( D ihydroqueretin, DHQ )和二氢堪非醇
( D ihydrokaemp fero ,l DHK )还原为相应的无色花色
素, 在花色素合成酶 ( Anthocyan id in Synthase, ANS )
和类黄酮 3O糖基转移酶 ( flavono id 3Oglucosy l
transferase, 3GT)的进一步催化下最终合成各异的花
色素苷 (图 1) [ 5]。
2010年第 12期 陈大志等:二氢黄酮醇 4还原酶的生物信息学分析
CH S.苯基苯乙烯酮合成酶; CH I.苯基苯乙烯酮黄烷酮异构酶; F3H.
黄酮 3∀羟基化酶; F3∀H.类黄酮 3∀羟基化酶; F3∀5∀H.类
黄酮 3∀5∀羟基化酶; ANS. 花色素苷合成酶; DFR.二氢
黄酮醇 4还原酶; 3GT.类黄酮 3O糖基转移酶
图 1 花色素苷合成途径 [4]
DFR属于 NADPH 依赖性的短链 DFR还原酶
超家族 [ 7] ,最早于 1985年由 O∀Reilly等从玉米 ( Z ea
may s)和金鱼草 (Antirrh inum majus)中分离出来 [ 8 ]。
随后, Be ld等 [ 9]在 1989年又以部分金鱼草 DFR表
型突变基因为探针分离了矮牵牛 (P etunia hybrida )
DFR基因。至今, 通过同源克隆等方法, 已经在拟
南芥 (Arab idop sis thaliana )、兰花 (B romhead ia f inlay
soniana)、山茶 (Camellia sinensis)、番茄 (Ly cop ersicon
esculentum )和水稻 ( Oryza sativa )等植物中分离了
DFR基因。 2003年 N akatsuka等 [ 10]分析了亚洲百
合品种 DFR基因的时空表达模式, 表明 DFR基因
仅在花色素苷着色器官中表达,并且控制花器官的
显色模式。 2000年 A ida等 [ 11]通过农杆菌介导的基
因转染法将 DFR基因转移到蓝猪耳中, 结果显示转
化了反义基因的株系花冠变成浅蓝色, 而转化了正
义基因的株系冠檐中的花色减少程度比冠筒的大。
2004年 Fukusaki等 [ 12]成功利用针对 CHS基因的
RNA干扰技术修饰了矮牵牛的花色,这项技术也可
能适用于 DFR基因。
本研究采用生物信息学的方法, 以拟南芥为重
点, 对金鱼草、兰花、山茶、番茄、水稻、矮牵牛和玉米
等植物的 DFR核酸及相应氨基酸序列的组成成分、
理化特性、亚细胞定位、转运肽、信号肽、跨膜结构
域、亲水性 /疏水性、功能结构域、co iledco il结构、系
统发育关系、二级结构和三级结构等进行预测和推
断, 以期为深入开展二氢黄酮醇 4还原酶的酶学特
性、花色素苷生物合成的分子机制等提供理论依据。
1 材料与方法
11 材料
数据资料来源于美国国立生物信息中心 ( N a
tional C enter fo r B io techno logy Information, NCBI)核
酸和蛋白质数据库中已经注册的 DFR核酸及相应
的氨基酸序列:拟南芥 (M 86359、AAA32783)、金鱼草
( X15536、CAA33543)、兰花 (AF007096、AAB62873)、
山茶 ( AB018685、BAA84939)、番茄 ( Z18277、CAA79
154)、水稻 (AB003496、BAA36183)、矮牵牛 ( X15537、
CAA33544)和玉米 (X05068、CAA28734)。
12 方法
用 Vector NT I Suite 8. 0[ 13 ]软件及 ProtParam[ 14]
和 ORF Finder[ 15]等在线工具分析核酸及相应氨基酸
序列的组成成分和理化性质,并查找核酸序列的开放
阅读框 (OpenReading Frame, ORF)和翻译;用在线工
具 TargetP 11[ 16]、S ignalP 30[ 17]、TMHMM 20[ 18]和
ProtScale
[ 14]完成蛋白质的亚细胞定位、转运肽、信号
肽、跨膜结构域和亲水性 /疏水性分析; 分别用
CDD
[ 19]和 CO ILS[ 14]在线工具分析蛋白质的功能结构
域和 coiledcoil结构;用 MEGA 41[ 20]软件对核酸及
相应氨基酸序列进行多序列比对和系统发育分析;
SOPMA
[ 21]和 SW ISSMODEL[ 22]等在线工具被用来预
测蛋白质的二级结构和三级结构。
2 结果和分析
21 不同植物 DFR核酸及相应氨基酸序列的组成
成分和理化性质分析
用 V ectorNTI Su ite 80、Pro tParam和 ORF Finder
分析不同植物 DFR的核酸及相应的氨基酸序列 (表
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
1)。不同植物 DFR基因的全长均包括 5∀/3∀非编码
区 ( untranslated reg ion, UTR )和一个开放阅读框,由于
不同植物 DFR基因的全长不同,所以 UTR的长度有
较大差异。ORF的起始密码子均为 ATG, 终止密码
子为 TAG、TGA或 TAA。
不同植物 DFR氨基酸碱基数不同, 导致 DFR
分子量存在差异。然而, 不同植物 DFR等电点均
小于 7, 酸碱平均系数也都大于 1, 这些表明 DFR
为酸性蛋白; 含量最丰富的氨基酸基本均为 A la、
G lu、Leu、Lys和 V a,l并且都不含有 Pyl和 Sec, 属于
稳定类蛋白质。
表 1 不同植物 DFR核酸及相应氨基酸序列的组成成分和理化性质
组成成分和理化性质 拟南芥 金鱼草 兰花 山茶 番茄 水稻 矮牵牛 玉米
基因全长 ( bp) 2 294 1 608 1 272 1 420 1 651 1 480 1 471 4 467
开放阅读框 ( bp) 1 155 1 341 1 056 1 044 1 140 1 119 1 122 1 074
起始位点和密码子 ( bp) 520, ATG 17, ATG 8, ATG 117, ATG 94, ATG 105, ATG 99, ATG 1 843, ATG
终止位点和密码子 ( bp) 2 099, TAG 1 357, TAG 1 063, TGA 1 160, TAA 1 233, TAG 1 223, TGA 1 220, TAG 3 277, TAA
5∀ /3∀非编码区长度 ( bp) 519 /195 16 /251 7 /209 116 /260 93 /418 104 /257 98 /251 1 842 /1 190
氨基酸碱基数 384 446 351 347 379 372 373 357
分子量 ( kD) 4299 4963 3947 3869 4243 4040 4183 3886
等电点 544 496 578 602 608 535 619 548
含量最丰富的氨
基酸 (% )
Glu( 781)
Ser( 781 )
Leu( 755)
Lys( 755)
G lu( 852)
Ile( 830)
Lys( 785)
Leu( 740 )
Ser( 740 )
Leu ( 855 )
Lys( 855)
Val( 826)
A la( 741)
G lu( 741 )
Leu ( 778)
Lys( 778 )
A la( 720 )
S er( 720)
V al( 720 )
Lys( 844 )
A la( 818 )
L eu( 739)
G lu ( 686)
Ile( 686)
Ser( 686)
Thr( 686 )
A la( 941)
G ly( 914)
Val( 887)
Leu( 860)
A la( 831)
Leu( 831 )
Lys( 804)
G lu( 670)
Val( 670)
A la( 1092 )
L eu( 868)
G ly( 812)
Val( 756)
不含有的氨基酸 Py,l Sec Py,l S ec Py,l S ec Py,l S ec Py,l Sec Py,l Sec Py,l Sec Py,l Sec
酸碱平均系数 114 150 118 113 114 136 112 122
蛋白质不稳定性
指数 (% )
3780,属于
稳定类蛋白
3696,属于
稳定类蛋白
3088,属于
稳定类蛋白
3283,属于
稳定类蛋白
3284,属于
稳定类蛋白
3697,属于
稳定类蛋白
3429,属于
稳定类蛋白
3578,属于
稳定类蛋白
22 不同植物 DFR的亚细胞定位、转运肽、信号肽
和跨膜结构域分析
用 Target 11分析不同植物 DFR的亚细胞定位
和转运肽 (表 2)。金鱼草和山茶 DFR定位于叶绿
体,且分别含有 45个和 41个氨基酸的转运肽。矮
牵牛 DFR定位于线粒体, 含有 8个氨基酸的转
运肽。
用 S ignalP 30分析不同植物 DFR的信号肽
(表 2)。矮牵牛 DFR的 N端存在 18个氨基酸的信
号肽, 剪切位点在 A 18 - A19之间 (分值为 0683)。
用 TMHMM 20分析不同植物 DFR的跨膜结
构域 (表 2)。山茶和矮牵牛的 DFR横跨膜内外, 跨
膜结构域分别位于 A 7 - A29和 A7 - A 26。
结合上述分析,可以推断不同植物 DFR的催化
作用不都发生在细胞质基质中。金鱼草和山茶
DFR在细胞质中合成后, 在转运肽的引导下进入叶
绿体。其中金鱼草 DFR在叶绿体基质中, 由特异的
蛋白水解酶切去转运肽成为成熟蛋白质后发挥催化
作用,而成熟的山茶 DFR与细胞器膜脂结合后发挥
作用。同样,矮牵牛 DFR前体被合成后, 在转运肽
的引导下进入线粒体,在基质中被水解为成熟蛋白
质, 与细胞器膜脂结合后发挥作用。
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2010年第 12期 陈大志等:二氢黄酮醇 4还原酶的生物信息学分析
表 2 不同植物 DFR的亚细胞定位、转运肽、信号肽和跨膜结构域
植物 长度 ( bp) 叶绿体转运肽分值
线粒体转
运肽分值
其它部位转
运肽分值 定位 可信度
转运肽长度
( bp)
信号肽长度
( bp)
跨膜域位置
拟南芥 384 0064 0282 0387 ! 5 ! ! !
金鱼草 446 0714 0059 0455 叶绿体 4 45 ! !
兰花 351 0045 0204 0782 ! 3 ! ! !
山茶 347 0379 0072 0306 叶绿体 5 41 ! 7- 29
番茄 379 0165 0101 0858 ! 2 ! ! !
水稻 372 0031 0216 0441 ! 4 ! ! !
矮牵牛 373 0016 0563 0077 线粒体 4 8 18 7- 26
玉米 357 0044 0284 0604 ! 4 ! ! !
23 不同植物 DFR的功能结构域和 co iledco il结
构分析
用 CDD分析不同植物 DFR的功能结构域 (表 3)。
植物 DFR都包含一个 NADB_Rossmann superfam ily保
守结构域,通过 Rossmann折叠与 NADPH结合。
用 COILS分析不同植物 DFR的 co iledco il结构
(表 3)。所有植物 DFR都含有 co iledco il结构。拟
南芥、山茶、矮牵牛和玉米的 coiledco il结构位于
NADB_Rossm ann superfam ily保守结构域中,表明这
些 co iledco il结构可能与 NADPH等辅助因子的识
别有关。另外, 山茶和矮牵牛 DFR中的 co iledco il
结构还可能在细胞器与外界环境之间的物质和信息
交换中发挥重要作用 [ 23]。金鱼草、兰花、番茄和水
稻的部分 co iledco il结构位于 NADB_Rossmann su
perfam ily保守结构域外, 表明这些结构可能与其它
因子相互作用 [ 23]。
表 3 不同植物 DFR功能结构域和 coliedcoli结构
植物 功能结构域 位置 coliedcoli结构位置
拟南芥 NADB_Rossm ann superfam ily 7- 325 54- 67, 133- 146
金鱼草 NADB_Rossm ann superfam ily 20- 337 179- 193, 320- 333,
353- 367, 395- 418
兰花 NADB_Rossm ann superfam ily 9- 327 57- 76, 332- 351
山茶 NADB_Rossm ann superfam ily 14- 333 175- 189, 265- 278
番茄 NADB_Rossm ann superfam ily 19- 286 177- 197, 317- 330
水稻 NADB_Rossm ann superfam ily 9- 278 168- 181, 310- 323
矮牵牛 NADB_Rossm ann superfam ily 10- 328 168- 188, 311- 324
玉米 NADB_Rossm ann superfam ily 9- 331 59- 73, 310- 327
24 不同植物 DFR的亲水性 /疏水性分析
用 ProtSca le分析不同植物 DFR的亲水性 /疏水
性 (表 4)。亲水性氨基酸和疏水性氨基酸均匀分布
在整条肽链中,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸,总
分值均小于 0, 据此可认为 DFR是亲水性蛋白。但
玉米 DFR的亲水性 /疏水性总分值较大, 没有表现
出明显的亲水性。此外,山茶和矮牵牛 DFR的跨膜
域都表现出了疏水性, 这也进一步验证了跨膜域结
构预测的正确性。
25 不同植物 DFR核酸及相应氨基酸序列的同源
性、比对和系统发育分析
用 B last程序对不同植物 DFR的核酸及相应氨
基酸序列进行同源性分析, 结果表明, 拟南芥 DFR
的核酸序列与其它植物的核酸序列有较高的同源
性。但拟南芥 DFR氨基酸序列与其它植物的氨基
酸序列有着更高的相似性,与金鱼草、兰花、山茶、番
茄、水稻、矮牵牛和玉米的相似性分别为 84%、
78%、86%、81%、80%、82%和 78%。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
表 4 不同植物 DFR的亲水性 /疏水性
植物 最大分值 最小分值 总分值 亲水性 /疏水性
拟南芥 A 190, 2511 A 142, - 2444 - 8605 亲水性蛋白质
金鱼草 A 202, 2411 A 346, - 3289 - 13610 亲水性蛋白质
兰花 A 192, 2800 A 343, - 2489 - 4118 亲水性蛋白质
山茶 A 198, 2511 A 101 A 102 A 254 A 255, - 2333 - 6129 亲水性蛋白质
番茄 A 202, 2411 A 52 A 53, - 2633 - 8250 亲水性蛋白质
水稻 A 191, 2478 A 140, - 2967 - 2961 亲水性蛋白质
矮牵牛 A 193, 2411 A 43 A 44, - 2678 - 7237 亲水性蛋白质
玉米 A 215, 2511 A 144 A 145 A 146, - 2411 - 141 亲水性蛋白质
用 MEGA 41对不同植物 DFR氨基酸序列进
行多序列比对分析。结果显示在不同植物中 DFR
氨基酸序列在很多区域有较高的相似性。DFR与
NADPH结合区域是高度保守的 [ 24] , DFR与底物结
合区域也是高度保守的 [ 25 ] (图 2)。
A部分是 NADPH结合区域, B部分是底物结合区域
图 2 DFR中的高度保守结构
根据不同植物 DFR氨基酸多序列比对结果, 结
合邻近连接法 ( Neighbor Jo in ing, NJ)用 MEGA 41中
的泊松校正模板构建系统发育树 (图 3)。DFR基因
系统发育分析结果与 Po lashock等 [ 25]和 L iew等 [ 26 ]的
结果基本一致。双子叶植物和单子叶植物分为两支,
同科植物聚在一起,如茄科的番茄和矮牵牛、禾木科
的水稻和玉米,但同属五桠果亚纲的拟南芥和山茶没
有聚在一起。由此看出, 基于 DFR氨基酸序列的系
统发育关系与形态学上的物种发育关系基本吻合,对
判断不同植物间的亲缘关系有一定的借鉴意义。
26 不同植物 DFR的二、三级结构分析
用 SOPMA对不同植物 DFR进行二级结构分
析,结果见表 5。在 DFR二级结构中, 螺旋和无规
则卷曲约占 80% ,而 转角和直链延伸约占 20%。
纵观蛋白质的整体结构, 螺旋和无规则卷曲是
DFR最主要的二级结构元件,而 转角和直链延伸
则散布于整个蛋白质中。
以 PDB数据库中已经注册的葡萄 DFR三维结
构模型为模板,用 SW ISSMODEL对拟南芥 DFR进
行三维结构同源建模,然后在 Rasmo l[ 27]软件中进行
序列编辑, 获得拟南芥 DFR三维结构模型 (图 4 )。
拟南芥 DFR的空间结构分为两个部分,松散 C末端
和致密球状结构。DFR与 NADPH辅助因子结合区
域和底物结合区域都存在于致密球状结构中。用同
样的方法对其它植物的 DFR进行同源建模也得到
了类似的结果。
210
2010年第 12期 陈大志等:二氢黄酮醇 4还原酶的生物信息学分析
图 3 DFR基因系统发育树
表 5 不同植物 DFR的二级结构
植物 螺旋
(% )
转角
(% )
直链延
伸 (% )
无规则
卷曲 (% )
拟南芥 3698 833 1432 4036
金鱼草 3610 516 1121 4753
兰花 4510 655 1368 3476
山茶 4236 605 1297 3862
番茄 3747 660 1398 4195
水稻 3817 833 1290 4059
矮牵牛 3887 724 1340 4048
玉米 4202 728 1261 3810
图 4 拟南芥 DFR的三维结构模型
3 结论和讨论
DFR作为花色素苷合成的关键酶而受到广泛
关注。基于生物学试验数据,由分子生物学和信息
科学技术相结合的生物信息学已成为后基因组时代
用于揭示和探索生命奥秘的重要方法。本研究应用
生物信息学的方法对拟南芥、金鱼草、兰花、山茶、番
茄、水稻、矮牵牛和玉米等植物的 DFR核酸及相应
氨基酸序列的理化性质、生化功能、系统发育关系和
结构特征等进行预测和分析,结论如下:
1)植物 DFR基因全长都包括 5∀/3∀非编码区和
一个开放阅读框。
2)不同植物 DFR的分子量存在差异,但皆为酸
性蛋白; 含量最丰富的氨基酸基本均为 A la、G lu、
Leu、Lys和 Va,l属于稳定类蛋白质。
3)金鱼草和山茶 DFR定位于叶绿体,分别含有
45个和 41个氨基酸的转运肽,山茶 DFR是跨膜蛋
白。矮牵牛 DFR定位于线粒体,含有 8个氨基酸的
转运肽和 18个氨基酸的信号肽,是跨膜蛋白。
4)植物 DFR都含有一个 NADB_Rossm ann su
perfam ily保守结构域和 co liedco li结构。
5)在植物 DFR氨基酸序列中,亲水性氨基酸和
疏水性氨基酸均匀分布在整条肽链中, DFR表现为
亲水性。
6)不同植物 DFR氨基酸序列间表现出较高的
相似性, DFR与 NADPH辅助因子结合区域和底物
结合区域都是高度保守的。
7)DFR基因系统发育关系与形态学上的物种
发育关系基本吻合,对判断不同植物间的亲缘关系
有一定的借鉴意义。
8)植物 DFR的二级结构由 螺旋、转角、延
伸链和无规则卷曲组成, 螺旋和无规则卷曲是
DFR的主要二级结构元件。
9)植物 DFR的空间结构分为两个部分, 松散
C末端和致密球状结构。DFR与 NADPH 辅助因子
结合区域和底物结合区域都存在于致密球状结
构中。
综上所述, 本研究为后期深入开展二氢黄酮醇
4还原酶的酶学特性、花色素苷生物合成的分子机
制等提供一定的理论参考依据。
211
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 12期
目前已有研究表明, DFR与底物结合区中的第
134位氨基酸直接决定底物的特异性, 并揭示大多
数植物的 DFR第 134位氨基酸是 A sp或 Asn, 但同
时也存在非 Asp或 A sn型 DFR[ 28]。相信进一步的
分子对接和选择性压力分析将有助于揭示 DFR第
134位氨基酸的变化如何影响 DFR与底物结合,并
更多的了解其它影响 DFR与底物或辅助因子相互
作用等因素。
参 考 文 献
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