全 文 ：氮素对羽叶决明缩合单宁及
相关酶活性的影响
王俊宏1 , 2 ,李艳春2 ,陈志彤1 , 2 ,黄毅斌1 , 2
(1.福建农林大学生命科学学院 ,福建福州 350002;2.福建省农业科学院农业生态研究所 ,福建福州 350013)
摘要:缩合单宁对牧草品质的影响极大 , 适量的缩合单宁含量对于提高牧草的利用率和营养品质非常重要。
研究以豆科牧草羽叶决明 Cassia nictitoms为材料 , 分析了氮素梯度处理后茎和叶中缩合单宁的含量及其生
物合成酶二氢黄酮醇还原酶(DFR)活性的变化特征。结果表明 , 羽叶决明叶片的缩合单宁含量高于茎 , 随
氮素的增加 ,叶片中缩合单宁含量从 14.78%下降到 1.14%;茎中从 4.62%开始降低 , 达到 0.98%后趋于稳
定;DFR活性表现出与缩合单宁相似的变化规律 , 二者在叶和茎中都呈显著(P<0.01)的二次曲线关系。
植株粗蛋白含量测定发现 ,随氮素的增加粗蛋白含量无显著增加(P>0.05)。因此 ,适当增加氮素的使用量
可以达到减少缩合单宁含量 ,从而提高羽叶决明的利用率和营养品质。
关键词:缩合单宁;羽叶决明;氮素;DFR
中图分类号:S541;Q945.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001-0629(2010)02-0099-05
① 　植物单宁(Vege table Tannin)又称植物多酚
(Plant Polyphenol),是广泛存在于植物体内的一
类多元酚化合物 ,根据单宁的结构特征将其分为
水解单宁(H T)和缩合单宁(CT)两大类[ 1-2] 。单
宁属于抗营养因子 ,能与蛋白质结合形成不溶性
复合物 ,高含量的单宁可与唾液黏蛋白结合并沉
淀 ,引起粗糙皱褶的收敛感和干燥感 ,产生涩味 ,
使组织产生收敛性 ,引起一系列不适反应 ,会大大
降低牧草的营养价值和动物的嗜食性[ 3] 。然而对
于反刍动物 ,饲粮中合理搭配含单宁的牧草可起
到保护蛋白质的作用 ,其中缩合单宁含量的高低
对牧草品质的影响极大。适量的缩合单宁含量 ,
可防止动物臌胀病的发生[ 4-5] , 减缓动物瘤胃微
生物对蛋白质降解的速度 ,提高豆科牧草的利用
率和营养品质[ 6] 。
近年来 ,饲草生产是国家食物安全与生态安
全的重要保障 ,牧草作为重大产业技术体系建设
之一 ,为现代畜牧业和现代农业的发展作出重要
贡献[ 7] 。新西兰等国家在传统的苜蓿 Med icago
sat iva或白三叶 Tri f ol ium repens 草地中混播一
定比例含单宁较高的牧草种 ,如红豆草 Onobry-
chis v icii f ol ia 和百脉根 Lotus corniculatus ,大大
提高了草地的生产力 ,降低了臌胀病的发病率 ,因
此适宜单宁含量已成为国外现代牧草育种的目
标[ 8] 。羽叶决明 Cassia nict itans 属于豆科决明
属 ,是一种热带多年生草本植物 ,具有明显的耐
瘠 、耐酸 、抗旱性强等特点 ,其鲜草 、干物质产量及
种子产量均明显高于 184 柱花草 Sty losanthes
guianensis ,抗病虫害能力也明显优于柱花草[ 9] 。
羽叶决明在初花期养分含量最高 ,粗蛋白含量达
15.9 %。但该品系也存在一些缺点 ,尤其是单宁
含量高造成鲜草适口性差 ,因此限制了羽叶决明
的大面积推广和在畜牧上的利用。研究发现施肥
能显著提高草地的生物量[ 10] ,同时土壤肥力可以
改变单宁的含量[ 11] ,为了进一步系统地了解氮素
与羽叶决明缩合单宁含量之间的关系 ,本研究对
羽叶决明做不同的氮素梯度处理 ,然后测定初花
期的缩合单宁含量变化以及合成缩合单宁的关键
酶二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)酶活性大小。
27 卷 02 期
Vol.27.No.02 草　业　科　学PRATACULTURAL SCIENCE 99-10302/2010
①收稿日期:2009-10-15基金项目:国家科技支撑计划课题(2008BADB3B08 、2008
BAD95B08);福建省农科院院青年科技人才创新基金(2008QB-14)作者简介:王俊宏(1983-),男 ,山西晋中人 ,在读硕士生 ,研究方向为植物生物化学与分子生物学。
E mai l:w ang 110@126.com通信作者:黄毅斌　E mail:ecohyb @163.com
1　材料与方法
1.1 植物材料　试验材料选用豆科牧草羽叶决
明 ATF2217 ,种子由福建省农业科学院农业生态
研究所提供。
1.2 试验设计　试验设定 7个氮素梯度水平为
不同的处理 ,即每千克干土中含氮量分别为 0 、
15 、30 、45 、60 、75 、90 mg ,分别表示为 CK 、A 、B 、
C 、D 、E 、F 。磷钾基肥均给予相同处理(P2O 5 :80
mg/kg ,K 2O :50 mg/kg), 肥料均使用分析纯的
(NH 2)2CO 、NaH 2PO4 、K 2SO4 。盆栽时每盆称取
8 500 g 红壤土放于网室内 ,播种约 2周后间苗 ,
留取长势较为一致的植株 ,期间保持相同的水分
供应 ,待其生长到初花期后分别测定新鲜茎和叶
中缩合单宁含量及 DFR酶活性。供试土壤中有
机碳含量为 11.00 g/kg ,碱解氮 、速效磷 、速效钾
的含量分别为 35 .01 、4.71 、69.86 mg/kg ,全氮为
0.039%, pH 值为 5 .04。
1.3 缩合单宁含量的测定　待植株长到初花
期时取样(茎叶分离),用香草醛盐酸法[ 12] 测定不
同处理的羽叶决明植株中缩合单宁的含量 ,首先
分别杀青 、烘干 、粉碎植株的茎和叶 ,用 1%HCl
的甲醇溶液提取样品 ,反应液为 5%香草醛的甲
醇溶液(含 4 %HCL)反应 20 min后 ,在 500 nm
处测吸光度。以儿茶素为标准样品 。
1.4 DFR酶活性测定　植物样品经液氮研磨
后 ,用 PBS 缓冲液提取 , PBS包括 137 mmoL/cm
NaCl ,8 .1 mmoL/cm Na2HPO 4 , 2.68 mmoL/cm
KC l和 1.47 mmoL/cm KH2 PO 4(pH 值 7.4)。
然后 15 000×g , 4 ℃离心 15 min ,取上清液备用 ,
做进一步分析。DFR酶活性测定参照 Deyu[ 13] 和
Mitsunori 等[ 14] 的方法 , 反应混合液包括 25
mmoL/cm Tris-HCl(pH 值 7.0), 4 mmoL/cm
NADPH , 100 μmol taxifolin (dihydroquercetin)
和蛋白样品。反应以加入 NADPH 开始 ,保证在
25 ℃下进行。之后在340 nm 下测NADPH 的氧
化率 ,通过 NADPH 的消光系数来计算 DFR酶
活性(6.22 mmoL/cm 。1个酶活力单位(1 U)相
当于在 25 ℃1分钟内氧化 1 μmoL 的 NADPH 。
1.5 植株全氮的测定　对植株的全氮含量(即
粗蛋白含量)用凯氏定氮法测定。
1.6 数据处理　采用 SPSS 13.0软件对不同处
理之间的数据进行方差分析和显著性检验 ,采用
Excel软件作图 。
2　结果与分析
2.1 叶中缩合单宁含量变化　羽叶决明叶片
中的缩合单宁含量随着氮素施用量的增加而呈现
下降趋势(图 1)。随氮素的增加 ,缩合单宁含量
从 14.78 %(CK)增加到 16.07%(A),随后持续
下降到 1.14 %(F),且各处理间差异极显著(P <
0.01)。
图 1　叶缩合单宁含量变化
　注:CK 、A、B、C 、D、E、F 分别指每千克干土中的含氮
量 ,即 0 、15、30 、45 、60、75 、90 mg 。下图同。
2.2 茎中缩合单宁含量变化　茎中缩合单宁
含量随氮素施用量的增加表现出先增加后减少 ,
之后趋于稳定(图 2)。随氮素施用量从 0增加到
30 mg/kg ,羽叶决明茎中缩合单宁含量从对照的
2.76 %增加到 4.62%(B),随后下降到 0.98%
(C),之后保持在一个相对恒定的水平(0.98%～
图 2　茎中缩合单宁含量变化
100 PRATACULTURAL SCIENCE(Vo l.27.No.02) 02/ 2010
1.14 %)。处理 C 与 E 、E 与 F 差异显著(P <
0.05),其余各处理差异极显著(P <0.01)。
　　另外 ,羽叶决明叶中缩合单宁的含量高于茎
中的含量(图 1 、图 2)。
2.3 DFR酶活性的变化　随氮素施用量的增
加 ,牧草叶片中缩合单宁合成的关键酶 DFR的活
性的变化总趋势为先增加后下降(图 3)。从活性
最高的 310.10 U/g(A)下降到 31.00 U/g(F)。
和叶片相比 ,茎中 DFR 活性下降到 52.88 U/g
(C)之后保持在一个相对恒定的水平(44.51 ～
57.29 U/g)。
图 3　叶 DFR活性变化
图 4　茎 DFR活性变化
2.4 植株粗蛋白含量的变化　粗蛋白(CP)的
含量并没有因为氮素的增加而大幅度的提高 ,只
是略微有所上升 ,在叶片的各个处理中 ,B和 C以
及 C和 D不显著(P >0.05);茎中 CK与 A 、A与
B 、B与 C 均不显著(P >0.05)(图 5 、图 6)。所以
氮素施用量的变化对植株粗蛋白的含量影响不
大 ,这与其他牧草的研究结果是一致的[ 15] 。
图 5　叶粗蛋白(CP)含量变化
图 6　茎粗蛋白(CP)含量变化
2.5 DFR活性与缩合单宁含量的相关关系
分析　缩合单宁的合成与 DFR的活性在不同的
组织中存在不同的相关关系(表 1), 但都呈显
著(P <0.01)的二次曲线关系 。叶片中当DFR酶
表 1　缩合单宁含量及 DFR活性相关关系的回归模型
植株部位 比较组合 回归模型 相关系数 F 值
叶片 DFR(x1)与缩合单(y1) y1 =-2.613E-06x1 2 +0.001 4 x1 -0.038 2 0.945 34.720＊＊
茎　 DFR(x2)与缩合单(y2) y2 =7.506E-06x2 2 -0.000 5 x2 +0.015 8 0.991 223.169＊＊
10102/ 2010 草　业　科　学(第 27 卷 02 期)
活性小于 240 U/g 时 ,缩合单宁含量随 DFR酶活
性的下降而减少 ,茎中 DFR酶活性处于60 ～ 80
U/g 内 ,缩合单宁随 DFR活性的降低而减少 。
3　讨论
3.1 羽叶决明缩合单宁的合成　研究表明缩
合单宁的合成受到氮素的影响 ,并且氮素对缩合
单宁的合成起到抑制作用 ,通过适当地增加氮素
的使用量可以达到减少缩合单宁含量的效果 ,同
时对植株的粗蛋白含量不会有明显的影响。也就
达到了在不改变羽叶决明基本营养品质的基础上
降低了缩合单宁的含量 ,从而提高它的适口性 ,为
缩合单宁含量的控制提供了理论依据。
3.2 DFR活性与缩合单宁含量的关系　缩
合单宁(又称原花色素)的合成是通过类黄酮生物
途径完成的[ 16-17] , 二氢黄酮醇-4-还原酶属于
NADPH 依赖性还原酶家族 ,催化二氢黄酮醇转
变为相应的不稳定无色花色素[ 18] ,在花色素苷的
形成过程中起重要作用[ 19] 。Forkmann等[ 20]研究
表明 DFR是类黄酮途径中的关键性酶 。本研究
中 ,随着 DFR活性的改变缩合单宁的含量也同步
变化 ,缩合单宁的合成与 DFR的活性在叶和茎中
都呈显著的二次曲线关系 ,叶片中当 DFR酶活性
小于 240 U/g 时 ,缩合单宁含量随DFR酶活性的
下降而减少 ,茎中 DFR酶活性处于 60 ～ 80 U/g
内 ,缩合单宁随 DFR活性的降低而减少 。这表明
DFR在羽叶决明缩合单宁的合成中起到关键性
作用 。
4　结论
本研究以豆科牧草羽叶决明为材料 ,通过对
不同的氮素处理后缩合单宁含量 、DFR酶活性 、
植株粗蛋白等内容在不同组织中的研究 ,得出以
下结论:
1)在羽叶决明的茎和叶中 , 7 个处理缩合单
宁含量的差异均呈极显著(P <0 .01)并且随着氮
素的不断增加 ,缩合单宁含量呈现下降趋势 ,叶中
从 A处理(14.78%)开始下降 ,在随后的 B 、C 、D 、
E 、F 处理中逐步降低 ,F 达到最低(1.14%);茎中
从 B处理(4.62%)开始急速下降 ,在C 、D 、E 、F 中
维持一个相对较低的水平(0.98 %)。
2)DFR活性的变化与缩合单宁呈现同步的
变化趋势 ,先增后降 ,和叶片的逐步降低相比较 ,
茎中 DFR活性从 B 开始下降 , C 、D 、E 、F 基本维
持在相对稳定的水平。
3)缩合单宁的合成与 DFR的活性在叶和茎
中都呈极显著的二次曲线关系 ,叶片中当 DFR酶
活性小于 240 U/g时 ,缩合单宁含量随 DFR酶活
性的下降而减少 ,茎中 DFR 酶活性处于60 ～ 80
U/g 范围内 ,缩合单宁随 DFR 活性的降低而减
少 。
4)粗蛋白的含量并没有随着氮素的增加而大
幅度的提高 ,基本上差异不显著(P >0.05),所以
氮素的变化对植株粗蛋白的含量影响不大 。
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Effects of nitrogen level on condensed tannins and activity
of related enzyme in Chamaecrasta nict itans
WANG Jun-hong1 , 2 , LI Yan-chun2 ,CHEN Zhi-to ng1 , 2 , HUANG Yi-bin1 , 2
(1 .College o f li fe sciences ,Fujian Ag riculture and Fo rest University ,Fujian Fuzhou 350002 ,China;
2.Agricultural Ecology Institute , Fujian Academy of Agriculture Sciences , Fujian Fuzhou 350013 ,China)
Abstract:Condensed tannins (CT)affect the quality of the fo rage great ly .Proper amount of CT could
improve the ut ilization rate and the nutri tio nal quali ty fo r the fo rage.Content o f the CT w as examined
wi th vanillic aldehyde , and the Dihydrof lavonol 4-Reductase(DFR)activity w as determined w ith real-
time monitor me thod af ter fert ili zing dif ferent level of ni t ro gen on legume fo rage , Chamaecrasta nict i-
tans .The condensed tannins decreased as nit rog en level increased , f rom 14 .78% to 1 .14% in leaves ,
f rom 4 .62% to 0.98% in stems.Change of DFR activity is similar to CT content .This implied that
increase ni trog en fert ili zer w ould decrease CT content , which is helpful to the quality o f the fo rage.
Key words:condensed tannins;Chamaecrasta nict i tans;nit rogen level;DFR
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