全 文 ：基金项目：国家自然科学基金项目 (No.31170652)
收稿日期：2013-10-21 接受日期：2013-12-30
Online system: http://www.jabiotech.org
农 业 生 物 技 术 学 报
Journal of Agricultural Biotechnology
2014, 22(5): 529~540
DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2014.05.001
葡萄风信子二氢黄酮醇 4-还原酶基因(DFR)的克隆与表达分析
焦淑珍 1，2 刘雅莉 1，2* 娄倩 1，3 姜玲 1，2
1旱区作物逆境生物学国家重点实验室(西北农林科技大学)/农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，杨凌 712100；
2西北农林科技大学林学院，杨凌 712100；3西北农林科技大学园艺学院，杨凌 712100
*通讯作者，lyl6151@126.com
摘 要 葡萄风信子(Muscari armeniacum)是一类重要的球根花卉，其花色呈现特殊的蓝色。花青素是影
响葡萄风信子蓝色形成的重要物质，与植物生长过程及人类/动物饮食密切相关。有关花青素生物合成
途径的研究已较为成熟，但由于葡萄风信子基因资源缺乏，其花色形成的机理目前尚不清楚。二氢黄酮
醇 4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)是植物花青素合成中的重要酶。本研究采用RACE技术
从葡萄风信子花瓣中克隆到两条DFR基因(MaDFR2a和MaDFR2b)，GenBank登录号分别为KJ619963和
KJ619964。序列分析表明，MaDFR2a和MaDFR2b全长 1 392 bp，包含一个长度为 76 bp的 5非翻译区和
215 bp的3非翻译区，均包括一个1 101 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF)，编码366个氨基
酸，氨基酸相似性为98%，与其他植物的DFR蛋白同源性较高。聚类分析表明，葡萄风信子DFR最先与
单子叶植物聚为一类。生物信息学分析表明，两个DFR蛋白可能为亲水性蛋白，均具有两个跨膜区，无
信号肽。亚细胞定位分析显示，两个DFR基因均定位于整个细胞中。α-螺旋和无规则卷曲是两个DFR
蛋白的主要二级结构元件。MaDFR2a和MaDFR2b编码的蛋白三级结构非常相似，中间形成一个裂沟，
可以进行催化反应。花青素含量测定显示，着色的花器官中花青素含量较高，根、茎、叶以及未着色的花
蕾中几乎检测不到花青素。荧光定量PCR分析发现，MaDFR2a和MaDFR2b在葡萄风信子花组织中表达
较高，根、茎和叶中微量表达；MaDFR2a和MaDFR2b均在未着色的花蕾时期开始表达，随着花色加深，在
完全着色的花中表达最高，此后逐渐降低，但MaDFR2b在未着色的花蕾期和完全着色的花中表达相对较
高。研究结果表明，DFR可能是影响蓝色葡萄风信子形成的重要基因。
关键词 花色，葡萄风信子，DFR，克隆，表达分析
Cloning and Expression Analysis of Dihydroflavonol 4- reductase Gene
(DFR) from Grape Hyacinth(Muscari armeniacum)
JIAO Shu-Zhen1, 2 LIU Ya-Li 1, 2* LOU Qian1, 3 JIANG Ling1, 2
1 State Key Laboratory of Crop Stress Biology in Arid Areas (Northwest Agriculture and Forestry University)/ Key Laboratory of Horticultural
Plant Biology and Germplasm Innovation in Northwest China, Ministry of Agriculture, Yangling 712100, China; 2 College of Forestry, Northwest
Agriculture and Forestry University,Yangling 712100, China; 3 College of Horticulture, Northwest Agriculture and Forestry University ,Yangling
712100, China
* Corresponding author, lyl6151@126.com
Abstract Grape hyacinth (Muscari armeniacum) is an important ornamental bulbous plant with increasing
economic, ornamental and scientific importance because of their outstanding blue color. Anthocyanins are
principal flower pigments in M. armeniacum, and indispensible in plant biology and human/animal diets.
Whereas anthocyanin synthesis is well characterized in numerous plants, the mechanism underlying the blue
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0 引言
花青素是一类重要的植物次生代谢产物，是植
物花瓣、果实等的主要呈色物质(Grotewol, 2006)，
同时作为昆虫和其他一些动物的引诱剂，对授粉和
种子传播也有作用(Clark, Verwoerd, 2011)。此外，
它还作为一类天然食用色素被广泛开发利用，对肿
瘤、癌症和心血管等疾病具有一定的预防作用
(Ross, Kasum, 2002; Hou, 2003; Tanaka et al.,
2008)。花青素的合成与积累过程与植物发育过程
密切相关，同时受结构基因和调节基因的控制
(Stommel et al., 2009)。
二氢黄酮醇 4–还原酶 (dihydroflavonol 4-
reductase, DFR)是花青素生物合成途径中的的关键
酶(李春雷等, 2009)，是一个重要的调控点。DFR属
于NADPH依赖性短链还原酶家族，可以选择性的
催化二氢山奈酚(dihydrokaempferol, DHK)、二氢槲
皮 素 (dihydroquercetin, DHQ) 和 二 氢 杨 梅 酮
(dihydromyricetin, DHM)在 C4位发生立体特异的
还原反应，分别生成无色花葵素(leucopelargonidin)、
无 色 花 青 素 (leucocyanidin) 和 无 色 花 翠 素
(leucodelphinidin)，然 后 在 花 色 素 苷 合 成 酶
(anthocyanin synthase ANS)和类黄酮3-O-糖基转移
酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase, 3GT)的作用下
合成各种花青素，使植物呈现不同的花色和果色
(Holton, Cornish, 1995; Shimada et al., 2005; Petit et
al., 2007)。1985年，O Reilly等采用转座子标签技
术从玉米和金鱼草中首次将 DFR基因分离出来
(OReilly et al., 1985)，1989年，Beld等又以金鱼草
DFR基因为探针分离了矮牵牛 DFR基因(Beld et
al., 1989)，随后从拟南芥，百合，番茄，康乃馨，草莓，
葡萄和大麦等多种植物中克隆了DFR基因(Zhang
et al., 2008; Tang et al., 2009)。DFR基因表达特性
研究表明，DFR基因在不同发育时期以及不同部位
的表达模式差异较大，矮牵牛的DFR-A基因在花
冠、花药及种子中表达量很高，在胚珠与茎中的表达
量较低(Huits et al., 1994)；亚洲百合品种DFR基因
仅在显色器官中表达，并且控制花器官的显色模式
appearance of M. armeniacum is still far from understanding for the little knowledge of gene information of
this plant. Here, two dihydroflavonol 4-reductase (DFR) genes, which encode a later enzyme for anthocyanin
formation, were isolated from Muscari armeniacum petals using RACE techniques and designated as
MaDFR2a and MaDFR2b(GenBank accession No. KJ619963 and KJ619964), respectively. Sequence analysis
of cDNAs revealed that the full length sequence was 1 395 bp, containing a length of 76 bp 5 untranslated
region and 215 bp 3 untranslated region，both of them contained a 1 101 bp open reading frame (ORF), which
encoded a protein of 366 amino acids. The similarity of the two DFR was 98%. Homology analysis showed
that the deduced DFR proteins were highly homologous to other DFR proteins from different plant species.
The cluster analysis results showed that the two DFR genes clustered together with monocotyledons firstly.
Bioinformatics showed that two DFR proteins were both hydrophilic proteins, containing two transmembrane
domains and neither of them had signal peptide. Subcellular localization analysis showed that two DFR genes
located in the whole cells. α-Helix and random coil were primary secondary structural components of the two
DFR genes. The tertiary structures of two DFR proteins were similar. Both of them had a fissure which could
do some catalytic reactions. High performance liquid chromatography (HPLC) analysis showed that high
contents of color anthocyanins were detected in pigmented flower organs, while no anthocyanins were
detected in root, stem, leaf and unpigmented flower buds. The result of Real- time fluorescence quantitative
PCR analysis demonstrated that the DFRs expression was presented in flowers but little or very weak
expression was also detected in the other tissues (leaf, stem and root). When flower pigmentation started, a
steep rise of two DFR genes expression occurred and peaked at fully coloured flowers. Subsequently a slight
decrease in the MaDFR2a and MaDFR2b expression was presented at later stage. In contrast, a relatively high-
level of MaDFR2b expression was found in both unpigmented or fully-pigmented buds. This result suggested
that DFR can play a role in the color formation of blue grape hyacinth.
Keywords Flower color, Muscari armeniacum, DFR, Cloning, Expression analysis
530
(Nakatsuka et al., 2003)。近期，利用DFR基因遗传
转化得到新颖的花色也取得了一定成效(Tanaka et
al., 1995; Johnson et al., 1999)。
葡萄风信子(Muscari armeniacum)是一种多年
生球根花卉，又名蓝壶花、葡萄百合、葡萄水仙，为
风信子科葡萄风信子属单子叶草本植物，其花序小
而精致，密生下垂，形似葡萄。由于葡萄风信子花
期长，适应性较强，花色呈现特殊的蓝色，园林中常
用于布置花镜，花坛镶边，点缀岩石园，亦作林下地
被，具有很大的经济效益(Qi et al., 2013)。此外，葡
萄风信子 40 多个种展现出不同程度的蓝色
(Doussi, Thanos, 2002)，为研究单子叶植物蓝色形
成机理提供了理想的材料。目前关于葡萄风信子
的研究主要集中于种球繁殖 (于忠美等, 2006;
Uranbey et al., 2010)，花期调控(于忠美等, 2006)，
组织培养(Nasircilar et al., 2011; Azad, Amin, 2012)，
遗传转化(许胜等, 2007)，解剖结构以及化学成分
分析(Qi et al., 2013)方面，有关葡萄风信子花青素
代谢分子基础的研究还未见报道。本课题组前期
建立了蓝色葡萄风信子和其白色变型的花组织转
录 组 数 据 库 (NCBI BioProject Accession:
PRJNA218154, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/
PRJNA218154)。
本研究以葡萄风信子为材料，根据前期获得的
DFR基因片段序列设计特异引物，利用RACE技术
从花瓣中克隆DFR基因cDNA全长，并通过实时荧
光定量PCR分析该基因在葡萄风信子不同组织中
的表达模式，分析该基因的特性及其在花色发育中
的作用，为进一步研究DFR基因的生物学功能和
加深对葡萄风信子蓝色花色形成分子机制的理解
提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
本研究于2013年在西北农林科技大学旱区作
物逆境生物学国家重点实验室进行。材料为西安
植物园提供的葡萄风信子(Muscari armeniacum)，于
2013年 3月从西安植物园挖出，种植于实验室阳
台。根据开花时间，将材料分为 5个发育时期，时
期1(S1)为完全未着色的花蕾；时期2(S2)为开始着
色的花蕾；时期3(S3)为完全着色未开放的花蕾；时
期4(S4)为完全开放的花蕾；时期5(S5)为衰败的花
蕾。分别采集花发育不同时期的花蕾、根、茎和叶，
于液氮中速冻后置于-80 ℃冰箱中备用。
实验中所用试剂：RNA提取试剂盒购自北京百
泰克生物技术有限公司；SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit 购 自 美 国 Clontech 公 司 ；
PrimeScriptTM RT reagent Kit ，pMD19- T，SYBR®
Premix Ex TaqTM Ⅱ为大连TaKaRa宝生物工程有限公
司提供；所用引物及测序由北京奥克生物公司完成。
1.2 方法
1.2.1 葡萄风信子总 RNA的提取与 DFR基因
cDNA全长的克隆
采用北京百泰克生物技术有限公司的多糖多
酚植物总RNA快速提取试剂盒从葡萄风信子的根、
茎、叶以及不同发育时期的花蕾(S1~S5)提取总RNA，
并电泳检测，同时参照Prime ScriptTMRT-PCR Kit试
剂盒(TaKaRa,日本)进行RT-PCR反应合成cDNA第
一链。
以葡萄风信子转录组测序获得的DFR序列片
段分别设计3RACE和5RACE引物MaDFR-3GSP
和MaDFR-5GSP引物(表 1)，参照Clontech公司(美
国)的RACE试剂盒对已经提取的RNA分别进行
RACE 反转录获得 5- RACE- Ready cDNA 和 3-
RACE-Ready cDNA，以之为模板，按照SMARTerTM
RACE cDNA Amplification Kit试剂盒快速扩增
cDNA末端，反应体系(25 µL)：cDNA模板 1.25 µL
(约 100 ng)，UPM(10×) 2.5 µL，GSP1与 GSP2 (10
µmol/L)各 0.5 µL，Master Mix(PCR- Grade Water
17.25 µL，10 × Advantage 2 PCR Buffer 2.5 µL，
dNTP Mix(10 mmol/L) 0.5 µL，50 × Advantage 2
Polymerase Mix 0.5 µL。反应程序为：94 ℃预变性
3 min，94 ℃变性 30 s，68 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 3
min；20循环，72 ℃延伸5 min。扩增产物用1%琼脂
糖凝胶电泳检测，回收纯化目的条带后，与pMD19-
T连接，16 ℃过夜连接，12 h后，将5 µL连接产物转
化 20 µL大肠杆菌 (Escherichia coli)感受态细胞
Top10中，经带有Amp的平板上筛选蓝白斑阳性克
隆，挑取白色菌落于100 mg/L Amp液体LB培养基
中，37 ℃，180 r/min培养 10~12 h，菌液PCR鉴定重
组质粒后，由北京奥科鼎盛测序部测序。测序后，将
获得的3和5片段进行拼接。拼接后的序列找到其
ORF并设计全长引物MaDFR-F和MaDFR-R(表1)，
葡萄风信子二氢黄酮醇 4-还原酶基因(DFR)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of Dihydroflavonol 4-reductase Gene(DFR) from Grape Hyacinth(Muscari armeniacum) 531
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Journal of Agricultural Biotechnology
以普通反转录 cDNA为模板，PCR扩增并测序后得
到葡萄风信子DFR基因的全长序列。
1.2.2 生物信息学分析
开放阅读框的查找用NCBI中的ORF Finder
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/) 在线工
具完成；利用ExPASy工具包中的ProtParam (http://
web.expasy.org/protparam/)程序分析核酸及编码的
氨基酸序列的组成成分及理化性质；同源序列的搜
索用NCBI数据库中的Blastp (http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) 完成，同时运用
DNAMAN软件对同源序列作多重比对；系统进化
树的构建运用MEGA5.0软件完成；运用 ProtScale
(http://web.expasy.org/protscale/) 在 线 工 具 预 测
DFR蛋白的亲水性/疏水性；利用 TMpred (http://
www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)
在线工具分析 DFR蛋白的跨膜结构域；利用
SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/) 分析信号肽；利用 PSORTⅡ Prediction
(http://psort.hgc.jp/form2.html) 在线工具进行亚细
胞定位分析；运用NetPhos 2.0 Server (http://www.
cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测DFR蛋白磷酸化
位点；DFR蛋白二级结构和三级结构由 SOPMA
(http://npsa- pbil.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?
page=/NPSA/npsa_sopma.html) 和 Phyre (http://
www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre/)在线工具完成。
1.2.3 DFR基因的亚细胞定位分析
在去除终止密码子的DFR基因的开放阅读框
两侧设计引物(表1)，分别加入XbaⅠ、KpnⅠ两个酶
切位点，扩增DFR序列，提取质粒，与载体PBI221-
GFP进行酶切连接，得到正确的重组质粒。
材料选用新鲜洋葱(Allium cepa)，于超净工作
台内剥取鳞片内表皮，接种于高渗培养基(MS无机
盐, 40 g/L甘露醇, 0.7%琼脂)平板上，预培养 4~6
h，供基因枪轰击用。参照Schwinn(2006)方法制备
基因枪微弹，同时参照 PSD-1000说明书，用 PDS
1000/He 型基因枪(Bio-Rad)轰击洋葱表皮。转化
完成后的材料转入等渗培养基(MS无机盐, 30 g/L
蔗糖, 0.7%琼脂)继续培养16 h后，用激光共聚焦荧
光显微镜(LSM-510META)进行观察并采集图像，
激发光波长为488 nm。
1.2.4 DFR基因的表达模式分析
将反转录得到的葡萄风信子根、茎、叶，以及不
同发育时期花蕾(S1~S5)cDNA作为模板，荧光定量
PCR在BIO-RAD Cycler IQ5荧光定量PCR仪上进
行，方法参照 TaKaRa公司的荧光定量试剂盒
SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书。反应体系(20
µL)：SYBR®Premix Ex TaqⅡ 10 µL，PCR正反向引
物 (10 μmol/L)各 0.8 µL，cDNA模板 1 µL(约 100
ng)，ddH2O 7.4 µL，反应程序为：94 ℃，3 min；94 ℃
15 s，58 ℃ 30 s，45个循环，每个反应重复 3次。定
量RT-PCR软件会自动生成溶解曲线，标准曲线和
扩增曲线。同时阀值(Ct值)由 IQ5软件自动产生。
每个样品设置3个生物学重复，mRNA的相对比值
引物名称
Primer
MaDFR-5GSP
MaDFR-3GSP
MaDFR-F
MaDFR-R
MaDFR2a-GFP-F
MaDFR2a-GFP-R
MaDFR2b-GFP-F
MaDFR2b-GFP-R
MaDFR2a-qRT-F
MaDFR2a-qRT-R
MaDFR2b-qRT-F
MaDFR2b-qRT-R
引物序列(5~3)
Sequence
CATCCATCCTGTCATCTTGACACGCCTG
CTCATCTCACCATCTGGAAGGCAGACCT
GGATCC ATGACGATGAAGATGGAGAAGGGG
GGTACC CTAGTGTGAAGCAATGGGAACATCC
TCTAGA ATGACGATGAAGATGGAGAA
GGTACC GTGTGAAGCAATGGGAACAT
GGTACC GTGTGAAGCAATGGGAACAT
GGTACC GTGTGAAGCAATGGGAACAT
GTCAAGATGACAGGATGGATGTATTTC
TGTGATCAATGATAACGCAGTGACCAT
GTCAAGATGACAGGATGGATGTATTTT
AGTGATCAATGATAATGCAGTGACCATGC
用途
Purpose
5RACE
3RACE
cDNA扩增
cDNA amplification
MaDFR2a-GFP亚细胞定位
Subcellular localization of MaDFR2a-GFP
MaDFR2b-GFP亚细胞定位
Subcellular localization of MaDFR2b-GFP
Real-time PCR of MaDFR2a
Real-time PCR of MaDFR2b
表1 葡萄风信子DFR基因克隆、亚细胞定位以及表达分析所用的引物
Table 1 Primer sequences of DFR gene used in cloning, subcellular localization and Real-time quantitative PCR
532
依据Livak和 Schmittgen(2001)进行计算。内参基
因为葡萄风信子Actin基因。取平均值运用Origin
8.0软件进行数据处理。定量RT-PCR反应引物序
列如表1所示。高效液相色谱法(HPLC)定性、定量
分析花青素含量(Qi et al., 2013)。
2 结果与分析
2.1 葡萄风信子DFR基因全长的克隆与序列特征
提取葡萄风信子花蕾总 RNA，电泳检测(图
1A)。如图 1所示，电泳条带有两条，28S rRNA和
18S rRNA，并且 28S rRNA 亮度和宽度是 18S
rRNA的两倍，说明提取的RNA没有发生降解，纯
度高，可用于RACE克隆以及RT-PCR反应。
根据转录组测序获得的DFR序列片段设计末
端特异引物MaDFR-5GSP、MaDFR-3GSP(表 1)，
以 5-RACE-Ready cDNA和 3-RACE-Ready cDNA
为模板，按照RACE试剂盒操作步骤，分别扩增得
到一条 595和 1 144 bp大小的条带(图 1B)。测序
后拼接，分析其完整的开放读码框并设计全长引
物MaDFR-F和MaDFR-R(表 1)，经过 PCR扩增得
到两条不同的 cDNA序列，分别命名为MaDFR2a
( 登 录 号: KJ619963) 和 MaDFR2b( 登 录 号:
KJ619964)(图 1C)。序列分析表明，MaDFR2a和
MaDFR2b全长均为 1 395 bp，包含一个长度为 76
bp的5非翻译区和215 bp的3非翻译区，均包括完
整的开放阅读框(ORF)，长度为1 101 bp，编码一个
含有 366个氨基酸的蛋白质。序列比对表明，
MaDFR2a和 MaDFR2b的氨基酸残基同源性为
98%(图 2)。用在线分析工具ProtParam分析表明，
MaDFR2a理论分子量为 40.98 kD，理论等电点为
5.86；MaDFR2b理论分子量为 41.00 kD，理论等电
点为5.75。蛋白不稳定系数分别为36.37和36.13，
均属于稳定蛋白。
2.2 葡萄风信子MaDFR2a和MaDFR2b编码的
蛋白同源性及其进化分析
在NCBI上将葡萄风信子cDNA推导的氨基酸
序列与其他20种植物DFR蛋白序列进行Blastp比
对，分析表明，MaDFR2a和 MaDFR2b与风信子
(Hyacinthus orientalis)的同源性最高，为 88%，与早
花百子莲 (Agapanthus praecox)、洋红百合 (Lilium
speciosum)、兰花(Bromheadia finlaysoniana)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana)等其他 19种植物DFR的同源
性都在66%~77%。对葡萄风信子DFR蛋白序列分
析发现，DFR基因在N端存在一个由 21个氨基酸
组成的 NADPH 结合位点“VTGAGGYIGSWL
VMKLLRGGY”和一个由 26个氨基酸残基组成的
底物特异性结合区“TVNVEERQKPEYDESAWSD
IEFCRRV”，该区域决定底物的特异性，并且在不
同植物中相对保守(图2)。
基于MaDFR2a和MaDFR2b氨基酸序列构建
系统进化树，结果显示，葡萄风信子DFR最先与单
子叶的早花百子莲、洋葱、石斛、兰花等聚为一类，
最后与拟南芥、芍药、月季等双子叶植物聚为一类
(图 3)。聚类分析表明，单子叶植物和双子叶植物
DFR蛋白聚为两大类，其中葡萄风信子DFR与单
子叶植物亲缘关系更近一些。系统进化树表明，
图1 MaDFR2a和MaDFR2b基因PCR扩增电泳检测
Figure 1 Agarose gel electrophoresis analysis of MaDFR2a andMaDFR2b
A：葡萄风信子花瓣RNA电泳检测，1~3：花瓣RNA的3个重复；B：DFR 5RACE和3RACE扩增结果，M：DNA标准分子量
(Trans2K Plus)，1：5RACE产物，2：3RACE产物；C：DFR cDNA全长扩增产物，M：DNA标准分子量(Trans2K Plus)，1：MaD⁃
FR2a cDNA全长扩增结果，2：MaDFR2b cDNA全长扩增结果
A: Agarose gel electrophoresis of RNA from M.armeniacum petals, 1~3: Three replications; B: Amplified results of 5RACE and
3RACE, M: DNA marker (Trans2K Plus), 1: The product of 5RACE, 2: The product of 3RACE; C: The full length of DFR cD-
NA amplification, M: DNA marker(Trans2K Plus), 1: The product of MaDFR2a cDNA, 2: The product of MaDFR2b cDNA
葡萄风信子二氢黄酮醇 4-还原酶基因(DFR)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of Dihydroflavonol 4-reductase Gene(DFR) from Grape Hyacinth(Muscari armeniacum)
1 2 3
A
28S RNA
18S RNA
1 2M
B
1144
595
bp
2000
750
500
250
bp 1 2M
C
2000
750
500
1000 1101
bp bp
533
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Journal of Agricultural Biotechnology
图2 MaDFR2a和MaDFR2b与其他植物的DFR氨基酸序列比较
Figure 2 Amino acid sequence alignment among MaDFR2a, MaDFR2b and DFR from other plant species
氨基酸序列相同的部分用黑色阴影表示，相近的部分用灰色阴影表示；下划线位置分别为NADPH结合位点和底物特异区
结合位点
The same and similar amino acid residues are highlighted in black and gray, respectively; The underlined sequences are NADP-
binding site and substrate specificity domain, respectively
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2a
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2b
风信子 Hyacinthus orientalis (AFP58815.1)
早花百子莲 Agapanthus praecox (BAE78769.1)
洋红百合 Lilium speciosum (BAE79202.1)
油点草 Tricyrtis sp. Shinonome (BAN62761.1)
姜荷花 Curcuma alismatifolia (ADK62520.1)
小麦 Triticum aestivum (AAV83987.1)
荷兰鸢尾 Iris x hollandica (BAF93856.1)
洋葱 Allium cepa (AAO63026.1)
郁金香 Tulipa gesneriana (BAH98155.1)
山楂 Crataegus monogyna (AAX16491.1)
玉米 Zea mays (CAA75996.1)
圆叶葡萄 Vitis rotundifolia (AGJ70142.1)
石斛 Dendrobium hybrid cultivar ( CAR64530.1)
苹果 Malus domestica (AAO39816.1)
芍药 Paeonia lactiflora(AFI71899.1)
美丽翠雀花 Delphinium x belladonna (BAF49325.1)
拟南芥 Arabidopsis thaliana (AAA32783.1)
兰花 Bromheadia finlaysoniana (AAB62873.1)
草莓 Fragaria x ananassa (AAX12421.1)
月季 Rosa hybrid cultivar(BAA12723.1)
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2a
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2b
风信子 Hyacinthus orientalis (AFP58815.1)
早花百子莲 Agapanthus praecox (BAE78769.1)
洋红百合 Lilium speciosum (BAE79202.1)
油点草 Tricyrtis sp. Shinonome (BAN62761.1)
姜荷花 Curcuma alismatifolia (ADK62520.1)
小麦 Triticum aestivum (AAV83987.1)
荷兰鸢尾 Iris x hollandica (BAF93856.1)
洋葱 Allium cepa (AAO63026.1)
郁金香 Tulipa gesneriana (BAH98155.1)
山楂 Crataegus monogyna (AAX16491.1)
玉米 Zea mays (CAA75996.1)
圆叶葡萄 Vitis rotundifolia (AGJ70142.1)
石斛 Dendrobium hybrid cultivar ( CAR64530.1)
苹果 Malus domestica (AAO39816.1)
芍药 Paeonia lactiflora(AFI71899.1)
美丽翠雀花 Delphinium x belladonna (BAF49325.1)
拟南芥 Arabidopsis thaliana (AAA32783.1)
兰花 Bromheadia finlaysoniana (AAB62873.1)
草莓 Fragaria x ananassa (AAX12421.1)
月季 Rosa hybrid cultivar(BAA12723.1)
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2a
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2b
风信子 Hyacinthus orientalis (AFP58815.1)
早花百子莲 Agapanthus praecox (BAE78769.1)
洋红百合 Lilium speciosum (BAE79202.1)
油点草 Tricyrtis sp. Shinonome (BAN62761.1)
姜荷花 Curcuma alismatifolia (ADK62520.1)
小麦 Triticum aestivum (AAV83987.1)
荷兰鸢尾 Iris x hollandica (BAF93856.1)
洋葱 Allium cepa (AAO63026.1)
郁金香 Tulipa gesneriana (BAH98155.1)
山楂 Crataegus monogyna (AAX16491.1)
玉米 Zea mays (CAA75996.1)
圆叶葡萄 Vitis rotundifolia (AGJ70142.1)
石斛 Dendrobium hybrid cultivar ( CAR64530.1)
苹果 Malus domestica (AAO39816.1)
芍药 Paeonia lactiflora(AFI71899.1)
美丽翠雀花 Delphinium x belladonna (BAF49325.1)
拟南芥 Arabidopsis thaliana (AAA32783.1)
兰花 Bromheadia finlaysoniana (AAB62873.1)
草莓 Fragaria x ananassa (AAX12421.1)
月季 Rosa hybrid cultivar(BAA12723.1)
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2a
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2b
风信子 Hyacinthus orientalis (AFP58815.1)
早花百子莲 Agapanthus praecox (BAE78769.1)
洋红百合 Lilium speciosum (BAE79202.1)
油点草 Tricyrtis sp. Shinonome (BAN62761.1)
姜荷花 Curcuma alismatifolia (ADK62520.1)
小麦 Triticum aestivum (AAV83987.1)
荷兰鸢尾 Iris x hollandica (BAF93856.1)
洋葱 Allium cepa (AAO63026.1)
郁金香 Tulipa gesneriana (BAH98155.1)
山楂 Crataegus monogyna (AAX16491.1)
玉米 Zea mays (CAA75996.1)
圆叶葡萄 Vitis rotundifolia (AGJ70142.1)
石斛 Dendrobium hybrid cultivar ( CAR64530.1)
苹果 Malus domestica (AAO39816.1)
芍药 Paeonia lactiflora(AFI71899.1)
美丽翠雀花 Delphinium x belladonna (BAF49325.1)
拟南芥 Arabidopsis thaliana (AAA32783.1)
兰花 Bromheadia finlaysoniana (AAB62873.1)
草莓 Fragaria x ananassa (AAX12421.1)
月季 Rosa hybrid cultivar(BAA12723.1)
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2a
葡萄风信子 Muscari armeniacum MaDFR2b
风信子 Hyacinthus orientalis (AFP58815.1)
早花百子莲 Agapanthus praecox (BAE78769.1)
洋红百合 Lilium speciosum (BAE79202.1)
油点草 Tricyrtis sp. Shinonome (BAN62761.1)
姜荷花 Curcuma alismatifolia (ADK62520.1)
小麦 Triticum aestivum (AAV83987.1)
荷兰鸢尾 Iris x hollandica (BAF93856.1)
洋葱 Allium cepa (AAO63026.1)
郁金香 Tulipa gesneriana (BAH98155.1)
山楂 Crataegus monogyna (AAX16491.1)
玉米 Zea mays (CAA75996.1)
圆叶葡萄 Vitis rotundifolia (AGJ70142.1)
石斛 Dendrobium hybrid cultivar ( CAR64530.1)
苹果 Malus domestica (AAO39816.1)
芍药 Paeonia lactiflora(AFI71899.1)
美丽翠雀花 Delphinium x belladonna (BAF49325.1)
拟南芥 Arabidopsis thaliana (AAA32783.1)
兰花 Bromheadia finlaysoniana (AAB62873.1)
草莓 Fragaria x ananassa (AAX12421.1)
月季 Rosa hybrid cultivar(BAA12723.1)
534
单、双子叶之间存在明显的区别，因此有人认为，
DFR的趋异很可能发生在单子叶与双子叶植物的
进化之后(Liew et al., 1998)。
2.3 MaDFR2a和MaDFR2b蛋白的生物信息学分析
利用ProtScale分析，MaDFR2a和MaDFR2b编
码的蛋白亲水性/疏水性的最大值均为2.522，最小
值均为-3.200。在整个肽链中亲水性氨基酸残基
比疏水性氨基酸残基多，由此推测葡萄风信子两个
DFR基因编码的蛋白为亲水性蛋白(图4)。同时运
用TMpred程序对MaDFR2a和MaDFR2b编码的蛋
白的跨膜结构进行了预测，发现在10~28区和194~
215均存在两个跨膜区，分别位于上述预测的疏水
域中。蛋白质序列含有跨膜区提示其可能作为膜
受体起作用,也可能是定位于膜的锚定蛋白或离子
通道蛋白(周琳等, 2011)。
信号肽的存在与否决定含有这类肽段的新生
肽链能否被分泌到细胞外。运用SignalP 4.1 Server
预测表明，MaDFR2a和MaDFR2b编码的蛋白都不
具有信号肽，说明都不是分泌蛋白。磷酸化是蛋白
图3 MaDFR2a, MaDFR2b蛋白与其他物种的DFR蛋白的系统进化树
Figure 3 Phylogenetic tree of MaDFR2a, MaDFR2b proteins and DFR proteins from other species
A B
图4 MaDFR2a(A)和MaDFR2b(B)亲水性/疏水性分析
Figure 4 Analysis of hydrophilic and hydrophobic of MaDFR2a (A) and MaDFR2b (B)
葡萄风信子二氢黄酮醇 4-还原酶基因(DFR)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of Dihydroflavonol 4-reductase Gene(DFR) from Grape Hyacinth(Muscari armeniacum) 535
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
A
B
C D
图5 MaDFR2a和MaDFR2b蛋白的结构预测
Figure 5 The structure prediction of MaDFR2a and MaDFR2b proteins
A，B：MaDFR2a和MaDFR2b蛋白的二级结构预测，α为α-螺旋，β为β-转角，E为延伸链，R为无规则卷曲；C, D：MaDFR2a和
MaDFR2b蛋白的三级结构预测
A and B: Secondary structures prediction of MaDFR2a and MaDFR2b proteins, α indicates alpha helix; β indicates beta turn; E
indicates extend strand; R indicates random coil; C and D: Three-dimensional structures prediction of MaDFR2a and MaDFR2b
proteins, respectively
质最重要的翻译后修饰之一，在细胞信号转导过程
中起重要作用。用NetPhos 2.0预测DFR磷酸化位
点，MaDFR2a蛋白有 6个 Ser磷酸化位点、7个Thr
磷酸化位点和6个Tyr磷酸化位点；MaDFR2b蛋白
有 7个Ser磷酸化位点、7个Thr磷酸化位点和 6个
Tyr磷酸化位点。
SOPMA预测的DFR蛋白二级结构结果表明，
MaDFR2a和MaDFR2b编码的 366个氨基酸残基
中，α-螺旋分别占39.89%和37.37%，无规则卷曲分
别占 38.25%和 39.62%，延伸链分别占 13.11%和
13.93%，β-转角分别占 8.74%和 9.02%(图 5 A, B)。
用 Phyre预测DFR蛋白三级结构发现(图 5 C, D)，
两个DFR基因编码的蛋白三级结构非常相似，且
具有典型的手型结构。中间形成一个裂沟。
NADP (H) 的结合位点位于靠近 N-端的裂沟表
面。利用 NCBI的 BlastP预测发现，MaDFR2a和
MaDFR2b编码的氨基酸序列具有典型的DFR蛋白
功能结构域,含有多个NADP (H)结合位点和多个
短链脱氢/还原酶 (SDR) 家族的特征位点，均属
NADB-Rossmann超家族。
2.4 葡萄风信子MaDFR2a和MaDFR2b基因的
亚细胞定位
利 用 PSORT Ⅱ Prediction(http://psort.hgc.jp/
form2.html)对MaDFR2a和MaDFR2b进行细胞定位
预测，发现它们在整个细胞内都有定位信号。为了
确定其在细胞内的定位，构建了亚细胞定位的表达
载体 pBI221-MaDFR2a-GFP和 pBI221-MaDFR2b-
536
GFP。利用基因枪转化后在激光共聚焦显微镜下观
察，pBI221- MaDFR2a- GFP 和 pBI221- MaDFR2b-
GFP两个融合蛋白均定位于整个细胞中(图 6)。
2.5 葡萄风信子不同器官花青素含量测定及
MaDFR2a、MaDFR2b的时空表达模式分析
对葡萄风信子亚美尼亚根、茎、叶和花不同发
育时期(S1~S5)花青素含量进行测定，结果如图 7B
所示，花瓣中花青素含量较高，同时完全着色的花
蕾中花青素含量显著高于着色较浅的花蕾。根、茎
和叶以及未着色的花蕾(S1)中检测不到花青素(P≤
0.05)。
不同物种的DFR基因在不同发育期与不同器
官的表达特性有所不同(祝婷等, 2010)。为了研究
DFR基因在不同组织以及花发育不同时期中的表
达情况，分别提取葡萄风信子根、茎、叶、以及花发
育的 5个时期花蕾 (S1~S5)的总RNA，反转录获得
cDNA，以之为模板，通过荧光定量 PCR的方法检
测MaDFR2a和MaDFR2b的表达模式(图 7)。结果
表明，MaDFR2a和MaDFR2b都在花中优势表达，
在其他组织(根、茎和叶)微量表达。花组织中，
MaDFR2a在未着色的小花蕾时期(S1)开始表达，随
着花青素不断积累，在完全着色的花蕾(S3)时期表
达量达到峰值，此后随着花色变淡，表达量逐渐降
低。与之相对，MaDFR2b尽管也在完全着色的花
蕾(S3)时期表达量最高，并且随着花发育逐渐降
低，但在未着色的小花蕾时期(S1)也呈现出较高的
表达。此外，MaDFR2a和MaDFR2b在着色花器官
中的表达模式与花青素含量相一致(P≤0.05)。
3 讨论
最近研究表明，转录组测序可以快速、高效获
得大量的基因序列片段，对于无参考基因组物种的
基因发掘、转录分析以及分子标记有重要作用
(Feng et al., 2012; Zhang et al., 2012; Yu et al.,
2012; Mutasa-Göttgens et al., 2012)，同时有助于科
研工作者筛选生物代谢途径中的关键候选基因
(Feng et al., 2012; Mutasa- Göttgens et al., 2012;
Guimarães et al., 2012)。课题组前期通过对葡萄风
信子转录组数据的生物信息学分析，筛选出可能影
响葡萄风信子花色形成的关键候选基因DFR片段
(数据未发表)。本研究采用RACE技术进一步获得
了该基因的全长序列，根据其开放读码框设计全长
引物并进行反复验证后发现，葡萄风信子中克隆得
到的两条DFR序列，可能是基因家族。通常情况
下，DFR为单基因编码(Martens et al., 2002)，很少
以基因家族形式存在。但一些植物中DFR也存在
多个家族成员。如矮牵牛基因组中含有 3个DFR
基因(DFRA、DFRB和DFRC)，但只有 DFRA在花器
官中表达(Huits et al., 1994)。在日本裂叶牵牛中也
存在 3个DFR基因拷贝(DFRA、DFRB和DFRC)，只
有 DFRB 发生突变时才会抑制花色素合成
(Hoshino et al., 2001)；百脉根中有 5个DFR基因，
表达模式非常复杂(Shimada et al., 2005)。本研究
表达分析显示，MaDFR2a和MaDFR2b在葡萄风信
子花组织中优势表达，表明DFR基因的表达具有
组织特异性。此外，MaDFR2a和MaDFR2b在花发
育不同时期表达趋势有所不同，这可能是由于两个
DFR基因编码的某些氨基酸不同造成的。
DFR基因在不同的植物中，对底物的选择不
同，因此生成不同的花色素。DFR对于底物特异性
选择的分子机理，早期的研究者提出了由 26个氨
基酸组成的底物特异选择的结构域 (Beld et al.,
1989)。该区域 134位氨基酸和 145位的氨基酸会
直接影响到DFR的底物特异性。大多数植物DFR
的第134位氨基酸是天冬酰胺残基(Asn)，因此被称
为Asn型 DFR。蔓越橘等多种植物DFR都属于这
类；第二类DFR，其 134位的氨基酸是天冬氨酸残
基，被称为Asp型DFR，不能有效地把DHK还原为
无色花葵素，如矮牵牛和兰花；第三类DFR的第
134位氨基酸残基既不是天冬酰胺也不是天冬氨
酸，因此被称为非 Asn/Asp型 DFR(Johnson et al.,
2001)。植物中第一类DFR分布广泛，只有少数植
物含有非 Asn/Asp型 DFR。本实验克隆得到的
MaDFR2a和MaDFR2b的第 134位氨基酸残基是
缬氨酸(Val)，属非Asn/Asp型 DFR。因此，后期还
需要对MaDFR2a和MaDFR2b进行一系列酶活性
分析进一步确定其催化的底物种类。
4 结论
本研究以葡萄风信子为研究材料，通过RACE
技术从花瓣中成功克隆到两条DFR基因(MaDFR2a
和MaDFR2b)，系统进化分析表明，两个DFR基因
最先与单子叶植物早花百子莲、洋葱、石斛、兰花、
葡萄风信子二氢黄酮醇 4-还原酶基因(DFR)的克隆与表达分析
Cloning and Expression Analysis of Dihydroflavonol 4-reductase Gene(DFR) from Grape Hyacinth(Muscari armeniacum) 537
农业生物技术学报
Journal of Agricultural Biotechnology
花
青
素
/(
m
g·
g-
1 )
S3 S4 S5Root Stem Leaf S1 S2
c
b
a
d
cc c
bc bc
a
b
bc
d d
b
cd
a
c
cd
图6 MaDFR2a和MaDFR2b基因的亚细胞定位
Figure 6 Subcellular localization ofMaDFR2a andMaDFR2b
绿色荧光显示靶蛋白的位置，红色箭头代表明场下的靶蛋白位置
Green fluorescent shows the DFR proteins, red arrows indicate the target proteins in bright field
图7 葡萄风信子各器官表型图(A)、花青素含量测定(B)及MaDFR2a(C)和MaDFR2b(D)基因表达量分析
Figure 7 The phenotypes(A), analysis of anthocyanin content(B) and expression patterns of MaDFR2a(C) and MaD⁃
FR2b(D) in different organs ofM. armeniacum
S1：未着色的花蕾；S2：开始着色的花蕾；S3：完全着色未开放的花蕾；S4：完全开放的花蕾；S：衰败的花蕾。不同小写字
母(a, b, c, d)表示差异显著(P≤0.05)。C和D：内参基因为葡萄风信子Actin基因，n=3
S1: Unpigmented flower bud; S2: Flower bud being colored; S3: The coloring and flower bud tbefore anthesis; S4: Fully-opened
flower bud; S5: Declined flower bud. Different letters indicate significant difference(a, b, c, d) (P≤0.05). C and D: Actin was
used as reference gene, n=3
538
小麦、玉米等聚为一类，其次是部分双子叶植物，这
与植物在形态学的分类结果是一致的；根据对DFR
基因在葡萄风信子的根、茎、叶，以及花发育不同时
期的表达分析表明，DFR在花中大量表达，表明葡
萄风信子DFR基因的表达具有组织特异性；同时根
据对葡萄风信子DFR基因在不同器官中花青素含
量分析，发现DFR基因的表达量与花青素积累量呈
正相关，说明DFR催化反应是花青素合成途径中
的重要步骤，决定了植物花青素的种类与含量。本
实验室下一步拟通过对MaDFR2a和MaDFR2b进
行功能研究，以期阐明DFR在葡萄风信子花色形成
过程中的作用机制，这将为利用基因工程进行花色
改良提供新的基因资源。
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(责任编辑 任立刚)
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