全 文 ：0 引言
花的颜色是决定花观赏价值的最重要因素，因此
创造出新的花色一直是花卉育种者的主要目标。任何
单物种的基因库都很有限，一个单一的物种拥有全部
的花色谱是很罕见的，很多植物只积累了一些特殊的
类黄酮而展示了有限的花色[1-2]。例如，百合，玫瑰，康
乃馨，菊花等，都是世界最重要的栽培花卉，它们都不
会积累飞燕草色素 [3]，所以缺乏紫罗兰色与蓝色品
种。近年来随着对类黄酮生物合成途径研究的深入和
花卉分子生物技术的不断发展，使得蓝色花的产生成
为可能。蓝色花的形成，虽然类黄酮 3’5’羟基化酶
（flavonoid 3’,5’-hydroxylase,F3’5’H）基因起到了至
关重要的作用，但是二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydrofla-
vonol 4-reductase，DFR)作为花色素苷生化合成途径中
的关键酶之一也不容忽视，它对二氢-黄酮醇底物具有
选择特异性[4]。每个物种的DFR都有一个氨基酸区域
来限定底物的优先性[5]。以二氢山奈酚（DHK）为底物
合成天竺葵色素形成橙色到红色的花；以二氢槲皮素
基金项目：国家自然科学基金“百合花色形成关键基因特异启动子功能与应用研究”（30871734）。
第一作者简介：祁银燕，女，1985年出生，硕士，主要从事百合生物技术育种研究，通信地址：712100西北农林科技大学南校区研究生院园艺学院，
E-mail：qiyinyan@sina.com。
通讯作者：刘雅莉，硕士，副教授，主要从事园林植物生物技术育种研究，E-mail:lyl6151 @126. com。
收稿日期：2009-08-25，修回日期：2009-09-30。
风信子DFR基因全长cDNA的克隆及序列分析
祁银燕，刘雅莉，李 莉，王跃进
(西北农林科技大学园艺学院；农业部西北园艺植物种质资源利用重点开放实验室，
陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌 712100)
摘 要：以蓝色风信子完全露出蓝色的花蕾为材料,利用RT-PCR和RACE技术，获得风信子DFR基因的
全长 cDNA。该 cDNA全长1252 bp，开放阅读框为1098 bp，编码366个氨基酸。 Blast搜索结果显示,风
信子DFR基因核苷酸序列与其它植物已报道的DFR基因具有66%~77%的相似性,氨基酸序列有62 %~
73%的相似性。聚类分析表明，最先与风信子聚类合并的是鸢尾，其次与其它单子叶植物聚类，最后与
双子叶植物聚类。
关键词：DFR；cDNA克隆；风信子；基因
中图分类号：S3 文献标识码：A 论文编号：2009-1715
Cloning and Sequencing Full-length cDNA of DFR Gene in Hyacinthus
Qi Yinyan, Liu Yali, Li Li, Wang Yuejin
(College of Horticulture, Northwest A＆F University; Key Laboratory of Horticultural Plant
Germplasm Resources Utilization Northwest of China, Ministry of Agriculture,
Key Laboratory of Agriculture Molecular Biology of Shaanxi Province, Yangling Shaanxi 712100)
Abstract: A total length DFR gene was cloned with RT-PCR and RACE technology from flower bud with blue
petals of Hyacinthus orientalis L.. Hyacinthus DFR cDNA was 1252 bp in length. Within the full-length cD⁃
NA, a clear open reading frame (ORF) was 1098 nucleotides, coding 366 amino acids. The results of homolo⁃
gous analysis in GenBank demonstrated that the sequence had 66 %-77 % identity on the nucleotide sequence
and 62 %-73% identity on the deduced amino acid sequence. The results of phylogenetic analysis showed that
DFR from Hyacinthus orientalis and from Iris x hollandica clustered together firstly, and then came those from
other monocotyledon, dicotyledon came subsequently.
Key words: DFR, cDNA cloning, Hyacinthus, gene
中国农学通报 2009,25(24):62-67
Chinese Agricultural Science Bulletin
（DHQ）为底物合成矢车菊色素形成红色到洋红色的
花；以二氢杨梅酮（DHM）为底物合成飞燕草色素形
成紫色到蓝色的花。因此，用一个蓝色花的DFR基因
功能来取代非蓝色转基因受体的DFR基因功能是通
过转基因手段形成蓝色花的必须途径。
风信子（Hyacinthus orientalis L.）为风信子科风信
子属的多年生草本植物，原来属于百合科，现在已被
提升为新的风信子科的模式属。其蓝色品种颜色纯
正，属单子叶植物，与百合等亲缘关系较近，因此它的
DFR基因的克隆为百合创造出蓝色花品种奠定基础，
为其他单子叶植物蓝色品种的育成提供最佳基因资
源。
RACE ( rapid-amplification of cDNA ends)主要用
特异引物和公用引物从低丰度转录本中快速扩增已知
cDNA片段旁侧的 5′和 3′末端的简单而有效的方
法,具有快捷、方便、高效等优点,成为目前克隆全长基
因的一个常用方法。该研究采用 BD SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit,克隆了风信子的 cDNA
全长,并进行了序列比对以及生物信息学分析。
1 材料和方法
1.1 材料
风信子（Hyacinthus orientalis L.）购于西安西光花
卉市场,将完全露出蓝色的花蕾经液氮冷冻后存
于-80℃冰箱中，备用。
RACE试剂盒购自 Clontech公司,pGEM-T Easy
Vector 购自 Promega公司,限制性内切酶 BamHI 与
XbaI为TaKaRa公司产品,引物合成与测序由上海生工
完成。
1.2 方法
1.2.1 风信子花瓣RNA的提取 在张今今等 [6]的 SDS
方法提取总RNA的基础上,稍加改进。
①取少量蓝色风信子花瓣，液氮研磨成粉末
状，加入装有 810 µl SDS裂解液 (140 mmol/L LiCl,
100 mmol/L Tris 碱 ，10 mmol/L EDTA, 5% (W/V)
SDS，2%(W/V)PVP)与 30 µlβ-巯基乙醇的 2 ml离心
管中，涡旋振荡，充分混匀。②4 ℃，12000 rpm,离
心 15 min，取上清，加入等体积氯仿:异戊醇（24:
1），涡旋振荡，充分混匀。③4 ℃，12000 rpm,离心
15 min，取上清，加入 1/3 体积的 KAc(5 mol/L，
pH4.8)，涡旋振荡，充分混匀。④4 ℃，12000 rpm,
离心 15 min,取上清，加入等体积氯仿:异戊醇（24:1），
涡旋振荡，充分混匀。⑤ 4℃，12,000 rpm 离心
15min,移上清至1.5 ml离心管，加入1/3体积的8 mol/L
LiCl, 涡旋振荡，充分混匀后，-40 ℃沉淀 3 h或以
上。⑥4℃ , 12,000 rpm离心 15min，弃上清，用 75%
乙醇洗涤，离心沉淀 2次，室温干燥，沉淀溶于 30 µl
DEPC-H2O。⑦涡旋完全溶解后，1 µl样品在 1%琼
脂糖凝胶上检测。为避免 RNA降解，所有步骤均
在冰上操作。
总RNA样品中的DNA的去除参照张今今,郝福
玲等[7]的方法，稍有改动。水浴时，37℃水浴 10 min,
然后冰上放置 30 min。去除 DNA 的 RNA 用 BD
SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit合成双链cD-
NA。
1.2.2 风信子DFR基因 cDNA片段与全长的克隆 比
对GenBank上登录的不同物种的DFR基因，以百合
DFR序列（登录号：AY374471）为基序列，在保守区设
计特异引物DFR-F与DFR-R(表1)，以完全露出蓝色花
蕾 [8]的普通反转录（TAKARA PrimeScriptTM Reverse
Transcriptase）cDNA为模板，PCR扩增目标基因片
段。具体体系如下（25 µl）：10×Buffer 2.5 µl，dNTP
(2.5 mM) 2 µl，MgCl2 1.5µl，Primer1与Primer2 (10µM)
各 0.5 µl，模板 1µl（约 40 ng），Taq酶（5U/µl）0.3µl ，dd
H20 16.7 µl。PCR反应程序为：94℃ 5min，94℃30 s，
56 ℃30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环，72 ℃10 min，
4 ℃保存。将 PCR产物采用 1.5%（电泳缓冲液为 1×
TAE，胶内加EB）琼脂糖凝胶电泳进行分离。切下目
的条带，用离心柱型琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒
(TianGen) 回收。连接到 pGEM-T Easy Vector载体
上。4℃过夜连接，5µl连接产物中加入20 µl感受态细
胞TOP10，混匀转化后，在含有Amp 100 mg/L的LB固
体平板上充分涂干，倒置平板于 37℃培养 12~18 h。
挑取白色菌落加入到含Amp 100 mg/L的LB液体培养
基中，37℃，150 rpm培养10 h。在无菌条件下取菌液
1.8 ml，进行提质粒酶切与通用引物M13或特异引物
PCR鉴定。把阳性克隆送上海生工测序。
在得到的DFR片段上设计 5’与 3’端的RACE引
物（重叠区42bp）送上海生工合成后，参照RACE试剂
盒说明书，纯化后的RNA再分别做RACE反转录得到
5’RACE-Ready-cDNA 和 3’RACE-Ready-cDNA，以
之为模板，DFR--5’RACE，DFR--3’RACE分别与试剂
盒配备的UPM (10×Universal Primer A Mix)为引物，
进行 5’RACE 和 3’RACE PCR扩增。分离，回收，转
化克隆按上述方法，测序后将获得的 5’和 3’cDNA
序列进行拼接。查找拼接序列的开放阅读框，在开放
阅读框两侧设计上、下游引物DFR-F-1与DFR-R-2（表
1），以5’-ready RACE cDNA为模板，扩增得到目的基
因全长。
祁银燕等：风信子DFR基因全长cDNA的克隆及序列分析 ·· 63
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1.2.3 DFR基因cDNA全长的生物信息学分析 将所得
到的序列在NCBI的Blast进行比对,核苷酸序列的相
似性比对在NCBI的 Blastn ( ht tp :/ /www. ncbi. nlm.
nih. gov/ blastn) 中分析,并确定开放阅读框分析
(ORF) ,将其推导相应的氨基酸序列比对在NCBI 的
Blastx(http :/ / www. ncbi. nlm. nih. gov/ blastx)中分析;
运用DNAMAN软件对推导的氨基酸序列与已知报道
植物推导的氨基酸序列进行系统进化分析。
2 结果与分析
2.1 风信子DFR基因的克隆和序列分析
改进的SDS/酚法提取的风信子花瓣的总RNA ,利
用紫外光吸收法测定RNA的浓度和OD值,浓度达到
450 ng/μl，OD260 nm / OD280 nm 值为 1.8。电泳图片显示,
28S与18S比为2∶1 (图1)，提取的RNA完全能够满足
表1 实验所用引物列表
引物名称
DFR-F
DFR-R
DFR--5’RACE
DFR--3’RACE
DFR-F-1
DFR-R-2
引物序列（5’-3’）
GAGCTAGTGGCTATGTTGGTTC
ACAAAGTACATCCATCCAGTCA
CGCCTCACCATCTGGAAAGCGGACCTCA
GCTTCCTTCGTCGTTGAGGTCCGCTTTCC
GGATCCATGGAGATGGAGAAGGGGC
TCTAGACTAGCGCGAAGCAATGTGAACC
备注
中间序列
中间序列
5’RACE PCR
3’RACE PCR
全长引物包含 BamHI位点
全长引物包含 XbaI位点
图1 蓝色风信子花瓣的RNA电泳结果
注：1-4.蓝色风信子花瓣RNA的4个重复. 5-6.去除DNA后的RNA。
1 2 3 4 5 6
28S
18S
28S
18S
图2 蓝色风信子DFR PCR产物
注：1.DFR中间片段扩增.M. DL2000。
图3 蓝色风信子DFR 5’RACE和 3’RACE结果
注：1.5’RACE的产物;2.3’RACE的产物; M. DL2000。
M 1 1 M 2
460 bp
1050 bp
280 bp
下一步普通反转录与RACE反转录的需要。
以特异引物DFR-F与DFR-R，完全露出蓝色花蕾
的普通反转录cDNA为模板，PCR扩增目标基因片段，
获得了460bp的DFR基因片段（图2），回收，测序。测
序结果在NCBI网站上BLAST比对，结果显示是DFR
基因的部分片段。在得到的460bp的DFR片段上设计
5’与 3’端的RACE引物，参照RACE试剂盒说明书，
以 5’RACE-Ready-cDNA和 3’RACE-Ready-cDNA为
模板，DFR-5’RACE，DFR-3’RACE分别与UPM (10×
Universal Primer A Mix)为引物，进行 5’RACE 和 3’
RACE PCR扩增分别得到约 280 bp与 1050 bp的条带
（图3）。测序后软件拼接得到1252 bp，并根据开放阅
读框设计引物 DFR-F-1 和 DFR-R-2，以 5’-ready
RACE cDNA为模板扩增全长(图 4)，回收，检测（图
5），测序。结果显示风信子DFR基因全长1252 bp，与
拼接片段一致。
2.2 生物信息学的分析
2.2.1 风信子DFR基因 cDNA全长核苷酸序列分析
测序得到风信子DFR全长 1252bp，其中起始密码子
ATG位于 26 bp处，终止密码子 TAG位于 1121bp处,
·· 64
推导的氨基酸序列含366个氨基酸（图6）。
2.2.2 风信子DFR基因核苷酸序列与推导的氨基酸序
列同源性及系统进化分析 风信子DFR核苷酸序列与
已报道的其它植物DFR基因序列有 66%~77%的同源
性，与鸢尾和小麦同源性最高，为77%。其次是洋葱，
百合，兰花，同源性为 73%，72%，72%，同源性都在
70%以上。结果表明，此研究从风信子中克隆到的
DFR基因与已报道的单子叶植物同源性较高(表2)。
从风信子DFR推导的氨基酸序列与已知其它植
物DFR基因序列有 62%~73%的同源性，其中与百子
莲DFR同源性最高，为73%，其次是小麦，鸢尾，百合，
洋葱，相似性是71%，68%，67%，67%。结果表明，此研
究从风信子中克隆到的DFR基因推导的氨基酸序列
与大部分已经报道单子叶植物同源性较高(表2)。
对GenBank同源性搜索获得的其它植物DFR基因
核苷酸序列进行系统进化分析，发现最先与风信子聚
图4 DFR基因的cDNA全长扩增产物
注：1-2.cDNA全长扩增产物的2个重复. M. DL2000。
图5 重组质粒的鉴定
注：1. BamHI与XbaI.酶切含cDNA全长片段的重组质粒. M.DL2000。
M 1 2
1252 bp
1252 bp
M 1
图6 DFR cDNA全长的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
祁银燕等：风信子DFR基因全长cDNA的克隆及序列分析 ·· 65
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类合并的是鸢尾，其次与单子叶植物红掌，小麦，水稻，
洋葱，百合，文心兰，石斛，兰花聚类，其次与双子叶植物
康乃馨，向日葵，苹果，葡萄，矮牵牛，甘薯聚类，最后与
双子叶植物金荞麦，拟南芥聚类（图7）。聚类分析结果
表明，同为单子叶的风信子DFR基因，与单子叶植物的
亲缘关系更近一些。系统进化树体现了DFR在单子叶
与双子叶植物之间的明显区别，因此有人认为，DFR的
趋异很可能发生在单子叶与双子叶植物的趋异之后[9]。
3 讨论
类黄酮合成途径中[10]，无色的DHK、DHQ和DHM
在DFR的催化下利用NADPH会进一步还原成不稳定
的无色花色素(1eucoanthocyanidin)，然后在花色素苷
合成酶(anthocyanin synthase，ANS)和类黄酮 3- O -糖
基转移酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase，3GT)的作
用下合成各种花色素苷[11-12]。DFR是将二氢黄酮醇转
变为花色素苷反应的第 1个酶，不同物种的DFR对底
物选择性不同，所以合成不同的花色素，呈现各异的花
色 [13]。该实验中DFR基因的克隆为百合创造出蓝色
花奠定基础，为其他单子叶植物蓝色品种的育成提供
最佳基因资源。
表2 风信子DFR基因和已知其它植物的DFR基因核苷酸与推导的氨基酸序列相似性比较
物种
鸢尾 Iris×hollandica
小麦Triticum aestivum
洋葱Allium cepa cultivar H6
百合Lilium hybrid cv.Star Gazer’
兰花Bromheadia finlaysoniana
石斛Dendrobium hybrid cultivar
红掌Anthurium andraeanum
文心兰Oncidium Gower Ramsey
水稻Oryza sativa Japonica Group
苹果Malus hybrid cultivar
葡萄Vitis vinifera
GenBank的登录号
AB332098
AY373831
AY221249
AY374471
AF007096
FJ426271
DQ421810
EF570113
AB003496
FJ817487
X75964
相似性/ %
核苷酸
77
77
73
72
72
71
71
70
69
69
68
氨基酸
68
71
67
67
67
67
66
70
67
65
67
图7 不同来源的DFR基因推导的氨基酸序列聚类分析结果
0.05
金荞麦 Fagopyrum cymosum EF522146
矮牵牛 Petunia hybrida X15537
甘薯 Ipomoea batatas EU360845
向日葵 Helianfhus anhus EU095849
康乃馨 Dianthus caryophyllus Z67983
苹果 Malus hybrid cultivar FJ817487
葡萄 Vitis vinifera X75964
洋葱 Allium cepa cultivar H6 AY221249
百合 Lilium hybrid cv.Star Gazer’AY374471
兰花 Bromheadia finlaysoniana AF007096
石斛 Dendrobium hybrid cultivar FJ426271
文心兰 Oncidium Gower Ramsey EF570113
风信子 （Hyacinthus orientalis L.） DFR
红掌 Anthurium andraeanum DQ421810
水稻 Oryza sativa Japonica Group AB003496
小麦 Triticum aestivum AY373831
鸢尾 Iris×hollandica AB332098
拟南芥 Arabidopsis thahiana M86359
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此研究采用RACE技术,首次在风信子中获得了
DFR基因的全长序列,对该序列分析发现，该基因全长
1252 bp，开放阅读框为1098 bp，编码366个氨基酸，通
过Blastn与Blastx分别进行同源性比对分析，与已报
道的植物同源性都在 60%以上。聚类分析结果表明，
此研究从风信子中克隆出来的DFR基因最先与鸢尾
等单子叶植物聚类合并，最后才与双子叶植物聚类,这
个结果与Blastn与Blastx分别对核苷酸与氨基酸同源
性比对所得的结果一致。其结果表明不同物种的
DFR基因进化程度不同。
对于与花色密切相关的DFR基因来说，该研究中
克隆出的蓝色风信子DFR cDNA全长，其转基因研究
不仅能了解其功能，而且还有助于借助分子方法(共抑
制、RNAi或导入新基因等)实现对花色的改造，这对于
日趋发展的花卉产业来说商业价值很大。相信今后随
着类黄酮生物合成途径的研究深入和基因工程技术的
不断完善，花色基因工程将会有更广阔的应用前景。
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