全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
重组蛋氨酸裂解酶的表达、复性及活性研究
孔晨虹1 夏立亮2 徐顺利 3 于源华 2 蒋琴 2 杨佳新 2
( 1长春市中医院,长春 130022; 2长春理工大学生命科学技术学院,长春 130022; 3长春市二道区医院,长春 130031)
摘 要: 探索以包涵体形式表达的重组蛋氨酸裂解酶的纯化、复性方法 , 并对其活性进行检测。将阴道毛滴虫蛋
氨酸裂解酶重组表达载体 PET15bm g l1转化大肠杆菌 BL21, 经异丙基D硫代半乳糖苷 ( IPTG )诱导 , 并对表达条件
进行优化, 获得大量表达。通过对包涵体的纯化及复性研究 , 检测重组蛋氨酸裂解酶的免疫活性及酶活性。W estern
b lo tting结果表明, 重组蛋氨酸裂解酶免疫小鼠制备的多抗可以和从阴道毛滴虫中提取的天然蛋氨酸裂解酶发生特异性
反应。活性检测结果显示复性蛋氨酸裂解酶有活性, 复性效率达到 25% 左右。以包涵体形式表达的蛋氨酸裂解酶经
变性、纯化及复性后, 获得大量有活性的酶 , 为深入了解其结构、功能及酶学性质, 开展其在临床检测中的应用研究奠定
基础。
关键词: 蛋氨酸裂解酶 同型半胱氨酸 基因表达 包涵体 复性
Expression, Renaturation and Activity of RecombinantM ethionine
Lyase Expressed as Inclusion Body inE. coli
Kong Chenhong
1 X ia L iliang2 Xu Shun li3 Yu Yuanhua2 J iangQ in2 Yang J iax in2
(
1
Trad itional ChineseM edicineH osp ital of Changchun, Changchun 130022;
2
College of Life Science, Changchun University of Sscience and T echnology, Changchun 130022;
3
E rdao D istrictH osp ital in Changchun, Changchun 130031)
Abstrac:t It w as to study the pur ification, rena turation and activ ity of recom binant M eth ion ine Lyase expressed as inclus ion
body in E. coli. TheE. coli BL21 transform ed w ith PET15bm g l1 was cu ltured and induced by IPTG. The best expression condition of
recomb inantM e th ion ine Lyasew as dec ided by screen ing. The purification and renaturation o f recom binantM e th ion ine Lyase w ere
explored and the activ ity w as tested. It w as proved byW este rn b lo tting that the an tise rum ofM ice immunized w ith pur ifiedM e th ion ine
Lyase cou ld specially b ind to w ildM e th ion ine Lyase pur ified from T richom onas vaginalis. R enatured M ethion ineLyasew ith 25%
b io log ical activ ity w as prepared a fter be ing disso lved, purified and renatured. The resu lts ind icate that recom b inantMGL expressed as
inc lusion body reta ined satisfac to ry ac tiv ity after renatura tion, suggesting po tential efficacy in the research on structure, function, cha r
ac ter and clinica l tr ia ls.
Key words: M eth ion ine Lyase H om ocysteine Gene expression Inclusion body Renaturation
收稿日期: 20091210
作者简介:孔晨虹,女,大专,主治医师,研究方向:中医临床治疗
通讯作者:于源华,女,博士,教授,硕士生导师,主要从事生物化学及分子生物学方面研究; Em ai:l yuyuanhua8888@ 126. com
同型半胱氨酸 ( hom ocysteine, HCY )是蛋氨酸
和半胱氨酸代谢过程中的一个重要中间产物。遗
传或获得性因素使得 HCY浓度持续高于正常值
高限,即称为 高同型半胱氨酸血症 ( hHCY)。 20
世纪 60- 70年代, M cCully[ 1, 2 ]从病理上发现同型
半胱氨酸尿症和胱硫醚尿症患者早期即可发生全
身动脉粥样硬化和血栓形成, 并通过动物模型证
实同型半胱氨酸血中蓄积可导致类似血管损害。
Stamp fer等 [ 3]指出 HCY升高 5%时发生心肌梗死
的危险性提高 3倍。现在人们普遍认为高同型半
胱氨酸血症是动脉粥样硬化和冠心病的一个独立
危险因素,因此对 HCY含量的检测具有重要诊断
意义。
目前, 同型半胱氨酸的检测主要有 3种方
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
法 [ 4] :高效液相方法、荧光偏振免疫检测法及酶联
免疫检测法。鉴于高效液相及荧光偏振免疫检测
法虽然灵敏度高, 但需要贵重仪器, 检测成本高;
酶联免疫法检测较为方便, 但其准确性稍差, 因
此, 研究一种简单、快速、灵敏的检测方法具有重
要意义。蛋氨酸 裂解酶 ( LM eth ionine lyase ,
MGL)是一种磷酸吡哆醛 ( PLP)依赖酶, 可以催化
同型半胱氨酸分解为 丁酮酸, 硫化氢和氨, 通过
检测产物生成量即可计算出血浆中同型半胱氨酸
含量 [ 5- 7]。
本研究将阴道毛滴虫蛋氨酸裂解酶原核表达
载体 PET15bmg l1转化大肠杆菌 BL21, 经异丙
基 D硫代半乳糖苷 ( IPTG)诱导, 及对表达条件
的优化,实现在大肠杆菌中的高效表达。通过对
包涵体的分离纯化及复性研究, 检测重组蛋氨酸
裂解酶的活性, 为深入了解 MGL酶的结构、功能
及酶学性质, 开展其在临床检测中的应用研究奠
定基础。
1 材料和方法
11 菌种、质粒及试剂
大肠杆菌 DH5、BL21、重组 pET15bm g l1
质粒由本实验室保存。BamH I酶, N de I酶, 核酸
m arkerDL 2000 (宝生物公司 ) ; 胰蛋白胨, 酵母提
取物, 异丙基 D硫代半乳糖苷, 琼脂糖, 琼脂,
低相对分子量标准蛋白 , TEMED, 溴酚蓝, SDS,
氨苄青霉素, 尿素, 考马氏亮蓝 R250, T ris, L半
胱氨酸盐酸盐, 硝酸纤维素转印膜, 辣根过氧化
物酶标记的山羊抗鼠 IgG等 (鼎国公司 )。 3甲
基 2苯并噻唑酮腙 (阿拉丁 ) , L蛋氨酸、5磷酸
吡哆醛 ( Am erso) , DL同型半胱氨酸 (东京化成工
业株式会社 )。
12 重组表达载体 pET15bmg l1的鉴定
重组表达载体 pET15bmg l1为本实验室先前
构建保存。现对其进行 PCR及双酶切鉴定。
PCR所用引物为: 上游引物 5ATGTCTCAC
GAGAGAATG3及下游引物 5TTA TAAAAGAGCGT
CAAGG3。PCR反应条件: 94 预变性 5 m in; 94
变性 45 s, 58 退火 50 s, 73 延伸 80 s, 30循环;最终
73 延伸 10m in。采用 Nde I酶和 BamH I酶对重组
质粒进行双酶切鉴定。
13 重组载体 pET15bmg l1转化大肠杆菌 BL21及
将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌 BL21。
挑取阳性单菌落于含有氨苄青霉素的 LB液体培养
基中, 37 , 200 r/m in过夜培养。按 1 /100的比例
转接后,继续培养 2 h左右, 使 OD600约为 08, 加入
终浓度为 1 mmo l/L的 IPTG,继续培养 4 h。收获菌
体沉淀,通过 SDSPAGE对重组蛋白的表达及表达
形式进行鉴定。
14 重组蛋白表达条件优化
参照方法 13, 分别对诱导剂浓度 ( 02, 04,
06, 08, 10 mm ol /L ) , 诱导时间 ( 2, 3, 4, 5, 6, 7
和 8 h ) , 培养基 pH ( 50, 55, 60, 65, 70, 75
和 80)及培养温度 ( 28, 32, 37和 42 )等表达条
件进行优化, 通过 SDSPAGE分析, 确定最佳表达
条件。
15 重组蛋白包涵体纯化及复性
将从 1 L表达细胞培养物中收获的菌体加入 8
mL细胞裂解缓冲液 ( 50 mmo l/L T risC l pH 80, 1
mmo l /L EDTA pH 80, 100 mmo l /L N aC l), 200 L
10 mg /mL的溶菌酶, 重悬菌体, - 20 反复冻融
3次。然后进行 4 , 10 000 r/m in, 20m in离心, 收
集沉淀, 向沉淀中加入 8 mL Buffer B, 充分溶解 ,
然后进行 4 , 10 000 r /m in, 10 m in离心, 收集上
清。
按照 Q iagen公司的 N iNTA亲和层析柱使用说
明书纯化目的蛋白。将 Buffer E洗脱的目的蛋白先
用复性液 ( 50 mM pH80磷酸钾缓冲液, 20mM还原
型谷胱甘肽, 02 mM氧化型谷胱甘肽, 10 M PLP,
002% 巯基乙醇, 1M尿素 )将酶液中 8M尿素稀
释成 3M,然后装入透析袋中用复性透析液 4 ,搅拌
透析 5 h,再用等体积混合的复性液和透析液 ( 50mM
pH80磷酸钾缓冲液, 10 M PLP, 002% 巯基乙
醇 )搅拌透析 10 h,最后用透析液透析 4次,每次 4 h。
透析完成后用 PEG 20000在 4 条件下进行浓缩,
SDSPAGE检测目的蛋白纯度并用考马斯亮蓝法测
定蛋白含量。
16 表达产物的Western b lo tt ing分析
用上述纯化的 MGL免疫昆明鼠制备多抗血清。
将从阴道毛滴虫中提取的 MGL进行 SDSPAGE电
泳, 并采用半干式电转移法将凝胶中的蛋白转印到
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2010年第 4期 孔晨虹等:重组蛋氨酸裂解酶的表达、复性及活性研究
硝酸纤维素膜。经小牛血清白蛋白封闭后与试验制
备的多抗血清进行感作。洗涤液洗涤后加入辣根过
氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG抗体进行感作。漂洗
后用增强型底物显色试剂盒按照操作说明进行
显色。
17 复性重组酶的活性测定
在 1 mL反应体系中, 加入 10 mo l/LPLP 10
L,取一定量的纯化复性酶溶液, 分别与不同浓度
的 L蛋氨酸、DL同型半胱氨酸、L半胱氨酸盐酸盐
在 37 反应 10m in,然后利用氨浓度检测试剂采用
自动化生化检测分析仪测定氨生成浓度, 从而计算
酶活。将在单位时间内 1 L溶液中生成 1 mo l氨
所需 MGL酶的量定义为一个酶活单位。
2 结果
21重组表达载体 pET15bmgl1的鉴定
通过 PCR鉴定, 从重组表达载体上扩增出
1 191 bp目的条带; 双酶切结果显示得到一条目的
条带和一条空线性 pET15b载体条带。以上结果说
明目的基因已与表达载体实现重组。试验结果如图
1所示。
1. pET15bm gl1 PCR扩增产物; 2. pET15bm gl1 /B amH
I+ Nde I双酶切产物; 3. pET15b /B amH I+ Nde I; M.
DNA m arker DL 15000
图 1 pET15bmgl1的 PCR及双酶切鉴定
22 重组 MGL的初步表达及纯化
对转化大肠杆菌 BL21诱导后, 表达产物经过
15% SDSPAGE分析大小约为 44 kD。重组蛋白主
要以包涵体形式存在。通过镍柱纯化, SDSPAGE
鉴定结果显示目的蛋白纯化效果较好, 光密度扫描
显示纯化目的蛋白纯度达到 92%以上 (图 2)。
M.蛋白质分子量标准; 1 - 2. E. coli BL21表达的
总蛋白; 3. 转化 E. coli BL21且经 IPTG 诱导的
pET15bm gl1 ; 4.纯化后的 H istagMGL
图 2 重组蛋白表达及纯化
23 重组 MGL表达条件优化
231 诱导剂浓度对表达的影响 图 3 SDSPAGE
结果显示,随着诱导剂浓度的增加,重组蛋白表达量
递增。利用 GDS8000凝胶成像分析系统软件分
析,诱导剂浓度在 06 mmo l/L时目的蛋白表达量
最高, 占菌体总蛋白的相对含量为 432%。而诱
导剂浓度再升高时, 目的蛋白质的表达量基本没
有变化, 由此可以判断最佳诱导剂浓度为 06
mmo l /L。
1- 5.诱导剂浓度分别为 02、04、06、08和 10 mmo l/L;
6.蛋白质分子量标准
图 3 诱导剂浓度对 MGL表达量的影响
232 诱导时间对表达的影响 重组子于 37 经
06mmol /LIPTG诱导,从图 4 SDSPAGE结果看出,
诱导时间以 5 h为宜, 此时目的蛋白的表达量最高,
此后不再明显升高。
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1.蛋白质分子量标准; 2 - 7.诱导时间分别为 2、3、4、5、6、7和 8 h
图 4 诱导时间对MGL表达量的影响
233 培养基 pH 对表达的影响 重组子在不同
pH培养基于 37 经 06mmo l/L IPTG诱导 5 h后,
从图 5的 SDSPAGE结果看出, MGL表达量随着 pH
值的逐渐升高而降低,在 pH值为 50时为最佳,利用
GDS8000凝胶成像分析系统软件分析,目的蛋白表
达量占菌体总蛋白的相对含量为 567%。
1.蛋白质分子量标准; 2- 8. pH 值分别为 50、55、60、
65、70、75和 8
图 5 pH值对MGL表达量的影响
234 诱导温度对表达影响 从图 6 SDSPAGE结
果可以看出,温度对目的蛋白的诱导表达量影响较
大。在 28 条件下,诱导表达 5 h,可以使目的蛋白的
相对含量最高,利用 GDS8000凝胶成像分析系统软
件分析,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的相对含量为
486%。随着温度的逐渐升高,表达量反而降低。
1- 4.诱导时间分别为 28、32、37和 42 ; 5.蛋白质分子量标准
图 6 诱导温度对MGL表达量的影响
2. 4 表达产物的W estern b lo tting分析
W estern b lo tt ing对目的蛋白的活性检测结果如
图 7所示,在对应于标准蛋白的相应部位都出现了
特征条带,重组 MGL免疫小鼠制备的多抗可以和从
阴道毛滴虫中提取的天然 MGL发生特异性反应, 表
明重组蛋白的正确性及良好的抗原活性。
M.蛋白质分子量标准; 1.从阴道毛滴虫提取的 MGL;
2.表达产物 W estern b lott ing分析结果
图 7 MGL的 W estern b lotting分析
25 复性重组酶的活性测定
试验从 1 L大肠杆菌基因工程菌培养液中经提
取、纯化, 制得 156 mg重组 MGL。对纯化的 MGL
进行复性及活性测定, 经计算重组 MGL对 L蛋氨
酸, DL同型半胱氨酸, L半胱氨酸盐酸盐的比活性
分别为 567、8216和 1396 mo l/m in /mg protein。
3 讨论
在试验中,大肠杆菌表达重组 MGL主要以包涵
体形式存在, 可溶性 MGL含量较少, 通过对二者进
行镍柱纯化及对包涵体变性蛋白进行复性, 研究不
同表达形式的酶活性。对于纯化后包涵体蛋白的复
性采用稀释和透析相结合的方法, 将 Buffer E洗脱
的目的蛋白先用复性液进行稀释,将酶液中 8M尿
素逐渐稀释成 3M浓度, 此过程不但可以降低变性
剂的浓度进行初步稀释,还可以有效降蛋白浓度,有
利于减少蛋白分子之间的聚集反应, 提高复性率。
透析采用的环境条件是 pH80, 4 , 偏碱性 pH 环
境有利于蛋白质的折叠和二硫键的交换,而较低的
温度可以减少蛋白的聚集反应 [ 8, 9]。还原型谷胱甘
肽和氧化型谷胱甘肽作为氧化还原试剂以促使不正
确配对的二硫键发生快速交换反应, 从而提高二硫
键正确配对率 [ 10]。 PLP作为 MGL的辅酶因子, 在
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细胞裂解液和透析液中加入 10 M PLP有利于保
持酶活性, 试验证明,不加入 PLP会显著降低 MGL
活性。
试验中测得复性重组 MGL对 L蛋氨酸, DL同
型半胱氨酸, L半胱氨酸盐酸盐的比活性分别为
567、8216和 1396 mo l/m in /mg pro tein, 而可溶
性重组 MGL 的为 2017、31869和 5696 mo l/
m in /mg protein, 前者活性分别是后者的 2811%、
2578%和 2451% ,复性效率达到 25%左右。由于
重组 MGL主要以包涵体形式存在,因此要想获得大
量高活性的纯品酶,需要对复性条件进一步探索、优
化,以提高复性效率。
本试验采用检测氨的方法测定酶活, 在 MGL作
用于底物后产生氨, 可以利用自动生化检测分析仪
直接测定反应液中氨的含量,具体原理是 酮戊二
酸 + NH - 4+ NADH 谷氨酸 + NAD+ , 在反应中
NADH的消耗速率与 NH 3生成浓度成正比, 在
37 、pH74、340 nm 处连续监测吸光度的变化率
( A /m in),计算出氨的浓度 ( mol/L )。由于 MGL
作用 L蛋氨酸、DL同型半胱氨酸、L半胱氨酸均可
产生氨和 丁酮酸, 因此通过检测氨和 丁酮酸的
生成量来测定酶活的方法具有广泛性。试验中应用
的检测氨含量检测方法方便、省时,但是由于本底氨
浓度的原因,使测定精确度受到影响。试验发现在
MGL酶液,底物溶液中含有氨, 其中酶液中氨含量
相对较高,如何去除反应本底中的氨对于完善酶活
测定方法具有重要意义。在酶活测定中, 还可以通
过测定 丁酮酸的生成量来计算酶活, 由于 丁酮
酸可以与 3甲基2苯并噻唑酮腙反应, 生成物在
335 nm处有最大吸收,因此可以通过分光光度法计
算 丁酮酸的量, 从而计算酶活 [ 11]。在检测血液中
同型半胱氨酸的含量时需要测定分解产物硫化氢的
含量, 从而排除蛋氨酸和半胱氨酸的干扰。
本研究将阴道毛滴虫 MGL原核表达载体 PET
15bmg l1转化大肠杆菌 BL21,经 IPTG诱导, 成功表
达重组 MGL, W estern b lo tt ing结果表明重组 MGL免
疫小鼠制备的多抗可以和从阴道毛滴虫中提取的天
然 MGL发生特异性反应。通过对表达条件的优化,
实现在大肠杆菌中的高效表达。通过对包涵体的分
离、纯化、复性及活性研究, 获得了有活性的重组
MGL, 复性效率达到 25%左右, 为深入了解 MGL酶
的结构、功能及酶学性质,开展其在临床检测中的应
用研究奠定基础。
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