全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
L 2蛋氨酸γ2裂解酶的研究进展
夏立亮 1 于源华 1 薛冉 2 王保学 1
(1长春理工大学生命科学技术学院 ,长春 130022; 2吉林大学生命科学学院 ,长春 130012)
　　摘 　要 : 　L2蛋氨酸γ2裂解酶是一种磷酸吡哆醛依赖型多功能酶 ,属于γ2蛋白家族。它能催化 L2蛋氨酸及同型半胱氨酸
的α,γ2裂解反应 ,被应用于肿瘤治疗及同型半胱氨酸血症的诊断。综述了蛋氨酸γ2裂解酶的来源 ,酶学性质 ,基因克隆与表
达 ,酶的空间结构、活性位点及其应用 ,并对其在制备及应用中存在的问题和前景作了分析与展望。
关键词 : 　蛋氨酸γ2裂解酶 酶学性质 基因工程 抗肿瘤药物 同型半胱氨酸血症
Research Progress on L 2M ethion ineγ2Lyase
Xia L iliang1 Yu Yuanhua1 Xue Ran2 W ang Baoxue1
(1 College of L ife Science, Changchun U niversity of Science and Technology, Changchun 130022;
2 College of L ife Science, J ilin University, Changchun 130012)
　　Abs trac t: 　L2Methionineγ2lyase is a multifunctional enzyme, which belongs to theγ2fam ily of pyridoxal25′2phosphate ( PLP) de2
pendent enzymes. It can catalyseα,γ2elim ination of L2Methionine and Homocysteine. L2Methionineγ2lyase was developed as an anti2
cancer drug as well as a diagnostic reagent for homocysteinem ia. The source, enzyme p roperty, genetic engineering, three2dimensional
structure, active sites and app lication of L2Methionineγ2lyase were reviewed in this paper, and the long2term potential development of
the enzymes was p rospected.
Key wo rds: 　L2Methionine γ2lyase Enzyme p roperty Genetic engineering Anticancer drug Homocysteinem ia
收稿日期 : 2009207220
作者简介 :夏立亮 (19842) ,男 ,硕士研究生 ,主要从事分子生物学方面研究 ; E2mail: liliangxia@126. com
通讯作者 :于源华 (19622) ,女 ,博士 ,教授 ,硕士生导师 ,主要从事生物化学及分子生物学方面研究
　　蛋氨酸γ2裂解酶 (L2methionineγ2lyase, EC4. 4.
1. 11)简称 MGL,是一种磷酸吡哆醛依赖酶 ,属于γ2
蛋白家族。它能催化 L2蛋氨酸及其衍生物的α,γ2
消除反应及γ2取代反应 ,催化 L2半胱氨酸及其衍生
物的α,β2消除反应及β2取代反应 [ 1, 2 ]。MGL在生
物体内含硫氨基酸的代谢中发挥重要作用 ,并被开
发成为新型抗肿瘤药物及同型半胱氨酸血症的诊断
试剂 ,其作用机理及在治疗上的潜在应用价值引起
了人们的极大关注。
1 蛋氨酸γ2裂解酶的来源及其酶学性质
对 MGL的研究已经有 30多年。这类酶在磷酸
吡哆醛存在时可以催化 L2蛋氨酸的α,γ2裂解反应 ,
生成α2丁酮酸 ,甲硫醇和氨。催化此类反应的酶最
早发现于大肠杆菌 ,并将它命名为蛋氨酸裂解酶
(Methionine lyase) [ 3 ] ,如今将它命名为蛋氨酸γ2裂
解酶并在多种生物中发现 MGL,如细菌类 Pseudo2 m onas pu tida[ 1 ] , A erom onas sp. [ 2 ] , C itrobacter freun2d ii[ 4 ] , B revibacterium linens[ 5 ] , Porphyrom onas gingival2is[6 ] , Treponem a denticola[7 ] ; 原虫类包括 Trichom onasvag ina lis[ 8 ]和 Entam oeba h istoly tica[ 9 ] ,以及植物 A ra2bidopsis tha liana[ 10 ]等。对 MGL的研究 ,最初只限于从微生物中发现此类酶并通过提取纯化来研究酶的酶学特征。通过比较发现 ,虽然不同来源 MGL的性质有所差异并对底物的特异性有所不同 (表 1,表 2) ,但它们有一些共性 :分子量大都在 170 kD左右 ,由 4个分子量大小在40～48 kD的同型亚基组成 ;具有磷酸吡哆醛依赖性 ,蛋白的紫外吸收除了在 280 nm有吸收峰外还会在420 nm处出现一个特征峰 ;所有酶均可作用于 L2蛋氨酸及其衍生物 ;当与羟胺作用时 ,MGL会脱掉与之结合的磷酸吡哆醛 ,羰基及硫醇类试剂会影响酶的活性 ,自杀性底物 DL2炔丙基甘氨酸会完全抑制其活性。
2009年第 10期 夏立亮等 : L2蛋氨酸γ2裂解酶的研究进展
2 蛋氨酸γ2裂解酶基因的克隆与表达
天然来源的 MGL由于受产酶条件及产酶水平
的影响 ,而限制了在实验研究及商业化生产中的有
效应用 ,因此对 MGL的异源表达成为研究的热点。
迄今为止已对多种来源的 MGL进行克隆表达 (表
3) ,其中对 Trichom onas vag ina lis ( T. vag ina lis)和
Pseudom onas pu tida ( P. pu tida ) 中 MGL 研究最为
全面。
表 1 不同来源蛋氨酸γ2裂解酶的酶学性质
来源 单体分子量 ( kD) 最适 pH 最适温度 (℃) 辅酶因子 紫外吸收峰 ( nm)
　　Pseudom onas ovalis 　40～48 　6. 0～10. 0 — PLP 278 420
　　A erom onas sp. 　41 　8. 0 70 PLP 278 423
　　B revibacterium linens 　43 　6. 0～8. 0 25 PLP 280 420
　　Trichom onas vaginalis 　43～45 　7. 5～8. 0 20 PLP 279 420
　　Entam oeba histolytica 　43 　7. 0～7. 6 — PLP 278 420
表 2　不同来源的蛋氨酸γ2裂解酶的底物特异性
底物
相对活性 ( % )
A tMGL PpMGL TvMGL B lMGL A sMGL
L2Methionine 100 100 100 100 100
L2Ethionine 313 — 144 111 82
DL2Homocysteine 209 338 903 134 191
L2Cystine 33 — 108 0 —
S2Adenosyl2L2methionine 30 108 830 7 —
L2Methionine sulfone 19 — 296 45 29
L2Methionine sulfoxide 14 19 86 42 26
L2Cystathionine 11 13 — 0 4
O2Acetyl2L2serine 9 — — 18 28
D2Methionine 3 0 — 0 0
L2Cysteine 3 — 99 2 22
　A t =A rabidopsis tha liana Pp = Pseudom onas putida Tv = Trichom onas vaginalis　B l =B revibacterium linens A s =A erom onas sp.
表 3 不同来源的蛋氨酸γ2裂解酶基因的克隆与表达
来源 基因大小 ( bp) 酶大小 ( kD) 表达量 收率 (或产量 )
P. gingiva lis 1 200 43. 3 — 1. 2 mg/L
P. putida 1 197 42. 6 10%细胞可溶性蛋白 > 60% 1 g/L
43%细胞可溶性蛋白 41% 0. 9 g/L
T. vaginalis 1 191 43 6% 细胞可溶性蛋白 58% 1. 1 g/L
A. thaliana 1 326 48 — —
C. freundii 1 194 43 20%细胞可溶性蛋白 36%
　P. gingivalis = Porphyrom onas gingiva lis P. putida = Pseudom onas putida T. vaginalis = Trichom onas vaginalis A. tha liana =A rabidopsis tha liana
C. freundii = C itrobacter freundii
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　　Amanda等 [ 11 ]对 T. vag ina lis中编码 MGL的基
因进行报道。在阴道毛滴虫中分离出两种编码
MGL的基因 m gl1和 m gl2 ,二者均为单拷贝。推测
m gl1可编码 396个氨基酸 ,蛋白分子量为 42. 9 kD,
m gl2可编码 398个氨基酸 ,蛋白分子量为 43. 1 kD。
氨基酸序列比较发现二者的同源性为 69% ,与 P.
pu tida中 MGL同源性为 44% ～45%。对酶的活性
分析发现二者对蛋氨酸、同型半胱氨酸、半胱氨酸和
O2乙酰丝氨酸都有活性 ,但活性不同。在国内 ,马
百坤等 [ 12, 13 ]从阴道毛滴虫克隆出 MGL 的 1 191 bp
基因 ,与国外报道序列相比有 4个碱基不同 ,两处氨
基酸发生变化 ,将其进行重组表达 ,得到 68 kD高浓
度的 GST融合蛋白 ,为进一步研究 MGL的抗肿瘤
作用奠定了基础。
Inoue等 [ 14 ]对 P. pu tida MGL的基因结构进行
分析 ,并进行了重组表达 ,重组蛋白由 398个氨基酸
组成 ,亚基分子量为 42. 6 kD ,但表达量较低。Tan
等 [ 15 ]采用 pT727表达载体在大肠杆菌中进行表达 ,
获得了高稳定性 ,低内毒素的纯品酶 ,但表达量低 ,目
的蛋白仅占总可溶性蛋白的 10%。Hori等 [ 16 ]也对其
进行了重组表达并进行酶活性分析和抗肿瘤试验 ,但
其所得的基因序列和蛋白序列与 Inoue所报到的序
列和天然酶的序列有很大不同 , 74个氨基酸 (8. 5% )
发生改变。Tanaka等 [ 17 ]为了大量生产重组 MGL满
足临床需要 ,通过优化启动子及 SD序列与 ATG之间
的碱基数目来构建高效表达载体 ,表达后所获得的目
的蛋白占总可溶性蛋白的 43% ,通过大量结晶法探
索适合工业大生产的条件 ,经纯化后总产率达到
41%。MGL的异源表达提供了大量纯品酶 ,为其性
质及应用的研究提供了必要保障。
3 蛋氨酸γ2裂解酶的空间结构
通过对 MGL同源氨基酸序列分析发现 ,在 P.
pu tida的 208～211位序列中含有 S2X2X2K模体 ,并
在γ2亚家族 PLP辅酶氨基序列中高度保守 [18 ]。PLP
可以通过 Lys211的 e2氨基基团与 MGL共价结合 ,
Tyr59与相邻亚基的 A rg61在γ2亚家族 PLP依赖酶
氨基序列中高度保守 ,可与 PLP的磷酸基团结合。
Kudou等 [ 19 ]在 1. 8! 分辨率下获得 P. pu tida MGL
的三维空间图像 ,并由此得出酶的单体亚基在空间
和功能上可分为 3个不同区域 : ①N2端延伸区域
(1～63位残基 ) ,含有 2个 α2螺旋和 3个 β2折叠。
②PLP结合域 (64～262位残基 ) ,含有 9个α2螺旋
和 7个β2折叠 ,二者交替排列。③C2端区域 (263～
398位残基 ) ,含有 4个α2螺旋和 5个β2折叠。两个
单体亚基可以聚合成有活性的二聚体 ,两个二聚体
对称结合在一起形成同型四亚基聚合体酶 ,四聚体
的形成不仅可以增加酶的稳定性 ,便于酶与 PLP结
合 ,还可以形成 4个活性位点。
分子生物学的应用为研究 MGL保守氨基酸残
基的作用提供了有效手段。通过对酶的活性位点分
析发现 , P. pu tida MGL中位于相同亚基的 Lys240,
A sp241, A rg61和相邻亚基的 Tyr114, Cys116可在酶
的活性位点上形成很多氢键 ,推测其在底物结合上
发挥重要作用 ,其中 Tyr114具有高度保守性。 Inoue[21 ]
通过点突变技术证实其在 MGL的γ2消除反应中起
到重要作用。而 Cys116存在于 P. pu tida和 T. vag i2
na lis氨基酸序列中 ,分别通过饱和诱变和点突变技
术证实其在 γ2消除反应和底物特异性中起到重要
作用 [ 13～22 ]。
图 1　Pseudom onas pu tida蛋氨酸γ2裂解酶活性
位点图形的 CPK模型 [ 21]
不同来源的 MGL所含氨基酸个数在 389～425
之间 ,通过空间结构比较发现 ,在结构域划分和亚基
组合与 P. pu tida MGL相似 [ 20 ] ,并且在 PLP结合域
和 C2端区域具有很高的同源性 , N2端区域的同源性
较低。负责与辅酶因子结合的残基 Tyr59, A rg61,
Gly89和 A sp186以及与催化相关的 Tyr114, Lys211,
A rg375在各种 MGL中高度保守。N2端区域在 MGL
活性酶体的形成及底物的识别发挥重要作用 ,不同
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2009年第 10期 夏立亮等 : L2蛋氨酸γ2裂解酶的研究进展
来源 MGL N2端区域的变化对酶在活性及底物特异
性差异方面产生影响。空间结构的获得有助于加深
对酶结构性质的了解 ,可以加快 MGL的应用研究。
4　蛋氨酸γ2裂解酶的应用
MGL具有多种功能 ,它能催化 L2蛋氨酸及同型
半胱氨酸的α,γ2裂解反应 ,被应用于肿瘤治疗及同
型半胱氨酸血症的诊断。另外 ,它在原虫体内含硫
氨基酸的代谢中发挥重要作用 ,可以其为靶位开发
抗寄生虫药物。
4. 1　抗肿瘤药物
许多人类癌细胞株和动物肿瘤异种移植模型实
验证明 ,肿瘤细胞生长所需要蛋氨酸的最低水平较
正常细胞增高 [ 22 ] ,即由于癌细胞比正常细胞转甲基
化强度增加导致蛋氨酸依赖性 [ 23, 24 ]。细胞培养研
究表明 ,缺乏蛋氨酸可通过抑制细胞循环中 S/G2
期的主要途径而抑制肿瘤细胞的生长 ,最终导致肿
瘤细胞的凋亡 [ 25 ]。蛋氨酸饥饿疗法可以增强抗肿
瘤化学药物的疗效 ,延长患肿瘤动物的存活时
间 , [26～28 ]。然而 ,与此同时发现 ,饮食蛋氨酸缺乏并
不能完全去除血浆中的蛋氨酸 ,因此不能完全阻止
癌细胞的生长。
MGL可以催化 L2蛋氨酸的 α,γ2裂解反应 ,生
成α2丁酮酸 ,甲硫醇和氨 ,有效降低蛋氨酸浓度。
体外细胞培养试验及动物体内试验证明重组 MGL
对肺癌、结肠癌、肾癌、脑癌、前列腺癌、黑素瘤、纤维
肉瘤等蛋氨酸依赖性肿瘤具有抗肿瘤作用 [ 29～31 ] ,与
52氟尿嘧啶及顺铂等抗肿瘤化学药物联用具有协同
作用 [ 32, 33 ]。通过 Ⅰ期临床试验 ,证明其用于临床的
安全性和可靠性 [ 34 ]。在国内 ,厉保秋等 [ 35 ]探索了
重组 MGL在猕猴体内的药动学、免疫原性及系统毒
性 ,系统研究表明 ,重组 MGL在猕猴模型中能有效
地降低血浆中蛋氨酸水平 ,出现的系统毒性反应很
小。与传统化疗方法相比 ,蛋氨酸裂解酶作为新型
抗肿瘤药物具有肿瘤特异性高 ,毒副作用小等特点 ,
显示出巨大的临床应用潜力。
4. 2　同型半胱氨酸血症诊断
六七十年代 ,McCully[ 36, 37 ]从病理上发现同型半
胱氨酸尿症和胱硫醚尿症患者早期即可发生全身动
脉粥样硬化和血栓形成 ,并通过动物模型证实同型
半胱氨酸血中蓄积可导致类似血管损害 ,现在人们
普遍认为高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化和冠
心病的一个独立危险因素 [ 38, 39 ]。MGL可以催化同
型半胱氨酸分解为α2丁酮酸 ,硫化氢和氨 ,分解产
物硫化氢与适当显色剂作用 ,然后利用分光光度法
检测即可计算出血浆中同型半胱氨酸含量。Chan
等 [ 40 ]利用此原理建立了重组蛋氨酸裂解酶检测同
型半胱氨酸含量的方法 ,与其他方法相比具有简单、
快速、灵敏的特点。台湾台塑集团已经开发出此类
商品诊断试剂盒并用于临床检测。
4. 3　开发抗寄生虫药物
含硫氨基酸的代谢对维持机体生物活性至关重
要 ,对于阴道毛滴虫和痢疾阿米巴 ,维持一定的胞外
半胱氨酸活性 ,对其生长 ,粘附和抗氧化保护具有重
要的意义。研究发现原虫类寄生虫阴道毛滴虫和痢
疾阿米巴体内含硫氨基酸代谢方式与哺乳动物著不
同 [ 41 ] ,其体内蛋氨酸和同型半胱氨酸通过重组
MGL降解 ,而此酶在其宿主中并不存在。因此 ,通
过对阴道毛滴虫和痢疾阿米巴含硫氨基酸特殊代谢
途径的了解及对重组 MGL功能、结构等方面的深入
研究 ,可以以 MGL作为靶位寻找其抑制性因子 ,从
而实现对阴道毛滴虫和痢疾阿米巴等寄生虫的治疗
目的。
5 结语
MGL是一种重要的医药用酶 ,在肿瘤治疗、同
型半胱氨酸血症临床诊断及开发抗寄生虫药物上具
有非常广泛的应用前景。虽然已经对多种不同来源
的 MGL进行原核表达 ,但商业化的酶仅限于几种 ,
如 Pseudom onas pu tida和 Trichom onas vag ina lis,国外
已经将其应用于临床抗肿瘤治疗和同型半胱氨酸的
检测。原核表达过程中重组蛋白有时容易形成包涵
体 ,纯化复性后酶的活性较低 ,造成了酶的产量底 ,
同时酶的稳定性差、保存成本高也限制了其应用。
另外 ,重组 MGL的免疫原性、蛋白降解、活性残基的
氧化及丢失辅酶因子影响其在血浆中的稳定性。因
此 ,如何得到具有优良性状、适合商业化应用的
MGL对于降低酶制剂的成本和提高应用安全性具
有重要意义。
与国外相比 ,国内相应的研究才刚刚起步 ,但国
内微生物物种的多样性 ,为筛选优良产酶菌株提供
了广阔空间。近年来 ,真核表达系统因其对外源基
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
因的高效分泌表达、对外源蛋白的合适的糖基化修
饰等特点而成为合成更适合医药用酶的理想的微生
物细胞工厂 ,为 MGL生产提供另一条有效途径。利
用现代生物技术对酶蛋白进行分子改造 ,通过对酶
进行定向进化和化学修饰 ,可以获得稳定性更高、底
物特异性更强的 MGL。选择合适的佐剂来减小重
组 MGL的免疫原性并可实现缓控释放 ,从而达到用
药的安全性和有效性。总之 ,随着分子生物学、遗传
学和肿瘤学的发展 ,相信人们会获得品质更加优良
的 MGL,使其在临床疾病治疗和诊断取得更广泛的
应用。
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