全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
染色体步移技术研究进展
梁成真 张锐 郭三堆
(中国农业科学院生物技术研究所 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程 ,北京 100081)
　　摘 　要 : 　染色体步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。综述了近年来染色体步移技术的发展情况 ,介
绍了结合基因组文库的染色体步移技术和基于 PCR的染色体步移技术。同时总结了物理剪切法和限制性内切酶法构建亚克
隆文库的优化步骤 ,以及连接成环 PCR法、外源接头介导 PCR法和半随机引物 PCR法的原理 ,并且比较分析了他们之间的优
缺点 ,以期对实际操作起到借鉴作用。
关键词 : 　染色体步移 侧翼序列 　BAC克隆 反向 PCR 外源接头介导 PCR 半随机引物 PCR
Progress of Chromosome Walking
L iang Chengzhen Zhang Rui Guo Sandui
(B iotechnology Research Institu te, Chinese Academ y of Agricultural Sciences, N ational Key
Facility for Crop Gene Resources and Genetic Im provem ent, B eijing 100081)
　　Abs trac t: 　Chromosome walking techniques are commonly used for cloning the known flanking sequence. In this review, chromo2
some walking technologies are introduced in this years, included genom ic library techniques for chromosome walking technology and the
PCR amp lification techniques for chromosome walking. A t the same time, we establish the construction system of BAC shotgun library, as
well as the p rincip les of orbicular2ligation PCR, adap ter2mediated PCR and sem i2random p rimer PCR. After analyzing the advantages
and disadvantages of these different strategies or techniques in the same strategies, we discussed the app lication field and development
p rospect of corresponded techniques.
Key wo rds: 　Chromosome walking Flanking sequence BAC clone　 I2PCR Adap ter2mediated PCR　Sem i2random p rimer PCR
收稿日期 : 2009205207
基金项目 :农业部国家转基因重大专项“转基因抗旱耐盐碱棉花新品种培育”(2008ZX0052004)
作者简介 :梁成真 (19832) ,硕士研究生 ,研究方向为植物基因工程 ; Tel: 010282106128, E2mail: liang1983 tian@163. com
通讯作者 :郭三堆 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事植物基因工程研究 ; E2mail: gsdui@mail. caas. net. cn　　染色体步移 ( chromosome walking) 是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发 ,逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目标序列的方法 [ 1 ]。对于已经完成基因组测序的模式生物种 (如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等 ) ,可以从数据库中轻松的找到已知序列的侧翼序列。但是目前为止 ,自然界中绝大多数生物基因组 DNA序列仍未知 ,要想知道一个已知区域两侧的 DNA序列 ,只能进行染色体步移。因此 ,染色体步移技术在现代分子生物学研究中占有举足轻重的地位和重要的现实意义。染色体步移技术主要有以下 5个方面的应用 :(1)鉴定 T2DNA或转座子的插入位点 ,鉴定转基因技术所导致的外源基因的插入位点 ; ( 2)根据基因的已知片段、EST或插入的转座子序列克隆目的基 因 ,分离基因的启动子及调控元件 ; (3)用于人工染色体 PAC、YAC和 BAC的片段搭接 ; ( 4)构建图位克隆中的重叠群 ; ( 5)转化标记辅助育种中的 STS或 SCAR标记等。目前 ,分离侧翼序列的染色体步移方法主要有两种 ,一是结合基因组文库为主要手段的染色体步移技术 ,构建基因组文库进行染色体步移尽管步骤比较繁琐 ,但是适于长距离步移 ,可以获得代表某一特定染色体的较长连续区段的重叠基因组克隆群。随着亚克隆文库条件构建条件的优化及测序技术的进步 ,这种方法也将更加快捷 ,准确。另一个是基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术。基于PCR扩增为主要手段的染色体步移技术步移距离相对较短 ,但是操作比较简单 ,尤其适合于已知一段
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
核苷酸序列的情况下进行的染色体步移。在此基础
上人们相继发明了十几种侧翼序列克隆的方法 ,依
据其技术原理 ,可以将这些方法分为 3类 :连接成环
PCR、外源接头介导 PCR和半随机引物 PCR。本文
结合实验室长期对棉花基因克隆的研究 ,简要介绍
了以上染色体步移技术的原理 ,并分析比较各自优
缺点 ,指出各技术的应用潜力和主要领域 ,以期为相
关的研究工作提供参考。
1 结合基因组文库的染色体步移技术
基因组文库是指生物体全部 DNA ,经过合适的
核酸内切酶消化或机械切割以后 ,克隆到适当的载
体分子中 ,构成重组体分子群体 ,然后转化给诸如大
肠杆菌这样的寄主菌株进行复制繁殖 ,如此构建的
理论上含有生物体整个基因组全部遗传信息的克隆
集合体 ,称作基因组文库 ,它是进行基因组学研究的
重要技术平台 ,在基因组物理图谱的构建以及基因
的图位克隆中发挥了重要作用。基因组文库的种类
主要有λ噬菌体文库、酵母人工染色体文库 ( yeast
artificial chromosome, YAC)、P1噬菌体文库和细菌
人工染色体文库 ( bacterial artificial chromosome, BAC)
等。其中 , BAC文库因其插入片段大、嵌合率低、遗
传稳定性好、易于操作等优点而备受青睐 ,近年来 ,
小麦、棉花、水稻等越来越多的物种构建了 BAC文
库 [ 2～4 ]。在水稻、棉花等作物中 ,不同的研究者构建
了不同品种的 BAC文库 [ 5, 6 ] ,含有特殊基因的品种
构建的 BAC文库对于克隆某些特殊功能基因是非
常必要的 ,如抗病虫害基因 ,逆境相关基因 ,生殖发
育相关基因等。
结合精细定位的染色体步移技术通常用来确定
在 DNA大分子中各基因的相关位置 ,并克隆目的基
因。在基因克隆中 ,该方法用于鉴定一系列彼此重
叠的 DNA限制片段 ,分离序列及表达产物未知的基
因 ,特别是发育相关的基因。利用基因组文库克隆
目的基因 ,首先要有一个根据目的基因建立起来的
遗传分离群体 ,找到与目的基因紧密连锁的分子标
记 ,然后用遗传作图将目的基因定位在染色体的特定
位置 ,找到与目的基因紧密连锁的分子标记。构建含
有插入大片段 DNA的基因组文库 (BAC或 YAC) ,以
与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库 ,
鉴定出分子标记所在的大片段克隆 ,再以该克隆为染
色体步移的起点 ,用外侧克隆末端作为探针筛选基因
组文库 ,分离新的重叠克隆用获得的阳性克隆 ,多次
重复上述步骤 ,逐渐逼近目的基因 ,构建目的基因区
域的重叠群。随后通过亚克隆文库获得含有目的基
因的小片段克隆 ,最后通过遗传转化和功能互补验证
最终确定目的基因的碱基序列。
目前构建亚克隆文库比较常用的 DNA片段化
方法主要有两种 :物理剪切法和限制性内切酶法。
111　物理剪切法构建亚克隆文库
将大片段的 BAC DNA通过物理方法变成目标
大小的小片段 ,可以用超声波处理 ,也可以用 DNA
片段剪切仪。传统的超声波处理方法具有操作简
单 ,快速的优点 ,但是不同的超声波具有不同的性
能 ,需要摸索最佳的处理条件才能达到理想的效果。
然而利用 DNA片段剪切仪 ,通过调节剪切头中注
射器上下移动的速度来控制目标片段剪切的程
度 ,具有目标片段集中、方便、稳定性高的优点。张俊
成等 [ 7 ]利用 DNA片段剪切仪片段化 BAC DNA成功
构建了 10个小麦 BAC shotgun文库并完成了测序
工作。物理剪切法构建大片段 DNA亚克隆文库 ,
优点是对于具有复杂二级结构的大片段 BAC DNA
可以通过构建高覆盖率的亚克隆文库获得完整的
核苷酸序列 ,缺点是需要提取高质量 BAC DNA、步
骤繁琐 ,剪切后的限制性片段与载体连接一般要
求过夜 ,所需时间较长 ,且技术要求高 ,成本较高。
1. 2 限制性内切酶法构建亚克隆文库
末端半补齐 (partial2filling)原是为某些不相容的
酶切末端能彼此连接而设计的一项技术。Zabarosky
等 [ 9 ]首先将其应用于以噬菌体为载体的基因文库
构建中 ,以后逐渐有人将这一技术应用于以质粒为
载体的基因文库构建中 ,使文库转化子中重组子的
比例由单酶切连接的 10%提高到 70%以上 [ 8 ] ,极大
减小了文库筛选的工作量。洪杨等 [ 8 ]在构建地衣
芽孢杆菌 2709基因文库以及从中筛选 2 709碱性
蛋白酶基因的工作中 ,应用末端半补齐技术取代了
常用的碱性磷酸脂酶法。首先利用限制性内切酶
Sau3AⅠ对制备的 2709染色体 DNA做部分酶切 ,回
收 2～9 kb的片段 ,并用 dA TP、dGTP由大片段酶将
末端 5′2GA TC23′补上两个碱基 ,但仍留有两个碱基
的 5′突出末端 ( 5′GA3′) ,文库载体 pUC18则用 Sal
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2009年第 10期 梁成真等 :染色体步移技术研究进展
Ⅰ酶切后用 dCTP、dTTP由大片段酶做末端半补齐 ,
相连接后转化宿主菌 (图 1) ,共获得 3 ×104个转化
子 ,插入片段大小分布在 2～7 kb之间 ,重组子高达
70%以上 ,并且从所构建的文库中成功筛选到 2709
碱性蛋白酶的编码基因。
图 1　采用末端半补齐技术构建 BAC质粒亚克隆文库流程图 [ 8]
在亚克隆文库的构建方面引入末端半补齐技
术 ,彻底消除了载体自环化的可能性 ,只有在相应的
外源片段插入后 ,才能形成环化产物 ,因此极大提高
了连接产物中重组质粒的比例 ,使组成基因文库的
总转化子数目大大减少 ,减轻文库筛选的工作量 ;而
且经末端半补齐的插入片段其自身末端也失去了彼
此间退火的能力 ,因而消除了插入片段自身相互连接
的可能性 ,保证了基因文库中克隆基因的真实性。同
传统碱性磷酸酯酶法相比较 ,采用半补齐技术处理的
连接产物为完整的共价闭环质粒 ,不象碱性磷酸酯酶
法那样留有缺口 ,因而半补齐法的连接产物转化率不
受影响 ;而且在技术操作上半补齐法并不比碱性磷酸
酯酶法复杂。当然 ,通过末端半补齐得到的连接产
物 ,其连接处的酶切位点一般均被破坏 ,但是这一缺
点对于构建基因文库并不构成特别的影响。
2 基于 PCR技术的染色体步移技术
PCR技术自发明以来 ,发展突飞猛进 , Ochman
等 [ 10 ]在此基础上发明了反向 PCR,并首次应用于基
因组染色体步移。自此以后的 20年中 ,先后有十几
种扩增未知序列的染色体步移方法的报道。这些方
法都有独特的技术特点以及特定的应用环境 ,但根
据其技术原理 ,这些方法体现了 3种主要的策略 :连
接成环 PCR策略 ,外源接头介导 PCR策略和半随
即引物 PCR策略。
2. 1 连接成环 PCR策略
反向 PCR ( Inverse2PCR, I2PCR ) 是连接成环
PCR策略最为典型的代表 ,是 Triglia等 [ 11 ]在常规
PCR基础上提出的扩增位于靶 DNA区段两侧未知
序列的一种 PCR方法 ,此法选择的引物虽与已知
DNA序列互补 ,但是引物延伸的方向与常规 PCR相
反 (图 2)。反向 PCR成功与否的关键在于限制性
片段分子内成环的效率 ,选择一个已知序列中没有
的限制性内切酶对 DNA进行酶切 ,用连接酶将限制
性片段自身环化做模板 ,根据已知序列末端设计反
向引物进行 PCR,即可获得两侧未知核苷酸序列。
反向 PCR成败的影响因素主要有两个方面 : ( 1)分
子间连接形成大量的线状串联体会导致非特异扩
增 ; (2)酶切片段过长将导致扩增效率下降 ,因此优
化连接反应体系尤为重要。以反向 PCR为代表的
连接成环 PCR策略是历史上第一次利用 PCR技术
进行染色体步移 ,在此基础上洪宇植等 [ 12 ]利用改进
的长距离反向 PCR (LD2IPCR )成功获得了漆酶
L acA基因上下游 9 kb的序列序列信息 ,冯丽等 [ 13 ]
利用改进的互补末端连接反向 PCR ( CEL I2PCR )获
得棉花中两个紧密连锁的生殖器官发育相关基因。
尽管 I2PCR应用不多 ,但它却是利用 PCR进行染色体步
移的一块基石 ,从此以后各种新方法大量涌现。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
图 2　 I2PCR原理示意图
2. 2 外源接头介导 PCR策略
外源接头介导 PCR策略是在包含待分离侧翼序
列区域的限制性片段外侧连接载体或接头 ,和原片段
一起构成一个序列“已知—未知—已知 ”的结构 ,根
据两侧的已知序列设计引物 ,就可以扩增得到中间未
知的序列。接头可以是双链也可以是单链 ,所连接的
载体或接头不同 ,试验程序也存在较大差异。
2. 2. 1 连接载体的 PCR 连接载体的 PCR是利
用已知基因组 DNA序列设计的特异引物和载体通
用引物进行扩增获得目的片段的一项 PCR 技术。
Shyamala等 [ 14 ]利用单特异引物 PCR ( single specific
p rimer PCR, SSP2PCR)以小鼠伤寒杆菌组氨酸转运
操纵子为起点成功的进行了连续步移。以 M13mp18RF
DNA为载体 ,用 PstⅠ和 A raⅠ酶切基因组 DNA, Pst
Ⅰ和 Xm aⅠ酶切载体 DNA,然后连接酶切后的基因
组片段和载体片段作模板进行 PCR扩增。由于非
特异片段没有特异引物结合位点 ,因此 ,连接了非特
异片段的载体不能得到大量扩增 ,而使特异片段得
到有效扩增。 SSP2PCR方法原理简单 ,试验设计简
单 ,尤其适合于保存有 cDNA或基因组文库的实验
室 ,但是其操作较繁琐 ,特异性较低 ,产物仍需进行
进一步的鉴定。
2. 2. 2 连接单链接头的 PCR 锅柄 PCR ( pan2
handle PCR, P2PCR)是连接单链接头 PCR的典型代
表 ,因其以一个类似锅柄结构的 DNA分子为模板而
得名。Jones等 [ 15 ]率先报道了这一分离侧翼序列的
方法 ,其基本原理见图 3。P2PCR中需要 3个根据
已知序列设计的引物 , 3个引物在已知序列内呈线
性排列 ,其中第 3个引物可以作为接头使用 ,与已知
序列互补配对形成单链模板。其过程为 :首先选择
合适的内切酶酶切 DNA,产生 5′或 3′粘性末端 ,然
后在片段的末端连接上含有 3′自由端的单链寡核
苷酸链 ,其具有两个特点 :一是 5′端和限制性片段
的突出末端互补 ,二是 3′自由端与已知序列中的部
分片段完全反向互补 ,连接好以后最好用核酸外切
酶 Ⅰ除去多余的接头 ,在 Taq DNA 聚合酶的作用
下 ,沿着 3′端单链部分完全补平 ,含有连接片段的单
链 DNA在合适的温度下自身退火形成一个含有锅柄
结构的环 ,然后线性排列的 3个单引物进行 3次 PCR
扩增 ,即可获得未知序列片段。Jones等 [ 16 ]将 P2PCR
做了一步的改进 ,他们在形成 panhandle结构之前在
3′末端连上了 ddCTP,使引物错配的机率减少 ,从而
使特异性增加 ,他们利用此法从人类基因组 DNA扩
增得到 4～9 kb的大片段未知序列。
图 3　Panhandle PCR原理示意图 [ 15]
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2009年第 10期 梁成真等 :染色体步移技术研究进展
2. 2. 3　连接双链接头 PCR 双链接头法也称为
adap ter介导的 PCR法 [ 17 ]。其主要过程为首先用能
够产生粘性末端的限制性内切酶消化基因组 DNA,
然后将末端配对的接头和限制性片段连接 ,以其作
模板 ,用接头引物和已知序列特异引物进行 PCR扩
增 ,即可获得包含侧翼序列的目标片段。然而在研
究基因组复杂的物种时 ,针对如何抑制接头到接头
的非目标扩增的问题 ,众多研究者进行了大量的研
究 ,将这一技术不断改进 ,使其扩增效率更高 ,特异
性更好。
R iley等 [ 18 ]则设计了一种特殊的被称为 Vector2
ette的接头 ,由于接头引物是与中间错配区的一条
链的序列完全一致的 ,因此避免了从接头到接头的
非特异扩增 ,而由于中间有一段序列不配对而形成
泡泡型 ,所以这种 PCR也称为泡泡 PCR。Rosenthal
等 [ 19 ]设计了捕捉 PCR (Cap ture PCR ) ,由于这一技
术在 PCR中特异引物上增加了有利于选择特异产
物的生物素标记 ,因此可通过链霉亲和素包被的磁
珠捕捉分离带有生物素标记的单链产物 ,以其做模
板进行二次 PCR扩增大大提高了扩增的特异性。
Yan等 [ 20 ]设计了 T接头连接的方法 ( T2linker PCR )
来进行染色体步移 ,原理见图 4。 T2linker PCR的
方法最大的改进在于实现了接头和目标 DNA分子
的特异性连接 ,这种特异性连接极大的提高了 PCR
扩增的特异性和效率 ,并且不需要低退火 ,因此一次
性扩增得到的片段可以很长。由于 T接头构造简
单 ,不需要特殊修饰 ,不需要任何酶切位点 ,并且在
源头上阻断了非标表片段与接头的连接 ,提高了扩
增的产物真实性 ,因此在侧翼序列克隆方面具有良
好的效果。肖月华等 [ 21 ]则在 YADE ( Y2shaped adap2
tor dependent extension)扩增技术中采用由多种酶切
和连接产生的 DNA作模板 ,大大提高了该方法扩增
相邻序列的效率 ,实现了邻近序列的连续扩增 ,通过
2轮连续的扩增从 7种酶切连接产物中成功地获得
了 1个棉花小 GTP酶基因 ( GhR2acB )的 2 228 bp上
游序列。
图 4　T2linker PCR原理示意图 [ 20]
2. 3 半随机引物 PCR策略
早在 1991年 Parker等 [ 22 ]就提出目标基因步行
PCR ( targeted gene walking PCR ) , 1993 年 Sarkar
等 [ 23 ]又报道了限制位点 PCR ( restriction2site PCR) , 其策略都是通过设计一批随机引物和已知序列的特意引物组合扩增已知序列的侧翼序列 ,和前两种策略相比较 ,半随机引物 PCR减少了酶切、连接等繁琐的试验操作。但是长期以来由随机引物引发的非
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
特异性扩增无法有效的得以控制 ,所以一直没有被
广泛应用。近年来 ,随着研究的不断深入 ,新 A lu2
PCR法、DW 2ACPTM PCR法 (DNA W alking2Annealing
Control PrimerTM ,即复性控制引物的 DNA 步行法 )
和 TA IL2PCR法 ( thermal asymmetric interlaced PCR,
即热不对称交错 PCR )等新的方法相继问世 ,很大
程度地降低了非特异扩增。
2. 3. 1　新 A lu2PCR A lu因子是分散于人类基因组
中的短片段保守序列 ,平均大约每 4 kb的碱基出现
一次 [ 24, 25 ] ,研究者利用这一规律 ,发明了 A lu2PCR,
从而较容易得从非人类基因组的背景中扩增人类基
因组序列 [ 26 ]。新 A lu2PCR则是根据已知序列或是
外源插入序列与 A lu保守序列设计引物 ,扩增所需的
未知侧翼序列。尽管 A lu因子序列保守 ,但其在人类
基因组中的分布却是具有位点随机性 ,为了降低两个
A lu因子之间引发的非目的扩增 ,需要采取两个措
施 :一是在 PCR扩增中使用不对称引物浓度 ;二是在
A lu因子引物的合成时用 dUTP进行修饰 ,这种引物
在扩增 10个循环后被尿嘧啶脱氧核糖基酶 (UDG)破
坏 ,从而阻止 A lu因子引物的单引物扩增。此外 , A lu
因子若能够被其它物种中的同类物型的分散保守序
列所取代 ,则可以扩大其应用领域 [ 27 ]。
2. 3. 2　DW 2ACPTM PCR DW 2ACPTM PCR的核心
是在随机引物设计中采用了复性控制引物 ,从而有
效地控制了引物的非特异性结合。复性控制引物有
3部分组成 : 3′端目标核心序列、调节子和 5′端非目
标尾部序列 (图 5)。目标核心序列能够和待扩增区
域的某一部位特异结合 ,但位置随机 ,非目标尾部序
列主要起到调节整条引物 Tm值得作用 ,调节因子
是其中关键部分 ,是由一段多聚脱氧次黄嘌呤核苷
酸 [ poly ( d I) ]构成。poly ( d I)能够和所有的核苷酸
配对 ,但配对是的氢键作用比正常的 A2T、G2C弱 ,
因而具有很低的 Tm 值。通过调解复性温度 ,在
PCR反应的第一个循环中 , ACPTM在和模板 DNA作
用时 ,中间的 [ poly ( d I) ]能形成一个气泡状的结构 ,
它能够促进目标核心序列与模板特异性结合而抑制
非目标尾部序列与模板的非特异性结合 ,从而阻碍
了非特异性产物扩增。随后由于特异引物 1的延
伸。构成了完整的 DW 2ACP引物的模板 , DW 2ACP
引物可以完全退火进行扩增 ,然后使用 DW 2ACP引
物 5′端的通用引物及特异性引物 2进行巢式 PCR,
即可以得到大量的特异产物 ,且有效的抑制了非特
异性产物产生 [ 29, 30 ]。
图 5　ACPTM的结构图及其与模板的
作用方式 [ 1]
2. 3. 3 热不对称交错 PCR　热不对称交错 PCR由
L iu和 W hitter首先研究并报道 [ 31 ] ,其基本原理是利
用目标序列旁的已知序列设计 3个嵌套的特异引物
( special p rimer, sp1, sp2, sp3,约 20 bp) ,用它们分别
和 1个具有低 Tm值的短的 ( 14 bp )随机简并引物
( arbitrary degenerate p rimer, AD )相结合 ,根据引物
的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环 ,通
过分级反应来扩增特异产物。
TA IL2PCR一般分为 3次反应 (图 6 )。 TA IL2
PCR技术的应用克服了环状 PCR、接头 PCR等方法
中酶切、连接、加尾等一些列繁琐的操作 ,能够快速
地分离到目标序列 ,对基因克隆研究具有重要的意
义。TA IL2PCR技术简单、高效、灵敏、快速、特异性
高、反应产物准确可靠、重复性好 ,因此深受广大科
研工作者的喜爱。目前已有成功地从 P1、YAC和
BAC中克隆分离获得插入末端的 DNA序列和拟南
芥的 T2DNA 侧翼序列的报道 [ 31～33 ]。此外 , L iu
等 [ 31 ]在原有 TA IL2PCR基础上对随机引物做了进
一步改进 ,使扩增片段的特异性高达 90% ,扩增片
段大小在 1～3 kb的片段。TA IL2PCR 技术不但能
够用于基因组小的物种如拟南芥 [ 20, 34 ]、水稻 [ 35, 36 ] ,
近年来在一些基因组较大的物种 ,如银杏 [ 37 ]、苦
瓜 [ 38 ]中也相继有侧翼序列分离成功的报道。上述
优点使 TA IL2PCR技术成为分子生物学研究中的一
种强大工具。
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2009年第 10期 梁成真等 :染色体步移技术研究进展
图 6　TA IL 2PCR原理示意图
3　讨论和展望
以上介绍的几种方法基本上代表了现有的染色
体步移技术 ,根据其特点及试验材料的要求 ,选择恰
当的方法是必须考虑的 ,因此对以上几种方法进行
综合比较 (表 1)。
结合基因组文库的染色体步移技术是在 PCR技
术发明以前分离侧翼序列的惟一方法 ,目前仍然为广
大科研工作者所采用 ,其最突出的优点在于步移距离
较长、速度较快 ,可进行连续步移弄清跨度为数百个
千碱基 ( kb)的连接片段 ;同时 ,可以一次性获得数个
包括启动区 ,调控区等在内的完整的基因的核苷酸序
列信息 ,适用于遗传背景不是很清楚的情况下通过分
子标记克隆未知新基因以及具有高度重复序列或具
有复杂结构的核苷酸片段的染色体步移等。但是由
于需要构建基因组文库 ,过程繁琐 ,工程浩大 ,费时费
力 ,且成本较高 ,因此对于近距离单基因的染色体步
移 ,人们更倾向于利用 PCR的方法。
基于 PCR的染色体步行技术最主要的问题在
于如何从序列信息未知的条件下设计两个特异性引
物来扩增未知区域。连接成环 PCR、外源接头介导
PCR以及半随机引物 PCR代表了 3种不同的解决
策略。 I2PCR是最早应用于染色体步移的一种方
法 ,操作简单 ,一次反应能同时分离到目的片段两侧
的序列 ,但对于模板的质量和数量要求严格 ,如果存
在合适的酶切位点 ,优化自连体系 ,在 DNA片段相
对较小时仍然是理想的选择。外源接头介导的
PCR策略近年来应用比较多 ,尤其在 T2DNA侧翼序
列分析方面 ,但是该方法操作过程相对复杂 ,有时还
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
表 1 染色体步移方法综合比较
方法 酶切 连接 DNA 用量(μg) 限制因素 假阳性　　　　　　　 灵敏度 特异性
物理剪切法构建亚
克隆文库
不需要 是 > 500 　1. 需要大量 DNA
　2. 连接效率
　3. 费时费力
不存在 — —
限制性内切酶法构
建亚克隆文库
需要 是 > 500 　1. 需要大量 DNA
　2. 连接效率
　3. 合适酶切位点
不存在 — —
Inverse PCR 需要 是 2～5 　自身连接效率 分子间连接 低 低
Panhandle PCR 需要 是 2～5 　1. 连接效率
　2. 形成环状的条件
来自特异性的单引物
扩增
中等 中等
Vectoret PCR 需要 是 1～2 　1. 连接条件
　2. 费时费力
来自特异性的单引物
扩增
中等 中等
新 A lu2PCR 不需要 无 2～20 　1. A lu方向和分布
　2. 特殊的重复序列
来自 A lu间的扩增 高 中等
DW 2ACPTM PCR 不需要 无 2～20 　1. 引物设计
　2. 需要 4种 ACP引物
来自 ACP引物的单引
物扩增
高 高
Tail2PCR 不需要 无 2～20 　1. 复性温度
　2. 随机引物设计
来自随机引物的单引物
扩增
高 高
需要末端加尾、去磷酸化或磷酸化等处理 ,并且扩增
长度较短 ,非特异扩增的风险较大 ,不适合大规模的
样品分析 ,但是对于同一样品进行连续步移或者多
点同时步移时 , T2linker PCR技术就成为了理想的
选择。以新 A lu2PCR 法、DW 2ACPTM PCR 和 Tail2
PCR法法为代表的半随机引物 PCR策略 ,试验步骤
简单 ,自动化程度高 ,步行距离长 ,而且扩增特异性
高 ,因此非常适合大规模的分离侧翼序列 ,尤其在大
规模分析突变体插入位点方面具有绝对的优势。但
是 ,半随机引物 PCR 也有不尽人意之处 ,比如新
A lu2PCR扩增区域包含有较短的 A lu重复序列时 ,
往往得不到目的产物 , DW 2ACPTM PCR 和 Tail2PCR
随机简并引物存在有限的结合位点 ,对于高度重复
的序列 ,即使使用不同的简并引物也难以扩增获得
阳性结果。因此 ,在实际操作中研究者往往将上述方
法中的两个或两个以上的技术联合使用 ,尤其是结合
基因组文库的染色体步移技术与结合 PCR的染色体
步移技术在试验中的联合使用 ,二者优势互补 ,实现
了长距离快速染色体步移。随着生命科学在国计民
生中重要性的不断提高 ,利用染色体步移技术克隆重
要功能的新基因也将越来越普遍 ,相信随着众多科研
工作者的不懈努力 ,染色体步移新技术将会不断涌
现 ,染色体步移也将会更加简单、快速。
参 考 文 献
1　王闵霞 ,马欣荣 ,王天山 ,等. 应用与环境生物学报 , 2006, 12
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