全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
禽类饲用芽孢杆菌的筛选及固体发酵条件优化
王振宇1 苏振成2 黄乾明1 杨日桓3 孙健2 张惠文2
(1四川农业大学生命科学与理学院，雅安 625014;2中国科学院沈阳应用生态研究所，沈阳 110016;3辽宁省畜牧经济管理站，沈阳 110032)
摘 要: 筛选得到 3 株适用作为禽类饲料添加剂的枯草芽孢杆菌，分别命名为 B395、B605 和 BM1。该 3 株菌株均能够
在 42℃正常生长，能抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，且能耐受 0 3%胆盐，能产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。通过饲喂试验，
观察到菌剂组可明显促进肉鸡生长，有效降低料肉比。选取 B395 作为试验菌株，以培养后活菌数为指标，得到其最佳固体发
酵条件为麦麸∶稻糠为 3∶ 2、葡萄糖 0 5%、尿素 2%、KH2PO40 5%，含水量 45%、接种量 5%、温度 37℃、培养时间 3 d。按上述
培养条件，对 B395 进行培养，摇瓶式发酵可使活菌数可达到(1 3 ± 0 1)× 1010 CFU /g，浅盘式发酵可使活菌数达到(1 3 －
1 4)× 1010 CFU /g;并对 B605 和 BM1 进行培养，得到活菌数均超过 109CFU /g。
关键词: 芽孢杆菌 促进生长 降低料肉比 固态发酵 浅盘式发酵
Selecting of Fowls’Feed Bacillus spp. and Optimizing
Conditions of Solid State Fermentation
Wang Zhenyu1 Su Zhencheng2 Huang Qianming1 Yang Rihuan3 Sun Jian2 Zhang Huiwen2
(1 Sichuan Agricultural University，College of Biology and Science，Ya’an 625014;
2 Institute of Applied Ecology Chinese Academy of Science，Shenyang 110016;
3Animal Husbandry Economy Station of Liaoning，Shenyang 110032)
Abstract: Three strains of Bacillus subtilis B395，B605 and BM1，with the ability to grow up at 42℃ normally，to inhibit Esche-
richia coli and Staphylococcus aureus，to tolerate bile of 0. 3%，and produce amylase，protease and cellulose，which were selected for
the fowls’feed additives. In the experimental test，the probiotics could significantly promote the growth of chickens and increase the ra-
tio of feed conversion. B395 was chosen as tested strain，and its optimal solid state fermentation conditions were wheat bran∶ rice chaff
3∶ 2，glucose 0. 5%，urea 2%，KH2PO40 5%，water content 45%，inoculum concentration 5%，37℃ and 3 d by taking the living
bacteria amount as the index. In the optimal conditions，the number of B395 was(1 3 ± 0 1)× 1010 CFU /g in flask fermentation and
(1 3 － 1 4)× 1010CFU /g in platter fermentation. The numbers of B605 and BM1 would exceed 109CFU /g under the conditions men-
tioned above.
Key words: Bacillus Promoting the growth Increase the ratio of feed conversion Solid state fermentation Fermentation with
platter
收稿日期:2010-01-11
作者简介:王振宇，男，在读硕士，研究方向:微生物方向;E-mail:wzy150618@ 163. com
通讯作者:张惠文，女，研究员，博士生导师，研究方向:分子生态学;E-mail:hwzhang@ iae. ac. cn
枯草芽孢杆菌是农业部(2006 年)规定允许
使用的饲料级微生物菌种之一，由于其具有稳定
性好、抗逆性强、能产生维生素和利于消化的酶、
可抑制病原菌繁殖、促进乳酸菌生长等优点，被广
泛应用于微生态制剂的生产中。而微生态制剂的
使用有效地替代或减少禽畜饲养中的抗生素添
加，有益于公共食品安全。微生物发酵主要分为
深层液体发酵和固态发酵［1］。20 世纪 90 年代以
来，随着能源危机和环境问题的日益严重，固体发
酵技术由于其生产工艺简易，生产效率高，能耗
低，投资少，无三废污染［2，3］，生产原料来源广泛，
越来越引起人们的关注。但是，目前采用固体发酵
2010 年第 6 期 王振宇等:禽类饲用芽孢杆菌的筛选及固体发酵条件优化
方式培养基成本较高，研究固体发酵培养芽孢杆
菌的较少，关于浅盘式发酵报道较少。本研究旨
在筛选优良的饲用芽孢杆菌，优化其固体发酵条
件，以廉价的培养基获取较高密度活菌培养物，
并进行浅盘式发酵试验，为实际生产提供技术参
考。
1 材料与方法
1 1 材料
1 1 1 主要试剂和仪器 羧甲基纤维素钠、牛胆
盐、刚果红购自上海生工，麦麸、稻糠、豆粕购自沈阳
香雪面粉股份有限公司，市售肉鸡饲料，高压灭菌锅
为上海产 ZDX-35SBI，离心机为 Eppendorf 5418，恒
温培养箱。
1 1 2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基，淀粉培养
基，酪素培养基，刚果红培养基，LB培养基。
1 1 3 菌种 大肠埃希氏菌(E. coli)、金黄色
葡萄球菌(S. aureus)为卫生部标准菌株;以及本
室保藏的 27 株芽孢杆菌，均为枯草芽孢杆菌属
或地衣芽孢杆菌属的菌株，符合农业部饲料添加
剂标准。
1 2 方法
1 2 1 菌株筛选 (1)42℃菌株生长状况试验:将
待测菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，42℃
振荡培养 24 h，观察其生长情况。(2)抑菌试验与
耐受胆盐试验:参考文献［4，5］方法。(3)产酶能力
测定:将滤纸片用待测菌液浸湿置于营养琼脂平板，
培养 1 － 2 d，观察有无透明水解圈［6］。(4)肉鸡饲
喂试验:将肉鸡随机分为空白组和菌剂组，每组 30
只肉鸡，对每组中 10 只肉鸡进行标记，每 7 天将标
记肉鸡称重 1 次，饲养时间为肉鸡孵化后至 29 日
龄。将筛选出的 3 株枯草芽孢杆菌按 1∶ 1∶ 1 混合制
备成 2 × 109 CFU /mL 芽孢，菌剂组每日每只肉鸡喂
食 1 mL。
1 2 2 固体培养条件优化 (1)固体发酵基础培
养条件的确定:选择麦麸与稻壳比例、氮源、培养
温度和含水量 4 个因素进行 L9(3
4)正交试验，确
定固体发酵基础培养条件，参考文献［7］。碳源:
麦麸与稻壳比例为 1 ∶ 1、4 ∶ 1、3 ∶ 2;氮源:豆粕粉、
蛋白胨、尿素;温度:28℃、32℃、37℃;含水量:
45%、50%、55%。培养基中添加葡萄糖 0 5%，
KH2PO40 5%，50 g 固体培养基置于 500 mL 三
角瓶中，封口膜封口，121℃灭菌 30 min。用液体
牛肉膏蛋白胨培养基过夜培养制备种子液。
(2)单因素试验:在确保已优化的其他条件不变
的情况下，分别对温度(25℃、37℃、40℃)、尿素
添加量(1%、2%、3%、4%)、接种量(5%、10%、
15%)和培养时间(2 、3、4、5 d)4 个条件进行单
因素试验，通过测定活菌数，确定培养条件。(3)
芽孢生成率检测:将发酵产物置于室温(23 －
27℃)阴凉处，分别在 10、30、60 d 取样，测定活
菌数和芽孢数。(4)浅盘式发酵:在塑料方盆中
添加固体培养基 1 kg，8 层纱布封口，培养 3 d。
并进行 3 批次培养。方盆规格:41 cm × 23 cm
× 10 cm。
1 2 3 检测方法 活菌数测定:稀释涂平板法计
数。芽孢数测定:85℃，保温 15 min，稀释平板法计
数。生长曲线测定:参考文献［6］，待测菌液按 5%
接种于 LB 液中，分别于 0、1 5、2、3、4、5、6、7、8 和
12 h取样测量菌液在 OD600下的吸光值取，每组设 3
个重复。
2 结果及分析
2 1 菌株筛选
由表 1 可知，27 株饲用芽孢杆菌，多数能在
42℃条件下正常生长，少数不能生长，B517 生长
能力较弱;B395、B396、B737、BM1 和 B605 能抑制
E coli 和金黄色葡萄球菌;B395、B605、B737、
BD1、BD3 和 BM1 能耐受 0 3%胆盐的能力;大多
能产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。其中菌株 B395、
B605 和 BM1 性能突出，均能够在 42℃正常生长，能
够抑制 E coli、金黄色葡萄球菌，能耐受 0 3%胆
盐，能产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶，可作为微生
态制剂的候选菌种。作为候选菌株需满足以下条
件:能在 42℃条件下正常生长是其能够在禽类肠
道内发挥作用的首要条件;能抑制禽畜的常见病
原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)生长，有利于提
高机体防病能力;能耐受 0 3% 胆盐是菌株发挥
益生菌作用的先决条件［8］;能产生淀粉酶、蛋白
酶、纤维素酶，有利于禽畜对饲料的消化吸收和
利用。
322
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
表 1 菌株筛选结果
菌号
42℃
生长
抑制 抑制
耐受 0 3%
胆盐
淀粉酶 蛋白酶
纤维
素酶
B381 + － － － + + +
B394 + － － － + + －
B395 + + + + + + +
B396 + + + － + + +
B383 + － － － + － －
B514 + － － － + + +
B516 － － － － + + +
B517 + － － － + + +
B602 + － + － + + +
B604 + － － － + + +
B605 + + + + + + +
B609 + － － － － + －
B733 + － － － + + +
B735 + － － － + + －
B737 + + + + + + －
BD1 + － － + + － +
BD2 + － － － + + +
BD3 + － － + + + +
BM1 + + + + + + +
BM2 + － － － + + +
BM3 + － － － + + －
BM4 + － － － + + +
BM6 + － － － + － +
BM11 + － + － + + +
BM14 + － － － + + +
BM15 － － － － + － －
BM17 － － － － + + +
+为是，－为否
由表 2 可明显观察到，从 3 周起菌剂组对促进
肉鸡生长效果明显;且在 29 日喂养期间内，菌剂组
较空白组料肉比低。
表 2 肉鸡饲喂试验结果
肉鸡日龄(d) 7 14 21 28
空白组平均体重(g) 141 380 540 775
空白组料肉比 1 1 1 25 1 49 1 62
菌剂组平均体重(g) 135 365 565 850
菌剂组料肉比 1 1 1 24 1 47 1 58
图 1 为 3 株枯草菌株 B395、B605 和 BM1 在 LB
培养基 37℃下的生长曲线，B395 和 BM1 生长速度
较快。对培养结果活菌数计数表明，培养至 8 h 时
B395、BM1 和 B605 活菌数分别为 1 51 × 109 CFU /
mL、5 7 × 108 CFU /mL 和 2 3 × 108 CFU /mL。选择
生长迅速且增殖能力较强的 B395 作为出发菌株，
进行后续固体发酵条件优化，初步确定芽孢杆菌的
固体发酵条件。
图 1 B395，B605，BM1 生长曲线
2 2 固体发酵条件优化
2 2 1 固体发酵基础条件 活菌数是检测微生态
制剂质量的重要指标。以活菌数为检测标准进行
发酵条件优化，由表3中R值可见，在固体发酵中，温
表 3 固体发酵培养条件 L9(3
4)正交试验表
温度
(℃)
含水量
(%)
麦麸∶稻壳
比例(m/m)
氮源
(2%，m/m)
活菌数平均值
(× 108CFU /g)
1 28 45 1∶ 01 豆粕粉 1 1 ± 0 2
2 28 50 4∶ 01 蛋白胨 13 9 ± 1 2
3 28 55 3∶ 02 尿素 2 5 ± 0 1
4 32 45 4∶ 01 尿素 98 ± 4
5 32 50 3∶ 02 豆粕粉 20 2 ± 1
6 32 55 1∶ 01 蛋白胨 18 7 ± 1
7 37 45 3∶ 02 蛋白胨 198 7 ± 20
8 37 50 1∶ 01 尿素 90 ± 10
9 37 55 4∶ 01 豆粕粉 53 33 ± 5
X1 5 83 99 27 36 6 24 88
X2 40 23 41 37 55 1 77 1
X3 102 47 24 84 73 8 63 5
R 96 64 74 43 37 2 52 22
422
2010 年第 6 期 王振宇等:禽类饲用芽孢杆菌的筛选及固体发酵条件优化
度(96 64℃)和含水量(74 43%)为较重要的影响
因素，而氮源(52 22)和麦麸:稻糠(37 2)次之。考
虑培养基成本因素，选用尿素作为固体发酵培养基
氮源，得到固体发酵基础培养条件为在 37℃，麦麸:
稻壳 3:2，含水量 45%，尿素 2%，葡萄糖 0 5%，KH2
PO40 5%。培养 B395，得到菌数超过 10
10 CFU /g。
并按上述条件，培养 B605 和 BM1，得到菌数均超过
109 CFU /g。
2 2 2 单因素试验 在固体发酵基础条件下，考察
培养温度、接种量、尿素添加量和发酵时间 4 个单因
素条件对发酵结果的影响，结果见表 4。可以确定
最佳条件为培养温度 37℃、尿素添加量 2%、接种量
5%、培养时间 3 d。按照优化出的条件，培养 B395
得到活菌数为(1 3 ± 0 1)× 1010 CFU /g，约为接种
量的 200 倍。
表 4 单因素试验结果
培养温度(℃) 尿素添加量(%)
25 37 40 1 0 2 0 3 0 4 0
接种量(%) 发酵时间(d)
5 10 15 2 3 4 5
活菌数
(× 109CFU /g)
3 3 ±
0 1
13 1 ±
1
2 ±
0 5
8 1 ±
0 7
12 7 ±
0 4
5 3 ±
1
0 45 ±
0 11
12 8 ±
0 34
12 9 ±
0 25
2 2 ±
0 04
4 5 ±
0 5
12 ±
0 4
11 ±
0 3
7 5 ±
1
2 2 3 芽孢生成率检测 由表 5 可知，B395 发酵产
物的芽孢生成率随放置时间延长而增加，在 30 d 时
达到 9 1 ×109 CFU/g并基本稳定。参考其他动物试
验文献［9 － 13］，每日每只动物需要饲喂 106 － 1010个芽
孢，考虑兑料稀释等因素，该芽孢数量可满足动物试
验及实际应用的需要，也可保证产品货架期的要求。
表 5 芽孢生成率检测结果
(单位:
× 1010CFU /g)
时间(d)
1 10 30 60
活菌数 1 29 ± 0 1 1 1 ± 0 15 1 01 ± 0 1 0 95 ± 0 1
芽孢数 0 3 ± 0 07 0 89 ± 0 13 0 91 ± 0 05 0 91 ± 0 05
芽孢生成率(%) 23 26 80 91 90 01 95 79
2 2 4 浅盘式发酵试验 按照上述条件进行 3 批
次浅盘式发酵，B395 活菌数可达到(1 3 － 1 4)×
1010 CFU /g。浅盘式发酵结果表明，其可比摇瓶培
养获得更多活菌。原因可能是枯草芽孢杆菌为好氧
菌，其在生长发育过程中需要消耗大量的氧气，浅盘
式发酵过程中菌株可以获得较多的氧气，有利于其
增殖。
3 结论与讨论
从本室保藏的 27 株芽孢杆菌中，筛选得到 3 株
枯草芽孢杆菌 B395、B605 和 BM1，除了能在 42℃正
常生长，能耐受 0 3%胆盐，还能抑制大肠杆菌、金
黄色葡萄球菌，可以帮助宿主抵御病原菌，并且能产
生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶帮助宿主提高消化能
力。给肉鸡喂食制备出的芽孢制剂，经过 29 d 饲
养，可明显观察到从 22 d 起，菌剂组对肉鸡有明显
促长效果，且可有效降低料肉比，有作为促长类禽类
饲料添加剂应用的潜在价值。
选择 B395 作为试验菌株，对芽孢杆菌固体发
酵条件进行初步优化。得到固体发酵条件为麦麸与
稻糠比例为 3 ∶ 2、葡萄糖 0 5%、尿素 2%、KH2 PO4
0 5%、含水量 45%、接种量 5%、培养温度 37℃、培
养 3d。摇瓶培养 B395，活菌数可达到(1 3 ± 0 1)
× 1010 CFU /g。浅盘式发酵培养 B395，得到活菌数
为(1 3 － 1 4)× 1010 CFU /g。对 B605、BM1 进行固
体发酵，得到活菌数均超过 109 CFU /g，有待后续试
验对 B605、BM1 固体发酵条件进行深入优化，以获
得更高的活菌数。针对国内关于浅盘式发酵报道较
少的情况，在本试验中，进行浅盘式发酵并得到较高
的活菌数，且采用廉价培养基，有效降低了生产成
本，为实际生产提供技术参考。在浅盘式发酵操作
过程中，要确保种子液与培养基充分混匀以及适当
调整培养基含水量，以获得更多的活菌数。如固体
培养基在灭菌后将增重约 3% － 5%，培养基的含水
量对培养结果有较大的影响，需要适当降低灭菌前
培养基含水量。另外，浅盘式发酵所用培养基数量
较大，会因灭菌不彻底而导致试验失败。因此，在实
验室对大量固体培养基灭菌时应考虑在培养基中间
放置筛网类物品，提高蒸汽接触面积，达到充分灭菌
522
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
目的。发酵产物在自然状况下放置，30 d 时的芽孢
数基本稳定并相当于放置 1 d 的活菌数的约 70%，
可以考虑在后续培养试验中添加化学药品促进芽孢
生成，相应提高芽孢生成率，从而提高效益。
固体发酵作为一种廉价的菌剂生产方式，可应
用到饲用益生菌的生产以及生物防治菌株的制备
中。试验结果表明，浅盘式发酵制备菌剂可操作性
强、整个操作流程较简单，而且其生产成本低廉、生
产方式简单、对设备要求不苛刻，适合作为农业用菌
剂的生产方式。
参 考 文 献
［1］戚以政  影响固态发酵速率的因素及其动力学  化学反应工程
与工艺，1995，11(1) :18-24.
［2］吴其飞，黄明达，陆建明，等  固态发酵新技术及反应器的研究
进展  饲料工业，2003，24(8) :43-46.
［3］张翠霞.固态发酵工程与生物饲料添加剂的生产. 徽生物学杂
志，2003，23(6) :50-51.
［4］Vinderola G，Capellini B，Villarreal F，et al. Usefulness of a set of
simple in vitro tests for the screening and identification of probiotic
candidate strains for dairy use. Food Science and Technology，2008，
41(9) :1678-1688.
［5］Vinderola CG，Reinheimer JA. Lactic acid starter and probiotic bac-
teria，a comparative“in vitro”study of probiotic characteristics and
biological barrier resistance. Food Research International，2003，36
(9-10) :895-904.
［6］沈萍，范秀荣，李广武，等. 微生物实验教程(第 3 版) ［M］. 北
京:高等教育出版社，2002:116-118，97-98.
［7］Zhao S，Hu N，Huang J，et al. High-yield spore production from
Bacillus licheniformis by solid state fermentation . Biotechnology Let-
ter，2008，30 (2) :295-29.
［8］Fuller R. Probiotics in man and animals . Journal of Applied Bacte-
riology，1989，66(5) :365-78.
［9］Cartman ST，La Ragione RM，Woodward MJ. Bacillus subtilis spores
germinate in the chicken gastrointestinal tract. Applied and Environ-
mental Microbiology，2008，74 (16) :5254-5258.
［10］Hoa TT，Duc LH，Isticato R，et al. Fate and dissemination of Ba-
cillus subtilis spores in a murine model. Applied and Environmental
Microbiology，2001，69(9) :3819-3823.
［11］Casula G，Cutting SM. Bacillus probiotics:spore germination in the
gastrointestinal tract. Applied and Environmental Microbiology，
2002，68 (5) :2344-2352.
［12］La Ragione RM，Casula G，Cutting SM，et al. Bacillus subtilis
spores competitively exclude Escherichia coli O78:K80 in poultry.
Veterinary Microbiology，2001，79(2) :133-142.
［13］Ziaei-Nejad S ，Rezaei MH，Takami GA，et al. The effect of Ba-
cillus spp. bacteria used as probiotics on digestive enzyme activity，
survival and growth in the Indian white shrimp Fenneropenaeus in-
dicus. Aquaculture，2006，252 (2-4) :516-524.
622